Différenciation des lignées du système nerveux entérique à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Le système nerveux entérique (SNE) est le composant le plus important du système nerveux périphérique. Le SNE contient plus de 400 millions de neurones qui sont situés dans le tractus gastro-intestinal et contrôlent presque toutes les fonctions de l’intestin¹. La compréhension moléculaire du développement et de la fonction du SNE et de ses défauts dans les neuropathies entériques nécessite l’accès à une source fiable et authentique de neurones entériques. L’accès aux tissus primaires humains est limité, et les modèles animaux ne parviennent pas à récapituler les phénotypes clés de la maladie dans de nombreuses neuropathies entériques. La technologie des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) s’est avérée extrêmement bénéfique en fournissant une source illimitée de types de cellules souhaités, en particulier celles qui sont difficiles à isoler à partir de sources primaires 2,3,4,5,6,7. Ici, nous fournissons les détails d’une méthode in vitro robuste et par étapes pour obtenir des cultures ENS à partir de hPSC. Ces cultures évolutives dérivées de hPSC ouvrent la voie aux études de développement, à la modélisation des maladies et au criblage de médicaments à haut débit et peuvent fournir des cellules transplantables pour la médecine régénérative.

Les lignées de neurones entériques sont dérivées de cellules de crête neurale (NC) suivant le chemin de développement du SNE au cours de l’embryogenèse. Chez les embryons, les cellules NC émergent le long des marges de la plaque neurale pliée. Ils prolifèrent, migrent et donnent naissance à de nombreux types de cellules différents, notamment les neurones sensoriels, les cellules de Schwann, les mélanocytes, le squelette craniofacial et les neurones entériques et glia ^8,9,10. La décision du destin cellulaire dépend de la région distincte le long de l’axe antéro-postérieur d’où émergent les cellules NC, c’est-à-dire NC crânienne, NC vagale, NC tronc et NC sacrée. Le SNE se développe à partir de cellules NC vagales et sacrées, les premières dominant la population des neurones entériques en raison de la migration extensive le long de l’intestin et colonisant l’intestin¹¹.

La dérivation des cellules NC à partir des CSP implique généralement une combinaison d’inhibition double de SMAD et d’activation de la voie WNT^12,13. Jusqu’à récemment, tous les protocoles d’induction de la NC impliquaient des additifs sériques et d’autres produits animaux dans les conditions de culture. Les milieux chimiquement indéfinis réduisent non seulement la reproductibilité de l’induction CN, mais remettent également en question les études de développement mécanistes. Pour surmonter ces défis, Barber et coll.¹⁴ ont mis au point un protocole d’induction de la NC en utilisant des conditions de culture chimiquement définies et s’est donc avéré avantageux par rapport aux autres méthodes qui reposent sur des facteurs de remplacement sérique (p. ex., KSR)^13,14. Ceci a été obtenu par des remplacements de milieux basaux et l’optimisation d’un protocole présenté à l’origine par Fattahi et al pour dériver des cellules NC entériques à partir de hPSC. Ce système amélioré est à la base du protocole de différenciation hPSC qui est présenté ici. Elle commence par l’induction de cellules entériques de la crête neurale (ENC) sur une période de 15 jours par une modulation précise de la signalisation BMP, FGF, WNT et TGFβ en plus de l’acide rétinoïque (RA). Nous dérivons ensuite les lignées ENS en traitant des cellules avec du facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF). Toutes les compositions de milieux sont définies chimiquement et produisent des cultures neuronales entériques robustes en 30 à 40 jours.

En plus du système de culture cellulaire monocouche décrit ici, d’autres approches d’induction NC ont été développées qui utilisent des corps embryoïdes flottants^15,16. Il a été démontré que les cellules migratrices de ces cultures expriment des marqueurs NC avec un sous-ensemble représentant le NC vagal. Des co-cultures avec du tissu intestinal primaire ont été utilisées pour enrichir les précurseurs entériques des NC dans ces cultures. La composition des milieux dans ces études contient une combinaison de différents facteurs tels que le facteur de croissance nerveuse, NT3 et le facteur neurotrophique dérivé du cerveau. À ce stade, il n’est pas tout à fait clair comment ces facteurs pourraient affecter les identités d’engagement des précurseurs des neurones entériques. Pour une comparaison efficace de l’induction entérique des NC dans la monocouche et les cultures basées sur le corps embryoïde, davantage de données sont nécessaires. Étant donné les différentes dispositions de culture dans ces stratégies, l’utilisation de chaque méthode doit être envisagée et optimisée en fonction de l’application spécifique à l’esprit.

Le protocole présenté ici est reproductible et a été testé avec succès par nous et d’autres en utilisant différentes lignées hPSC (induites et embryonnaires) ^8,14,16.