Differenzierung der Abstammungslinien des enterischen Nervensystems von humanen pluripotenten Stammzellen

Das enterische Nervensystem (ENS) ist der größte Bestandteil des peripheren Nervensystems. Das ENS enthält mehr als 400 Millionen Neuronen, die sich im Magen-Darm-Trakt befinden und fast alle Funktionen des Darms steuern¹. Das molekulare Verständnis der Entwicklung und Funktion des ENS und seiner Defekte bei enterischen Neuropathien erfordert den Zugang zu einer zuverlässigen und authentischen Quelle für enterische Neuronen. Der Zugang zu menschlichem Primärgewebe ist begrenzt, und Tiermodelle können die wichtigsten Krankheitsphänotypen bei vielen enterischen Neuropathien nicht rekapitulieren. Die Technologie der humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) hat sich als äußerst vorteilhaft erwiesen, da sie eine unbegrenzte Quelle für die gewünschten Zelltypen bietet, insbesondere für solche, die nur schwer aus Primärquellen isoliert werden können 2,3,4,5,6,7. Im Folgenden stellen wir Ihnen eine schrittweise und robuste In-vitro-Methode zur Gewinnung von ENS-Kulturen aus hPS-Zellen vor. Diese skalierbaren hPSC-abgeleiteten Kulturen eröffnen Wege für Entwicklungsstudien, Krankheitsmodellierung und Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und können transplantierbare Zellen für die regenerative Medizin bereitstellen.

Die enterischen Neuronenlinien stammen von Neuralleistenzellen (NC) ab, die während der Embryogenese dem ENS-Entwicklungspfad folgen. In Embryonen entstehen NC-Zellen entlang der Ränder der gefalteten Neuralplatte. Sie vermehren sich, wandern und führen zu vielen verschiedenen Zelltypen, darunter sensorische Neuronen, Schwann-Zellen, Melanozyten, kraniofaziale Skelett- und enterische Neuronen sowie Gliazellen ^8,9,10. Die Entscheidung über das Zellschicksal hängt von der unterschiedlichen Region entlang der anterior-posterioren Achse ab, aus der die NC-Zellen hervorgehen, d.h. kraniale NC, vagale NC, Rumpf-NC und sakrale NC. Das ENS entwickelt sich aus vagalen und sakralen NC-Zellen, wobei erstere aufgrund der ausgedehnten Wanderung entlang des Darms und der Besiedlung des Darms die Population der enterischen Neuronen dominieren¹¹.

Die Ableitung von NC-Zellen aus PSCs beinhaltet üblicherweise eine Kombination aus dualer SMAD-Hemmung und Aktivierung des WNT-Signalwegs^12,13. Bis vor kurzem wurden bei allen NC-Induktionsprotokollen Serum und andere tierische Produktzusätze unter den Kulturbedingungen verwendet. Chemisch undefinierte Medien verringern nicht nur die Reproduzierbarkeit der NC-Induktion, sondern stellen auch eine Herausforderung für mechanistische Entwicklungsstudien dar. Um diese Herausforderungen zu meistern, entwickelten Barber et al.¹⁴ ein NC-Induktionsprotokoll unter chemisch definierten Kulturbedingungen und waren daher gegenüber alternativen Methoden, die auf Serumersatzfaktoren (z. B. KSR) basieren, ^{vorteilhaft13,14}. Dies wurde durch den Ersatz von Basalmedien und die Optimierung eines ursprünglich von Fattahi et al. vorgestellten Protokolls zur Ableitung enterischer NC-Zellen aus hPSCs erreicht. Dieses verbesserte System ist die Grundlage des hier vorgestellten hPSC-Differenzierungsprotokolls. Sie beginnt mit der Induktion von enterischen Neuralleistenzellen (ENC) in einem Zeitraum von 15 Tagen durch präzise Modulation der BMP-, FGF-, WNT- und TGFβ-Signalwege zusätzlich zu Retinsäure (RA). Anschließend leiten wir die ENS-Linien ab, indem wir Zellen mit dem von Gliazelllinien abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF) behandeln. Alle Medienzusammensetzungen sind chemisch definiert und liefern innerhalb von 30-40 Tagen robuste enterische neuronale Kulturen.

Zusätzlich zu dem hier beschriebenen Monolayer-Zellkultursystem wurden alternative NC-Induktionsansätze entwickelt, die frei schwebende Embryoidkörper verwenden^15,16. Es wurde gezeigt, dass wandernde Zellen in diesen Kulturen NC-Marker exprimieren, wobei eine Untergruppe die vagale NC repräsentiert. Co-Kulturen mit primärem Darmgewebe wurden verwendet, um enterische NC-Vorläufer in diesen Kulturen anzureichern. Die Medienzusammensetzungen in diesen Studien enthalten eine Kombination verschiedener Faktoren wie Nervenwachstumsfaktor, NT3 und vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor. Zu diesem Zeitpunkt ist noch nicht vollständig klar, wie sich diese Faktoren auf die Bindungsidentitäten der enterischen Neuronen auswirken könnten. Für einen effizienten Vergleich der enterischen NC-Induktion in der Monoschicht und den Embryoidkörper-basierten Kulturen sind weitere Daten erforderlich. Angesichts der unterschiedlichen Kulturlayouts in diesen Strategien sollte der Einsatz jeder Methode in Betracht gezogen und entsprechend der spezifischen Anwendung optimiert werden.

Das hier vorgestellte Protokoll ist reproduzierbar und wurde von uns und anderen erfolgreich mit verschiedenen hPSC-Linien (induziert und embryonal) getestet ^8,14,16.