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Coleta de campo e manutenção laboratorial de algas gigantes formadoras de dossel para facilitar a restauração

Published: June 07, 2024
doi:
10.3791/66092
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1Department of Ecology and Evolutionary Biology,University of California, Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology,University of California, Santa Cruz, 3Facultad de Ciencias Marinas,Universidad Autónoma de Baja California, 4Facultad de Ciencias,Universidad Autónoma de Baja California, 5Instituto de Investigaciones Oceanológicas,Universidad Autónoma de Baja California, 6The Nature Conservancy

Summary

Este protocolo descreve a coleta em campo e a manutenção laboratorial regular de substratos semeados com algas gigantes formadoras de dossel para uso em ensaios de restauração para abordar o sucesso e as limitações da técnica de brita verde em ambientes de campo.

Abstract

As algas formadoras de dossel são espécies fundamentais essenciais, apoiando a biodiversidade e fornecendo serviços ecossistêmicos avaliados em mais de US$ 500 bilhões anuais. O declínio global das florestas de algas gigantes devido a estressores ecológicos impulsionados pelo clima ressalta a necessidade de estratégias inovadoras de restauração. Uma técnica de restauração emergente conhecida como “cascalho verde” visa semear algas jovens em grandes áreas sem trabalho subaquático extensivo e representa uma ferramenta de restauração promissora devido à relação custo-benefício e escalabilidade. Este artigo em vídeo ilustra um protocolo e ferramentas para o cultivo de algas gigantes, Macrocystis pyrifera. Também fornece um recurso para estudos futuros para abordar os sucessos e limitações desse método em ambientes de campo. Descrevemos métodos de campo e de laboratório para coletar tecidos reprodutivos, esporular, inocular, criar, manter e monitorar substratos semeados com estágios iniciais de vida usando a técnica de cascalho verde. O protocolo simplifica e centraliza as práticas atuais de restauração neste campo para apoiar pesquisadores, gestores e partes interessadas no cumprimento dos objetivos de conservação de algas.

Introduction

As algas formadoras de dossel (macroalgas marrons da ordem Laminariales) são espécies de fundação de importância global, dominando recifes rochosos costeiros em mares temperados e árticos1. Essas algas formam habitats biogênicos estruturalmente complexos e altamente produtivos, conhecidos como florestas de algas marinhas, que suportam comunidades marinhas taxonomicamentediversas2. As florestas de algas marinhas em todo o mundo fornecem muitos serviços ecossistêmicos aos seres humanos, incluindo produção de pesca comercial, ciclagem de carbono e nutrientes e oportunidades recreativas, com um valor total estimado de US$ 500 bilhões por ano3.

Apesar de seu valor substancial, as florestas de algas marinhas enfrentam crescentes pressões antrópicas em muitas regiões3. As mudanças climáticas representam uma das ameaças mais significativas às algas marinhas devido ao aquecimento dos oceanos a longo prazo, combinado com o aumento da frequência de anomalias de temperatura 3,4,5,6,7. O aumento da temperatura oceânica está associado à limitação de nutrientes8, enquanto a exposição ao estresse térmico acima dos limiares fisiológicos pode resultar em mortalidade9. Em combinação com estressores locais regionais variáveis7, as populações de algas marinhas estão globalmente declinando em aproximadamente 2% ao ano10 com perdas significativas e deslocamentos persistentes para estados comunitários alternados em certas regiões 6,11,12,13,14. A recuperação natural das populações de algas marinhas por si só pode não ser suficiente para reverter a extensão das perdas atuais e projetadas 15,16,17,18, ressaltando a importância da restauração ativa.

Os esforços atuais de restauração de algas marinhas podem usar uma combinação de metodologias para restabelecer essas importantes espécies de fundação em recifes rochosos costeiros 3,19. As metodologias escolhidas para abordar preocupações específicas do local dependem do contexto geográfico, dos impedimentos específicos para a recuperação de algas marinhas e do contexto socioecológico11. Compreender as conexões e a interdependência dos sistemas socioecológicos é a chave, e intervenções que envolvam instituições locais e angariem apoio das comunidades locais aumentam a probabilidade de esforços bem-sucedidos de restauração20.

Além das mudanças climáticas, a pressão dos herbívoros ou a competição interespecífica impulsiona, diminui ou suprime a recuperação (por exemplo, por ouriços-do-mar13, peixes herbívoros 21,22, algas de grama 9,23 ou algas invasoras24). A restauração pode se concentrar na remoção desses estressores bióticos25, embora esses métodos exijam recursos substanciais e manutenção contínua11. Para catalisar a recuperação de espécies de algas, tem havido esforços para uma abordagem de semeadura direta, por exemplo, pesando sacos de malha preenchidos com lâminas férteis de algas até os bentos que liberam zoósporos no ambiente26. Este método, no entanto, é demorado e requer instalação e remoção subaquática técnica. Outros casos concentram-se no transplante de grandes quantidades de plantas doadoras adultas inteiras, que podem comprometer populações de doadores intimamente associadas e vulneráveis e muitas vezes são limitadas a pequenas escalas devido à dependência do transplante contínuo27.

