Snelle kwantificering van geoxideerde en gereduceerde vormen van glutathion met behulp van orthoftalaldehyde in gekweekte zoogdiercellen in vitro

OPMERKING: Het volgende protocol is ontworpen met de capaciteit om te worden gebruikt in combinatie met een bicinchoninezuur (BCA) eiwittest en een adenylaatkinase (AK) test om monsters te normaliseren naar behandelingen. Zorg ervoor dat de bediener de juiste kleding en de nodige veiligheidsuitrusting draagt, zoals een Howie-laboratoriumjas, nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril van klasse I, tijdens de voorbereiding en het gebruik van materialen. Het protocol is opgedeeld in verschillende fasen. 1. Voorbereidingen voor voorraad en werkoplossingen Bereid voorraadoplossingen van 100 mM GSH standaard in 1 mM HCl (bereid uit 37% HCl in dubbel gedestilleerd water (ddH2O)).OPMERKING: Als u verdunt met een sterk geconcentreerd zuur, zoals 37% HCl, zorg dan voor het juiste proces van het toevoegen van zuur aan water in een zuurkast van klasse I. Bereid een voorraad van 22,35 mM OPA in absolute ethanol voor. Voer deze stap uit in een zuurkast van klasse I. Bereid 25 mM N-ethylmaleimide (NEM) voor in ddH2O. Voer deze stap uit in een zuurkast van klasse I.OPMERKING: Deze drie oplossingen kunnen maximaal 3 maanden bij -20 °C worden bewaard. Bereid 0,01 M Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) voor tot een totaal volume van 500 μl, nodig voor 100 putjes. Bereid 100 μL 1 mM GSH-standaard, verdund uit 100 mM voorraad met ddH2O. Gebruik immunoprecipitatie (IP) lysisbuffer of de volgende formulering: 394 mg Tris-HCl (eindconcentratie 25 mM), 877 mg NaCl (eindconcentratie 150 mM), 29 mg EDTA (eindconcentratie 1 mM), ofwel 1 ml 100% NP-40 of IGEPAL CA-630 (eindconcentratie van 1% V/V), 5 ml glycerol (eindconcentratie 5% V/V), 84 ml ddH2O. Meng de componenten door voorzichtig te roeren en stel de pH in op 7,4. Decanteren in een maatkolf van 100 ml en voeg het resterende volume ddH2O toe om een eindvolume van 100 ml te bereiken. Steriel filtreren door een filter van 0,22 μm en maximaal 6 maanden bewaren bij 2-8 °C.OPMERKING: Lyseeroplossingen werken als een contaminant/interferent in deze test; Daarom zijn de bovenstaande formuleringen gespecificeerd. Bereid 1 L 0,1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing aangevuld met ethyleendiaminetetraazijnzuur (PBS-EDTA) bij 3 verschillende pH-waarden, namelijk 7,2, 8,5 en 9,0. Gebruik een in de handel verkrijgbare 0,1 M PBS-buffer aangevuld met 1 mM EDTA (292,24 mg/L) of de volgende 10x (1 L) formulering: 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, 800 ml ddH2O. Voeg toe en meng; Vul bij tot 1 L. Autoclaaf de oplossing voor steriliteit en bewaar deze 12 maanden bij kamertemperatuur. Maak van de 10x voorraadoplossing een werkende oplossing van PBS en vul deze aan met EDTA (concentratie zoals eerder vermeld).OPMERKING: pH is van cruciaal belang; zorg ervoor dat de pH nauwkeurig is voordat u met het protocol begint. Voer een 1:2 seriële verdunning uit van 1 mM GSH met behulp van ddH2O (1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM, 31,25 μM, 15,625 μM en 7,8125 μM). Voeg 10 μL van elke concentratie toe aan standaardputjes (uitgevoerd in tweevoud). Monsters worden verder verdund in lysisbuffer; daarom zullen de concentraties daarna 1/5e van hun oorspronkelijke concentratie zijn (200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625 μM).OPMERKING: De uiteindelijke concentraties voor kalibratie zijn 30 μm, 15 μm, 7,5 μm, 3,75 μm, 1,875 μm, 937,5 nm, 468,8 nm en 234,4 nm. 2. Voorbereiding van de test OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van menselijke cellijnen HepG2, A549 en J774, die commercieel zijn gekocht bij ATCC. Deze cellijnen werden gebruikt volgens de goedgekeurde richtlijnen die zijn uiteengezet in de dier- en weefselkweekwetten en -voorschriften van de universiteit. 