樹冠形成ジャイアントケルプの野外採集と実験室でのメンテナンスによる修復促進

このプロトコルに記載されているように使用される昆布組織は、許可S-202020004-20205-001に基づいてカリフォルニア州魚類野生生物局によって収集および監督されました。 1. 設備・資材の準備 昆布養殖施設が温度(10-15°C)を維持し、フルスペクトル光(0-180 μmol光子m-2 s-1)を提供し、フィルターエアレーション(孔径0.2 μm)を提供できることを確認します。ワイヤーやチューブ、照明、空気源用のコンセントまたはアクセスポートが組み込まれたインキュベーターシステムを使用します(図1)。インキュベーターシステムがプロジェクトの範囲、予算、または意図した規模に収まらない場合は、冷たい天然海水またはチラーで和らげたウォーターバスを使用します(図2)。具体的な詳細については、 材料表 を参照してください。増殖培地に温度計を置くか、温度ガンを使用して、温度が10〜18°Cであることを確認します。注:飼育温度はサイトと季節によって異なります30. フルスペクトルライトを12時間の光の日長:12時間の暗さにプログラムするには、光源のタイミング設定を変更するか、機械的なタイマーを利用します。砂利付近の表面下にある防水光合成活性放射(PAR)量子メーターで光強度を測定し、調光可能な光源を使用するか、セロハンを重ねるか(栄養配偶体培養の場合、 セクション9を参照)、光源の上にメッシュを重ねて調整します(光強度調整の詳細については、 セクション6.3を参照)。 胞子形成の1日後にエアポンプ31 を使用して、適切な曝気を確保してください。フィルター(孔径0.2μm)を使用して、空気中の細菌汚染を低減します。注:「生砂利」 養殖の場合、曝気圧力は、初期段階の昆布の播種基質への付着を妨げないようにしながら、すべての培養容器内の水を循環させるのに十分でなければなりません。配偶体バイオマス( セクション9.2を参照)が存在する場合、培地に懸濁した配偶体を維持するのに十分な曝気圧力が必要です。 材料とステーションを滅菌します。これらを事前に準備してください( 材料表を参照)。70%イソプロピルアルコールを使用して表面をきれいにします。可能であれば、生殖組織を取り扱い 、「緑の砂利」の苗床の外で収集機器を清掃してください。 次の滅菌方法を使用します:ラボグレードの洗剤を使用してすすぎ、蒸留水で完全にすすぎ、希釈した漂白剤溶液に浸し(メーカーの指示に従って)、蒸留水で完全にすすぎ、適切な設定(ガラス器具または器具)を使用してオートクレーブします。滅菌後、材料は密閉容器に保管するか、ホイルで包むことができます。 ラボグレードの洗剤を使用して培養に使用する蓋付きの容器をこすり洗いして洗浄し、その後、蒸留水で完全にすすいでください。注:蓋付き培養容器は、増殖培地の蒸発を減らすのに役立ちます。蓋を少し開けたままにして空気交換を可能にするか、逆止弁を使用して空気中の汚染を減らします。蓋付きの容器が利用できない場合は、培養容器をパラフィンフィルムなどの熱可塑性樹脂で密封し、2〜3個のミシン目を作ります。より大きなタンクを使用する場合は、透明なプラスチック製の蒸発防止カバーを使用してください。 配偶体は高粘疹の基質に保持される可能性が高いため、砂利の表面にテクスチャーがあるか、わずかにくぼみがあることを確認してください32,33。水が透明になるまで砂利をこすり洗いしてすすぎ、ほこりや破片を取り除きます。砂利を10%希釈した漂白剤溶液に少なくとも24時間浸し、ろ過滅菌した海水ですすいでください(セクション2.1を参照)。あるいは、こすい洗いした後、砂利を脱イオン(DI)水に1週間浸す32。注:理想的には、修復部位の汚染を減らすために、局所的に採取された基質が使用されます。または、水族館グレードの砂利をお勧めします。