Мониторинг механической эволюции тканей при закрытии нервной трубки эмбриона цыпленка

Дефекты нервной трубки (ДНТ) – это тяжелые врожденные дефекты центральной нервной системы, вызванные сбоями в закрытии нервной трубки (NTC) во время эмбрионального развития¹. Этиология ДНТ сложна. Исследования показали, что NTC включает в себя последовательность морфогенетических процессов, включая конвергентное расширение, изгиб нервной пластинки (например, апикальное сужение), поднятие нервной складки и, наконец, адгезию нервной складки. Эти процессы регулируются множественными молекулярно-генетическими механизмами ^2,3, и любой сбой в этих процессах может привести к ДНТ ^4,5,6. Поскольку появляется все больше доказательств того, что механические сигналы также играют решающую роль во время NTC 3,7,8,9,10,11, и были обнаружены взаимосвязи между генами и механическими сигналами 12,13,14, становится необходимым исследовать биомеханику тканей во время нейруляции.

Для измерения механических свойств эмбриональных тканей было разработано несколько методов, в том числе лазерная абляция (LA)¹⁵, рассечение и релаксация тканей (TDR)^16,17, микропипеточная аспирация (MA)¹⁸, наноиндентирование на основе атомно-силовой микроскопии (АСМ)¹⁹, микроинденторы (MI) и микропланшеты (MP)²⁰, микрореология (MR) с оптическим/магнитным пинцетом^21,22,23и капельно-капельные датчики²⁴. Существующие методы позволяют измерять механические свойства с пространственным разрешением в диапазоне от субклеточного до тканевого масштаба. Тем не менее, большинство этих методов являются инвазивными, поскольку они требуют контакта с образцом (например, МА, АСМ, МИ и МП), внешнего введения материала (например, МРТ и капельных датчиков) или рассечения тканей (например, LA и TDR). В результате, существующие методы затрудняют мониторинг механической эволюции ткани нервной пластины in situ²⁵. В последнее время реверберационная оптическая когерентная эластография показала перспективность для бесконтактного механического картирования с высоким пространственным разрешением²⁶.

Конфокальная микроскопия Бриллюэна является новым оптическим методом, который позволяет бесконтактно количественно оценивать биомеханику тканей с субклеточным разрешением 27,28,29,30. Микроскопия Бриллюэна основана на принципе спонтанного рассеяния света по Бриллюэну, которое представляет собой взаимодействие между падающим лазерным светом и акустической волной, вызванной тепловыми флуктуациями внутри материала. Следовательно, рассеянный свет испытывает сдвиг частоты, известный как сдвиг Бриллюэна ω_R, в соответствии с уравнением³¹:

(1)

Здесь – показатель преломления материала, λ – длина волны падающего света, M’ – модуль продольного наклона, ρ – плотность массы, θ – угол между падающим и рассеянным светом. Для одного и того же типа биологических материалов отношение показателя преломления и плотности приблизительно постоянно 28,32,33,34,35,36. Таким образом, сдвиг Бриллюэна может быть непосредственно использован для оценки относительных механических изменений в физиологических процессах. Возможность микроскопии Бриллюэна была подтверждена на различных биологических образцах 29,37,38. Недавно была продемонстрирована покадровая механическая визуализация живого эмбриона цыпленка путем объединения микроскопа Бриллюэна с инкубационной системой³⁹ на сцене. Этот протокол содержит подробное описание подготовки образцов, проведения эксперимента, а также постобработки и анализа данных. Мы надеемся, что эти усилия будут способствовать широкому внедрению бесконтактной технологии Бриллюэна для изучения биомеханической регуляции в развитии эмбриона и врожденных дефектов.