24 uur vóór het begin van de analyse, zaadcellen in concentraties vermeld in tabel 1; Afhankelijk van de cellijn/het type en de gebruikte behandeling, past u echter de dichtheid indien nodig aan. Kweekcellen in volledig groeimedium (Eagles modified essentials medium (EMEM) met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (HIFS), 1% Penstrep (10.000 E/ml penicilline/ 10 mg/ml streptomycine) en 1% niet-essentiële aminozuren. Zaadcellen met behulp van conventionele celzaaimethoden32. Zaadcellen in volledig zwarte platen als ze niet met behulp van post-assay microscopie gebruiken. Beoordeel de cellen in de T75-kolf vóór gebruik op samenvloeiing en algemene gezondheid via microscopie. In een schone, steriele, biologische veiligheidskast van klasse II en volgens een strikte aseptische techniek, gooit u de celmedia weg, wast u de cellen voorzichtig met ~15 ml steriele PBS op kamertemperatuur (RT) en gooit u ze weg. Voeg 5 ml steriel 1x trypsine toe aan de celkolf, schud voorzichtig om ervoor te zorgen dat de celmonolaag bedekt is en plaats deze gedurende 5 minuten in een incubator bij 37 °C om de celloslating te vergemakkelijken. Stop de trypsinisatie door toevoeging van groeimedium met door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (10%), ongeveer 10 ml. Breng de cellen over in een centrifugebuis van 50 ml en pellet op 200 x g gedurende 5 minuten. Gooi het medium weg en vervang het door 5 ml van hetzelfde medium. Resuspendeer de cellen in de buis totdat ze homogeen zijn en er geen klontering meer kan worden waargenomen. Verwijder 20 μL celsuspensie en plaats deze in een hemocytometer om te tellen. Zodra het aantal benodigde cellen is berekend, voert u een verdunning uit om een oplossing met de juiste celdichtheid te maken. Pipetmedia met cellen in platen met 96 putjes (capaciteit van 350 μl), met een maximaal volume van 200 μl per putje. Plaats de cellen in een incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur om zich aan het plaatoppervlak te hechten. Om zowel het totale glutathion als het GSSG te beoordelen, behandelt u monsters voor beide aandoeningen. Zaai en behandel 6 putjes om 2 sets GSH en GSSG te leveren met 3 technische herhalingen (figuur 1 toont de lay-out). Zorg ervoor dat alle reagentia op de juiste manier zijn bereid voordat met de test wordt begonnen; zorg ervoor dat alle buffercomponenten en reagentia op RT zijn voordat u begint met de bouw van buffers of het gebruik in de test, met uitzondering van pH 7.4 PBS (zonder EDTA), die tot gebruik op ijs/gekoeld moet worden bewaard.OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de vorming van luchtbellen tot een minimum wordt beperkt om de gewenste reacties binnen de test mogelijk te maken en nauwkeurige kwantificering via de plaatlezer mogelijk te maken. De lijn van de cel Zaaidichtheid (plaat met 96 putjes) HepG2 10.000 cellen / put A549 5.000 cellen / put J774 10.000 cellen / put Tabel 1: Voorgestelde zaaidichtheden voor gekozen cellijnen. Aangetoond zijn