石灰岩などの石灰質基質は、移植された昆布の組織の漂白とその後の死亡率につながる可能性があります32。 2. 増殖培地の調製 資源の入手可能性に応じて、以下の方法で海水をろ過し、殺菌します。培養容器を毎週リフレッシュするために必要なろ過滅菌海水の量を計算し( セクション7を参照)、それに応じてこのろ過/滅菌タスクをスケジュールします。ろ過滅菌した海水を大量に暗い容器に入れ、8〜10°Cで最大6か月間保管します。 冷蔵できない場合は、暗くて涼しい場所に保管してください。孔径0.55-1μmの真空ろ過システムを使用して水をろ過します。フィルターの損傷を防ぐために、すべての水が引き込まれる前に真空源をオフにし、ろ過された水を専用の滅菌容器に注ぎます。容量が大きい場合は、フロースルーろ過システムを使用してください。例えば、孔径の大きいものから小さいものへと配置された3つのプリーツフィルター(10μm、5μm、1μm)に海水を流します。注:天然の海水にアクセスできない場合は、人工海水を用意することができます。また、天然の海水は水族館の店から大量に購入することができ、多くの場合、ろ過、消毒、pHバランスが取れています。これらのオプションには、メディアエンリッチメントが引き続き必要です。 ろ過された海水は、UV法やオートクレーブ法で滅菌します。フロースルーシステムを、メーカーが推奨する流量で水槽のUVライトに接続します。オートクレーブで海水をオートクレーブに浸し、蓋をわずかに開いた状態またはホイルで覆い、液体サイクル(121°C、1-2 PSI、液体の量に応じて15-30分)で加熱します34。注:培養の初期段階には、ろ過された海水をオートクレーブ滅菌することをお勧めします。 濾過滅菌した海水に栄養素やビタミンを豊富に含ませることは、 M. pyrifera の増殖に不可欠です。Provasoli濃縮海水培地(PES)は、藻類培養用に設計された広く使用されている培地です35。この培地は藻類培養センターから購入してください。 M. pyrifera の成長のためのPESおよび追加のビタミンの調製物は、34に記載されている。ろ過した海水1 Lごとに20 mLのPESを濃縮します。または、工業レベルの培養培地を使用します。 エンリッチメントソリューションは、メーカーの推奨に従って保管してください。濃縮液の劣化を防ぐために、増殖培地が必要な場合は、ろ過滅菌した海水を濃縮します。 3. フィールド収集 胞子葉の採取のタイミングを決定し、地域の M.ピリフェラ 個体群の自然な生殖サイクルを模倣します。 地元の専門家(昆布研究者、管理者、生態学者、市民科学者、ダイビンググループなど)に相談して、胞子葉の採取に適切なタイミングを確保してください。 現地の法律や規制を満たす昆布組織の収集に必要な許可を取得します。これは培養プロセスの時間のかかる部分であり、プロジェクトのタイムラインに組み込む必要があります。 自己完結型の水中呼吸装置(スキューバ)により、少なくとも2 mの間隔をあけて、目に見えるソリを持つ10〜15個の肥沃な M.ピリフェラ の個体から3〜5個の胞子葉葉を選択します。可能であれば、汚れや劣化がほとんどまたはまったくない、清潔で無傷のスポロフィルを選択してください。胞子葉の刃は、この時点から親個体に応じて別々に保管してください。注:胞子葉は、成虫の昆布のホールドファストの上の基部に密集した「スカート」で成長し、ガスで満たされた肺嚢胞がないことで識別できます1。成熟した石部組織は、周囲の組織1よりもわずかに隆起し、色が濃いことがよくあります。 胞子葉の刃は、日光の過度な露出を避けるため暗所の採取袋に入れて輸送し、現場からの海水を最小限に抑えて刃を濡らさず、培養スペースに到着するまで約12°Cのクーラーで保管します。サンプルが氷と直接接触していないことを確認してください。