Para regiões onde a limitação de esporos de algas marinhas pode estar impedindo a recuperação de florestas de algas devido à fragmentação de habitat, uma abordagem relativamente nova de restauração de algas marinhas chamada técnica de “cascalho verde” foi introduzida. A técnica foi testada com sucesso na Estação de Pesquisa de Flødevigen, no sul da Noruega28 e representou uma opção promissora para restauração devido ao custo-efetividade e escalabilidade. O fluxo de trabalho dessa técnica é o seguinte: (1) uma solução de esporos é criada a partir de tecido fértil coletado de algas adultas reprodutivas no campo e, em seguida, semeado em pequenos substratos, como cascalho; (2) algas em estágio inicial são criadas em condições abióticas controladas em laboratório sobre substratos; (3) substratos com esporófitos visíveis são implantados no campo em recifes específicos como “cascalho verde”, onde os esporófitos continuam a crescer. Note-se que os esforços típicos de transplante de indivíduos adultos requerem instalação subaquática trabalhosa e inibidora de custos por mergulhadores, e a técnica de “cascalho verde” utiliza implantação simples a partir da superfície28.

A técnica de “cascalho verde” está atualmente sendo testada por membros de vários grupos de trabalho internacionais29 em diferentes ambientes e várias espécies de algas laminarianas. Este protocolo descreve as instalações, materiais e métodos necessários para a coleta de tecidos, esporulação, semeadura, condições de criação, manutenção regular e monitoramento de algas em estágio inicial antes da implantação desta técnica de restauração no campo usando a alga gigante, Macrocystis pyrifera. Este protocolo é um recurso valioso para pesquisadores, gestores e partes interessadas que buscam fornecer informações sobre os sucessos e limitações deste método com M. pyrifera em diferentes cenários de campo.

