Differenziazione delle linee del sistema nervoso enterico dalle cellule staminali pluripotenti umane

Il sistema nervoso enterico (ENS) è il componente più grande del sistema nervoso periferico. L’ENS contiene più di 400 milioni di neuroni che si trovano all’interno del tratto gastrointestinale e controllano quasi tutte le funzioni dell’intestino¹. La comprensione molecolare dello sviluppo e della funzione dell’ENS e dei suoi difetti nelle neuropatie enteriche richiede l’accesso a una fonte affidabile e autentica di neuroni enterici. L’accesso al tessuto primario umano è limitato e i modelli animali non riescono a ricapitolare i fenotipi chiave della malattia in molte neuropatie enteriche. La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) si è dimostrata estremamente vantaggiosa nel fornire una fonte illimitata dei tipi di cellule desiderate, in particolare quelle che sono difficili da isolare da fonti primarie 2,3,4,5,6,7. Qui, forniamo i dettagli di un metodo in vitro graduale e robusto per ottenere colture ENS da hPSC. Queste colture scalabili derivate da hPSC aprono la strada per studi sullo sviluppo, modellazione della malattia e screening di farmaci ad alto rendimento e possono fornire cellule trapiantabili per la medicina rigenerativa.

Le linee neuronali enteriche derivano dalle cellule della cresta neurale (NC) che seguono il percorso di sviluppo dell’ENS durante l’embriogenesi. Negli embrioni, le cellule NC emergono lungo i margini della placca neurale ripiegata. Proliferano, migrano e danno origine a molti tipi di cellule diverse, tra cui neuroni sensoriali, cellule di Schwann, melanociti, scheletro craniofacciale e neuroni enterici e glia ^8,9,10. La decisione sul destino cellulare dipende dalla regione distinta lungo l’asse antero-posteriore da cui emergono le cellule NC, cioè NC cranica, NC vagale, NC del tronco e NC sacrale. L’ENS si sviluppa da cellule NC vagali e sacrali, con le prime che dominano la popolazione dei neuroni enterici a causa dell’estesa migrazione lungo la lunghezza dell’intestino e colonizzano l’intestino¹¹.

La derivazione di cellule NC da PSC comporta comunemente una combinazione di doppia inibizione SMAD e attivazione della via WNT^12,13. Fino a poco tempo fa, tutti i protocolli di induzione NC coinvolgevano siero e altri additivi di prodotti animali nelle condizioni di coltura. I terreni chimicamente indefiniti non solo riducono la riproducibilità dell’induzione di NC, ma mettono anche in discussione gli studi meccanicistici sullo sviluppo. Per superare queste sfide, Barber et al¹⁴ hanno sviluppato un protocollo di induzione NC utilizzando condizioni di coltura chimicamente definite ed è stato quindi vantaggioso rispetto ai metodi alternativi che si basano su fattori di sostituzione del siero (ad esempio, KSR)^13,14. Questo è stato ottenuto mediante sostituzioni di terreni basali e ottimizzando un protocollo originariamente presentato da Fattahi et al per derivare cellule NC enteriche da hPSC. Questo sistema migliorato è la base del protocollo di differenziazione hPSC qui presentato. Inizia con l’induzione delle cellule della cresta neurale enterica (ENC) in un periodo di 15 giorni mediante una modulazione precisa della segnalazione BMP, FGF, WNT e TGFβ oltre all’acido retinoico (RA). Quindi deriviamo i lignaggi ENS trattando le cellule con il fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF). Tutte le composizioni dei terreni sono chimicamente definite e producono robuste colture neuronali enteriche entro 30-40 giorni.

Oltre al sistema di coltura cellulare monostrato qui descritto, sono stati sviluppati approcci alternativi di induzione NC che utilizzano corpi embrioidi liberi fluttuanti^15,16. È stato dimostrato che le cellule migratorie in queste colture esprimono marcatori NC con un sottogruppo che rappresenta la NC vagale. Le co-colture con tessuto intestinale primario sono state utilizzate per arricchire i precursori enterici della NC in queste colture. Le composizioni dei media in questi studi contengono una combinazione di diversi fattori come il fattore di crescita nervoso, NT3 e il fattore neurotrofico derivato dal cervello. In questa fase, non è del tutto chiaro come questi fattori possano influenzare le identità di impegno dei precursori dei neuroni enterici. Per un confronto efficiente dell’induzione enterica delle NC nel monostrato e nelle colture basate su corpi embrioidi sono necessari ulteriori dati. Dati i diversi layout culturali in queste strategie, l’uso di ciascun metodo dovrebbe essere considerato e ottimizzato in base all’applicazione specifica in mente.

Il protocollo qui presentato è riproducibile ed è stato testato con successo da noi e da altri utilizzando diverse linee di hPSC (indotte ed embrionali) ^8,14,16.