注:胞子嚢は、他の場所との間で出荷できます。胞子葉を海水ですすいでください。1匹の M.pyrifera 個体から採取したブレードを、海水に浸した湿らせたペーパータオルで包み、再びアルミホイルで包み、光の浸透と追加の乾燥を防ぎます36。この保存方法は、一般に「ブリトー法」として知られています。 これらのパッケージは、リサイクルされた気泡緩衝材や段ボールなどの保護バリアを備えた氷を入れたクーラーボックスに入れます。クーラーを翌日出荷の準備をします。貨物を受け取ることができる人がいることを確認し、パッケージを冷蔵状態にします。 4.胞子形成 可能であれば、10〜15°Cの温度制御された環境で、他の培養物から離れた場所で胞子葉を処理します。器具やステーションを事前に準備し、滅菌してください。昆布ティッシュを取り扱うときは、汚染を減らすために保護手袋を着用してください。 任意選択で、胞子葉を冷蔵状態で12〜48時間保存し、胞子組織からの胞子放出を促進する37。保存するには、セクション3.3で説明した「ブリトー法」を使用します。 熟した卵腺組織を選択し、滅菌ハサミを使用して25cm2 のセクションにカットします。遺伝的多様性を促進するために、10〜15匹の昆布の親から1〜2個のきれいなソリセクションを選択します。注意: 保管されている場合は、必要に応じて、ペーパータオルに部分胞子形成の証拠を見つけ、肥沃な石膜組織の存在を示します。ソラス組織は、周囲の組織よりもわずかに隆起し、色が濃いことがよくあります。 洗浄するには、フィルター滅菌した海水で湿らせた滅菌ガーゼを使用して、皮膚組織の両側を一方向にのみ静かにこすります。必要に応じて、滅菌カミソリの刃で石膜組織をそっとこすり、汚れを完全に取り除きます。ソリ切片を淡水浴に30秒〜1分間浸し、ろ過滅菌した海水ですすいでください。注意: 相互汚染を減らすために、さまざまな個人からのさまざまなソリセクションを取り扱うときは、淡水浴をリフレッシュし、使用中の材料を滅菌してください。 各ソリ切片を、滅菌済みの50mL遠心チューブ内で10〜15°Cに焼き戻したフィルター滅菌海水に浸します。チューブを暗所で4〜12°Cに置き、最大4時間胞子を形成します。冷蔵庫が利用できない場合は、暗い涼しい場所に保管してください。注:あるいは、ソリ切片を単一の滅菌容器で胞子化することもできます。 複合顕微鏡と血球計算盤を使用して、30分ごとに最大4時間まで3〜4サンプルの胞子密度を観察します。サンプル間でピペットチップを交換します。密度が少なくとも10,000胞子mL-1 の場合( セクション5.1.1を参照)、次のステップに進みます。4時間後に胞子が産生されない場合は、サンプルを廃棄します。胞子は放出後数時間以内に沈殿する可能性がありますが、円を描くように泳いでいるのが観察されることがあります。 滅菌ピンセットでチューブから各ソリセクションを取り除きます。得られた胞子溶液を単一の滅菌容器に混合し、最終的な結合密度を定量化します。 5.接種 接種に必要な胞子溶液の最終量を計算します。培養容器内の最終濃度が約500〜1,000胞子mL-1 であることを確認してください。血球計算盤の中央グリッドの数から結合された胞子サンプルの濃度を計算するには、カウントを10〜4 mLで割ります(血球計算盤で観察された溶液の量を表す)。 各容器に添加する胞子溶液の量を決定するには、基質を培養容器内に沈めるのに必要な増殖培地の量を決定します。 各容器内の胞子の総数を見つけるには、この海水量に目的の濃度を掛けます。 添加する胞子溶液の総量を決定するには、胞子の総量を胞子溶液中のmLあたりの胞子の濃度で割ります。 培養容器内に滅菌スライドガラスを入れ、昆布の発育を観察します。十分なモニタリングのために、培養容器にランダムに分散した少なくとも30枚のスライドを含めます(詳細は セクション7を参照)。 