Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

I difetti del tubo neurale (NTD) sono gravi difetti congeniti del sistema nervoso centrale causati da errori nella chiusura del tubo neurale (NTC) durante lo sviluppo embrionale¹. L’eziologia delle NTD è complessa. Gli studi hanno dimostrato che l’NTC coinvolge una sequenza di processi morfogenetici, tra cui l’estensione convergente, la flessione della placca neurale (ad esempio, la costrizione apicale), l’elevazione della piega neurale e infine l’adesione della piega neurale. Questi processi sono regolati da molteplici meccanismi molecolari e genetici ^2,3 e qualsiasi malfunzionamento in questi processi può provocare NTD ^4,5,6. Poiché prove crescenti suggeriscono che anche i segnali meccanici svolgono un ruolo cruciale durante le NTC 3,7,8,9,10,11 e sono state trovate relazioni tra geni e segnali meccanici 12,13,14, diventa imperativo studiare la biomeccanica dei tessuti durante la neurulazione.

Sono state sviluppate diverse tecniche per misurare le proprietà meccaniche dei tessuti embrionali, tra cui l’ablazione laser (LA)¹⁵, la dissezione e il rilassamento tissutale (TDR)^16,17, l’aspirazione con micropipette (MA)¹⁸, la nanoindentazione basata sulla microscopia a forza atomica (AFM)¹⁹, i micropenetratori (MI) e le micropiastre (MP)²⁰, la microreologia (MR) con pinzette ottiche/magnetiche 21,22,23e sensori basati su goccioline²⁴. I metodi esistenti sono in grado di misurare le proprietà meccaniche a risoluzioni spaziali che vanno dalle scale subcellulari a quelle tissutali. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono invasivi perché richiedono il contatto con il campione (ad es. MA, AFM, MI e MP), l’iniezione di materiale esterno (ad es. MR e sensori basati su goccioline) o la dissezione tissutale (ad es. LA e TDR). Di conseguenza, è difficile per i metodi esistenti monitorare l’evoluzione meccanica del tessuto della placca neurale in situ²⁵. Recentemente, l’elastografia a coerenza ottica riverberante si è dimostrata promettente per la mappatura meccanica senza contatto ad alta risoluzione^{spaziale 26}.

La microscopia confocale Brillouin è una modalità ottica emergente che consente la quantificazione senza contatto della biomeccanica tissutale con risoluzione subcellulare 27,28,29,30. La microscopia di Brillouin si basa sul principio della diffusione spontanea della luce di Brillouin, che è l’interazione tra la luce laser incidente e l’onda acustica indotta dalle fluttuazioni termiche all’interno del materiale. Di conseguenza, la luce diffusa subisce uno spostamento di frequenza, noto come spostamento di Brillouin ω_R, seguendo l’equazione³¹:

(1)

Qui, è l’indice di rifrazione del materiale, λ è la lunghezza d’onda della luce incidente, M’ è il modulo longitudinale, ρ è la densità di massa e θ è l’angolo tra la luce incidente e la luce diffusa. Per lo stesso tipo di materiali biologici, il rapporto tra indice di rifrazione e densità è approssimativamente costante 28,32,33,34,35,36. Pertanto, lo spostamento di Brillouin può essere utilizzato direttamente per stimare i cambiamenti meccanici relativi nei processi fisiologici. La fattibilità della microscopia di Brillouin è stata convalidata in vari campioni biologici 29,37,38. Recentemente, è stata dimostrata l’imaging meccanico time-lapse di un embrione di pulcino vivo combinando un microscopio Brillouin con un sistema di incubazione sul palco³⁹. Questo protocollo fornisce descrizioni dettagliate della preparazione del campione, dell’implementazione dell’esperimento, della post-elaborazione e dell’analisi dei dati. Ci auguriamo che questo sforzo faciliti l’adozione diffusa della tecnologia Brillouin senza contatto per lo studio della regolazione biomeccanica nello sviluppo embrionale e nei difetti alla nascita.