verschillende zaaidichtheden voor drie verschillende cellijnen die in de weergegeven gegevens worden gebruikt, met name A549, J774 en HepG2. Figuur 1: Voorgestelde lay-out voor het zaaien van platen met 96 putjes voor de gelijktijdige bepaling van totaal glutathion en glutathiondisulfide. Wells voor kalibratie en controles worden ook gedemonstreerd. Putten die niet worden gebruikt, worden weergegeven met een kruis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 3. Behandeling van nanomaterialen Weeg nanomaterialen (met name ZnO, TiO2, CuO en Ag) in een μg-compatibele weegschaal. Voer een berekening uit om een beginconcentratie van 1 mg/ml per nanomateriaal te bereiken. Breng nanomateriaaloplossingen over naar een sonicator en sonicaat gedurende 16 minuten met behulp van een sonicatiebad (38 W) om een homogene oplossing te produceren. Maak een reeks verdunningen voor elk nanomateriaal bij 125, 62,5, 31,25, 15,625 μg/ml. Verwijder de cellen uit de couveuse en was ze lichtjes met RT PBS. Nadat u zich ervan hebt vergewist dat alle PBS is verwijderd, voegt u 100 μl behandelingen toe aan de plaat, met controles (kweekmedia zonder HIFS). Na het toepassen van de behandeling op de cellen, incuberen met de nanomaterialen in een incubator van 37°C (5% CO2) gedurende 4 uur; gebruik daarna het onderstaande protocol om GSH te kwantificeren: GSSG, eiwitconcentratie en AK-afgifte. 4. Protocol bij de bepaling Beoordeel na blootstelling aan de behandeling (Figuur 2A) de levensvatbaarheid via adenylaatkinase (AK)-activiteit (optioneel). Gebruik voor deze test een in de handel verkrijgbare kit volgens de instructies van de fabrikant. Draai de platen in een centrifuge bij 200 x g gedurende 5 minuten om de pelletbehandeling en het celafval licht te verwijderen (Figuur 2B). Verwijder voorzichtig 20 μl media-supernatant uit elk monster en controleputje (zoals hierboven aangegeven) en pipet in een aangrenzende witte plaat met 96 putjes in hetzelfde lay-outformaat (Figuur 2C). Voeg 100 μL werkoplossing uit de AK-kit toe aan elk putje, bescherm de plaat tegen licht en laat 10 minuten bij kamertemperatuur ontwikkelen. Registreer luminescentie met behulp van een plaatlezer met 1000 telling/s. Voeg voor GSH-normen 40 μl totale glutathionbuffer toe aan elk putje (figuur 2D; optioneel, vereist voor kwantificering). Zuig de resterende media van de plaat op en was 3x met ijskoud 0,1 M PBS, pH 7,2, waarbij u elke wasbeurt weggooit (Figuur 2E), met uitzondering van de normen. Laat de laatste was op de plaat zitten totdat de GSH-kalibratie in de plaat is geladen. Voeg 10 μL van elke glutathionconcentratie en blanco (ddH2O) toe aan putjes in drievoud. Verwijder de laatste PBS-wasbeurt en voeg de mengsels toe aan elk putje zoals beschreven in tabel 2 voor de gewenste doelkwantificering (Figuur 2E). Bereken de vereiste volumes voordat u met deze stap begint als gevolg van tijdgevoelig verlies van activiteit met volledige buffers. Zorg ervoor dat deze reagensmengsels worden gemaakt voordat het analyseproces wordt gestart, maar laat ze niet langer dan 30 minuten staan voor gebruik. Plaats op een orbitale plaatschudder en laat de plaat gedurende 2 minuten 2 minuten op 300 RPM schudden (Figuur 2F). Haal uit de shaker en voeg 5 μL 0,01M TCEP-oplossing toe aan elk putje, met uitzondering van het NEM-controleputje. Plaats de plaat terug in de shaker en incubeer gedurende 10 minuten (Figuur 2F). Breng de plaat over naar de centrifuge en draai gedurende 5 minuten op 200 x g . Breng 25 μl over van elk monsterputje naar een andere plaat met 96 putjes (helder); Dit wordt gebruikt voor de eiwitconcentratie (zie stap 4.15 ; Figuur 2G). Draag geen normen of analysecontroles over. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume voor elk putje 30 μL is; verwijder het volume uit de bedieningselementen en normen om aan deze vereiste te voldoen (Figuur 2H). Voeg 170 μL werkende OPA-oplossing toe aan elk putje, bescherm de plaat tegen licht en plaats deze gedurende 15 minuten op de shaker (Figuur 2I). Lees de fluorescentie af met behulp van een plaatlezer op Ex340/Em450 (Figuur 2J). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn tijdens de meetfase; Ze zullen een nadelige invloed hebben op zowel de reactie als de kwantificering via de plaatlezer. Om het eiwitgehalte van gelyseerde cellen te kwantificeren, gebruikt u een in de handel verkrijgbare BCA-testkit. Breng de monsters uit stap 4.12 over naar een nieuwe plaat met 96 putjes (helder) met een snelheid van 25 μl per putje. Gebruik een runderserumalbumine (BSA) standaard verdund in IP-lysisbuffer en voeg toe aan de plaat in drievoud van 25 μl per putje. De exacte concentraties zijn vastgelegd in het BCA-kitprotocol. Bereid een werkoplossing voor die bestaat uit een verhouding van 50:1 van de reagentia A en B uit de BCA-kit en voeg 200 μl toe aan elk putje met monster, standaard en controle. Bescherm de platen tegen licht en incubeer bij 37°C gedurende 30 minuten (Figuur 2K). Haal de monsters uit de incubator, laat ze 5 minuten bij kamertemperatuur in evenwicht komen en lees vervolgens de absorptie af via een plaatlezer bij 562 nm (figuur 2L). Lysis-reagensmix met totale glutathionconcentratie Bestanddeel Volume Lysis buffer 50μL Totaal volume / put 50μL Geoxideerde glutathionconcentratie lysis reagensmix Bestanddeel Volume Lysis buffer 49,5 μl NEM (25mM) 0,5 μl Totaal volume / put 50μL GEBRUIK BEIDE OPLOSSINGEN BINNEN 30 MINUTEN NA SAMENSTELLING VAN HET MENGSEL Onderdeel van de OPA-detectieoplossing Volume OPA 3mg/ml 5μL PBS (pH 9,0) 165μL Totaal volume / put 170μL Tabel 2: Noodzakelijke hoeveelheden reagentia voor de uitvoering van het protocol. Benodigde volumes per putje voor de bepaling van het totale glutathion, glutathiondisulfide en het benodigde werkreagens. Zorg ervoor dat de vereiste volumes worden berekend en dat er een overschot wordt opgenomen om rekening te houden met volumeverlies door overdracht. Figuur 2: Schematische weergave van het protocol. (A) Eerste zaaiing, incubatie en behandeling van cellen. (B) Centrifugeren om media te scheiden van gesuspendeerde vaste stoffen. (C) Mediaoverdracht voor Adenylaatkinase-bepaling. (D) Toevoeging van glutathionconcentraties voor het kalibratiebereik. (E) Wasfasen en toevoeging van lyseerreagens. (F) Bufferadditie en tris(2-carboxyethyl)-fosfineadditie met schudstap. (G) Centrifugatie van gelyseerde cellen voor verwijdering van media voor eiwitanalyse. (H) Mediaverwijdering om het volume over de plaat gelijk te maken. (I) Toevoeging van orthoftalaldehyde werkoplossing met schudincubatie. (J) Meting van orthoftalaldehydefluorescentie via plaatlezer. (K) Incubatiestadia voor de bepaling van bicinchoninezuur voor de bepaling van eiwitten. (L) Meting van de eiwitconcentratie, waardoor normalisatie van glutathion: glutathiondisulfidewaarden mogelijk is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.