計算された量の胞子溶液を、増殖培地に浸した基質を含む滅菌ピペットチップを使用して培養容器に接種します。容器を閉じ、静かにかき混ぜて胞子を分散させます。容器を密封し、培養システムに入れます。 6.飼育条件 展開サイトの温度に基づいて、温度を10〜15°Cに設定します。 1日後、ろ過された空気源で軽い曝気を行います。 水生植物用のフルスペクトルLEDライトを12時間のライト:12時間のダークサイクルに設定し、光強度は0〜180μmolの光子m-2 s-1の範囲です。0〜1日の間、光強度を5〜10μmolの光子m-2 s-1 に設定し、1週間の終わりまで20〜30μmolの光子m-2 s-1 に増やします。 この時点から、6週間の終わりに180μmol光子m-2 s-1の放射照度に達するまで、3〜4日ごとに10〜20μmol光子m-2 s-1ずつ放射照度を増加させる。 180 μmol 光子 m-2 s-1 で 8 週間の終わりまで、または胞子体の長さが約 1-2 cm に達したら、培養を続けます。 7. モニタリング 最初の 2 週間は、毎日または隔日で少なくとも 2 つのランダムなスライド ガラスを監視して、発達を評価します。監視するには、滅菌したピンセットでスライドを取り扱い、スライドガラスを沈めるのに十分な滅菌海水を入れた清潔なペトリ皿に入れます。クロスコンタミネーションを避けるため、スライドガラスを除去した後は培養物に戻さないでください。 複合顕微鏡または倒立顕微鏡を40〜400倍の倍率で使用して、初期段階の昆布を観察します。以下のタイムラインで発達を追跡します(発達生活史段階の例については、図3を参照)。注:沈降した胞子は0〜1日で観察されます。胞子は、生殖管の形成によって実証されるように、数時間以内に発芽する可能性があります。発芽は通常、1〜2日で観察されます。初期の配偶体は通常、1〜4 dで観察されます。配偶子形成は、細胞が分裂と分化を経て雄と雌の配偶子を形成するプロセスであり、通常、最初の2週間以内に観察されます。女性の細胞は男性の5〜7倍の大きさです。雄の配偶体は細い糸状の枝を成長させますが、雌はより丸いまたは卵形の形をしています。メスは通常、2〜3週間以内に卵子または卵子を産みます。オスから放出された精子はメスに泳ぎ着き、卵子を受精させ、二倍体受精卵を形成します。適切な接種密度を持つことで、近接38,39による繁殖の成功が保証されます。受精卵は胚胞子体に成長します。胞子体は通常、2〜4週間以内に観察されます。接合子は急速な細胞分裂を受け、約6〜8週間以内に1〜2cmのブレードが成長します。 2週間後、胞子体のサイズが1〜2 cmに達するまで、少なくとも2つのランダムなスライドガラスを週に1〜2回監視して、健全な成長と汚染を確認します。注:健康な成長は、(緑や透明とは対照的に)黄金色の色を特徴としています。倒立顕微鏡でスライドガラスで観察できる定量的指標には、生存率、発芽率、栄養発生、生殖成熟度と繁殖力、性比40などがあります。 バクテリア、真菌、繊毛虫、珪藻による汚染を顕微鏡で評価します。孤立した汚染を取り除きます。二酸化ゲルマニウム(GeO2)( セクション8.3を参照)処理で珪藻汚染の初期兆候を制御します。 8. メンテナンス セクション6.3に従って光の状態を調整します。 毎週、増殖培地を交換して、 M.ピリフェラ の成長に必要な栄養素とミネラルを補充します。新鮮な培地を適切な温度に冷却します。このプロセス中は、温度が15°Cを超えないようにしてください。 培養容器から培地を吸い上げて、播種された基質を乱さないようにします。容器がほぼ空になるまで培地を排出します。乾燥を最小限に抑えるために、メディアをすぐに更新します。増殖容器を補充するときは、培地が培養容器の側面を流れ落ちるように少し傾けて、基質の乱れを最小限に抑えます。 毎週の培地交換時に容器や浴槽の位置をランダムに再配置し、光の放射照度の違いを考慮します。注:Macrocystis培養の活動と期待を追跡するためのカレンダーについては、 補足ファイル1を参照してください。これは、光と曝気の調整のタイミング、および毎週のメディアの変更を示します。 必要に応じて、二酸化ゲルマニウム(GeO2)の処理で珪藻の汚染を制御します。播種した基質に添加した海水1Lごとに0.3〜0.5 mLの250 mg / mLのGeO2を添加して、広範囲にわたる珪藻汚染を減らします。注:GeO2は、藻類配偶子の産生を阻害する可能性があります。発芽後、卵子および精子生産のピーク前(1〜7 d)および/または卵受精および胞子体観察後(>21 d)にGeO2 の処理を適用し、その後48時間後に培地を交換して化学物質を除去します。これらのタイムラインは培養条件によって異なる可能性があるため、顕微鏡でライフステージの発達をモニタリングすることは、GeO2 適用のタイミングを評価する最良の方法です。培養容器内に珪藻の汚染が残り、初期段階の昆布への異常成長が観察された場合は、基質の再播種を検討してください。 9. ジャイアントケルプ栄養配偶体培養 自然のサンゴ礁からの季節的な胞子葉の収集への依存を減らすために、栄養条件で配偶体培養物を一年中繁殖させます。配偶体培養物は、4〜12°C、赤色光、5〜20μmolの光子m-2 s-1 の強度で、12光:12暗サイクルで増殖培地を充填したフラスコに保管します。 一定の曝気を提供し、2〜6か月ごとにメディアを交換します。 「緑の砂利」播種に使用するために無性に成長している配偶体のバイオマスをバルクアップするには、配偶体を懸濁させるための通気を増やし、培地交換の頻度を毎週に増やし、配偶体を2週間ごとに断片化します。配偶体バイオマスを振とうまたは攪拌して培養フラスコに懸濁させ、必要に応じて培養フラスコの側面を滅菌ツールでこすり落として付着した配偶体を取り除きます。 懸濁した配偶体を滅菌ブレンダーまたはコーヒーグラインダーに注ぎ、凝集した塊が見えなくなるまで、バイオマス濃度に応じて配偶体溶液を約5〜15回1〜2秒間パルスします。 「緑の砂利」播種の繁殖を誘導するには、上記で説明したように配偶体を断片化します。次に、基板を接種し、フルスペクトルLED光を5-20から45-60μmolの光子m-2 s-1(光順化のために+10μmolの光子m-2 s-1日)に増やし、次に180μmolの光子m-2 s-1の放射照度に達するまで、3〜4日ごとに10-20μmolの光子m-2 s-1ずつ増加させます。 10. デプロイ 実験室で6〜8週間培養した後、幼魚の胞子体の長さが1〜2 cmで、展開の準備ができていることを確認します(図4)。展開の24時間前に培養容器内の増殖培地をリフレッシュします。 現地の法律や規制を満たす砂利の展開に必要な許可を取得します。これは培養プロセスの時間のかかる部分であり、プロジェクトのタイムラインに組み込む必要があります。 昆布の水分補給のために、海水に浸したタオルで覆われたトレイに「緑の砂利」を運びます。トレイを氷を入れた断熱クーラーに入れ、氷と直接接触しないようにします。輸送中に基質が転がったり、胞子体が剥がれたりしないように、「 緑の砂利」 がしっかりと梱包されていることを確認してください。注:スペースの空き状況に応じて、基質を培養容器または浴槽に入れて輸送し、取り扱いを減らすこともできます。 「グリーングラベル」を日陰のクーラーで最大6時間輸送します。展開は、直射日光が最も避けるようにタイミングを合わせる必要があります。ボートから展開する場合は、展開プロセス中に直射日光を避けるために、日陰の構造を利用します。 「グリーングラベル」を水面から下のサンゴ礁に、またはスキューバを介して慎重に散布し、新しい場所や小規模で試用します。