Protocol

Os tecidos de algas utilizados conforme descrito neste protocolo foram coletados e supervisionados pelo Departamento de Peixes e Vida Selvagem da Califórnia sob a licença S-202020004-20205-001. 1. Preparação de instalações e materiais Garantir que as instalações de cultivo de algas possam manter a temperatura (10-15 °C), fornecer luz de espectro total (0-180 μmol fótons m-2 s-1) e aeração do filtro (tamanho de poro de 0,2 μm). Use sistemas de incubadora com uma saída embutida ou uma porta de acesso para fios e tubulações, luzes e uma fonte de ar (Figura 1). Se um sistema de incubadora não estiver dentro do escopo, orçamento ou escala pretendida do projeto, use banhos de água temperados com água do mar fresca e natural ou um chiller (Figura 2). Consulte a Tabela de materiais para obter detalhes específicos.Coloque um termômetro no meio de crescimento ou use uma pistola de temperatura para garantir que a temperatura esteja entre 10-18 °C.NOTA: As temperaturas de criação são específicas do local e da estação30. Programe luzes de espectro total para um fotoperíodo de 12 h de luz: 12 h escuro alterando as configurações de tempo na fonte de luz ou utilizando um temporizador mecânico. Medir a intensidade da luz com um medidor quântico de radiação fotossinteticamente ativa (PAR) à prova d’água abaixo da superfície perto da brita e ajustar usando uma fonte de luz regulável ou por camadas de celofane (no caso de cultivo de gametófitos vegetativos, ver Secção 9) ou malha sobre a fonte de luz (para detalhes sobre ajustes de intensidade luminosa, ver Secção 6.3). Garantir a aeração adequada usando bombas de ar31 um dia após a esporulação. Use filtros (tamanho de poro de 0,2 μm) para reduzir a contaminação bacteriana transportada pelo ar.NOTA: Para o cultivo de «cascalho verde», a pressão de aeração deve ser suficiente para fazer circular água em todos os recipientes de cultura, sem perturbar a fixação de algas em fase inicial aos substratos semeados. Se houver biomassa de gametófitos em volume (ver secção 9.2), a pressão de aeração deve ser suficiente para manter os gametófitos suspensos nos meios de cultura. Esterilizar materiais e estações. Prepare-os com antecedência (consulte a Tabela de Materiais).Limpar superfícies com álcool isopropílico a 70%. Manusear tecido sori reprodutivo e limpar o equipamento de coleta fora do viveiro de “cascalho verde”, se possível. Use os seguintes métodos de esterilização: enxaguar com detergente de grau laboratorial seguido de um enxágue completo com água destilada, mergulhar em uma solução de água sanitária diluída (de acordo com as instruções do fabricante) seguido de um enxágue completo com água destilada e autoclave usando configurações apropriadas (vidraria ou instrumentos). Após a esterilização, os materiais podem ser armazenados em um recipiente lacrado ou envolvidos com papel alumínio. Esfregue e limpe os recipientes com as tampas a serem usadas para a cultura usando um detergente de grau laboratorial, seguido de um enxágue completo com água destilada.NOTA: Os recipientes de cultura tampados ajudarão a reduzir a evaporação dos meios de crescimento. Deixe as tampas ligeiramente abertas para permitir a troca de ar ou use uma válvula de retenção para reduzir a contaminação transportada pelo ar. Se os recipientes com tampa não estiverem disponíveis, sele os recipientes de cultura com um termoplástico, como filme de parafina, e faça 2-3 perfurações. Se estiverem sendo usados tanques maiores, use capas antievaporação feitas de plástico transparente. Certifique-se de que a brita tenha uma superfície texturizada ou ligeiramente esburacada, pois os gametófitos têm maior probabilidade de serem retidos em substratos com alta rugosidade32,33. Esfregue e enxágue a brita até que a água fique clara para remover qualquer poeira ou detritos. Mergulhe o cascalho numa solução de água sanitária diluída a 10% durante, pelo menos, 24 h e lave com água do mar esterilizada por filtro (ver secção 2.1). Alternativamente, após esfregar e enxaguar, deixar a brita de molho por 1 semana em água desionizada (DI)32.NOTA: Idealmente, o substrato colhido localmente é usado para reduzir a contaminação do local de restauração. Alternativamente, recomenda-se cascalho de grau aquário. Evitar substratos calcários como o calcário, que podem levar ao clareamento tecidual e subsequente mortalidade das algas transplantadas32. 2. Preparação de meios de crescimento Filtrar e esterilizar a água do mar de acordo com os seguintes métodos, dependendo da disponibilidade de recursos. Calcule o volume de água do mar esterilizada por filtro necessário para refrescar os recipientes de cultura a cada semana (ver Seção 7) e programe essa tarefa de filtração/esterilização de acordo. Armazene grandes lotes de água do mar esterilizada por filtro em recipientes escuros por até 6 meses a 8-10 °C. Se a refrigeração não estiver disponível, guarde em uma área escura e fria.Filtre a água usando um sistema de filtração a vácuo com um tamanho de poro de 0,55-1 μm. Desligue a fonte de vácuo antes que toda a água seja puxada para evitar danificar o filtro e despeje a água filtrada em um recipiente estéril dedicado. Para volumes maiores, use um sistema de filtragem de fluxo. Por exemplo, passe a água do mar através de uma série de três filtros plissados (10 μm, 5 μm e 1 μm) dispostos do maior para o menor tamanho de poros.NOTA: Se a água do mar natural não for acessível, a água do mar artificial pode ser preparada. Alternativamente, a água do mar natural pode ser comprada em lojas de aquários, a granel e muitas vezes é filtrada, higienizada e com pH equilibrado. O enriquecimento da mídia ainda é necessário para essas opções. Esterilizar água do mar filtrada usando métodos UV e/ou autoclavagem. Conecte sistemas de passagem de fluxo a uma luz UV de aquário a uma taxa de fluxo recomendada pelo fabricante. Água do mar em autoclave em vidraria segura para autoclave com tampas levemente abertas ou cobertas com papel alumínio e em ciclo de líquidos (121°C; 1-2 PSI, 15-30 min, dependendo do volume de líquido34.NOTA: A autoclavagem da água do mar filtrada é recomendada para os estágios iniciais do cultivo. O enriquecimento da água do mar esterilizada por filtro com nutrientes e vitaminas é fundamental para o crescimento de M. pyrifera . Provasoli Enriched Seawater media (PES) é um meio amplamente utilizado projetado para culturas de algas35. Compre esta mídia de centros de cultura de algas. Preparações de PES e vitaminas adicionais para o crescimento de M. pyrifera são descritas em34.Enriqueça cada 1 L de água do mar filtrada com 20 mL de PES. Alternativamente, use meios de cultivo de nível industrial. Armazenar soluções de enriquecimento de acordo com as recomendações do fabricante. Enriqueça a água do mar esterilizada por filtro quando o meio de crescimento for necessário para evitar a degradação das soluções de enriquecimento. 3. Coleta de campo Determinar a época das coletas de esporofilos para mimetizar o ciclo reprodutivo natural de populações locais de M. pyrifera. Consulte especialistas locais (por exemplo, pesquisadores de algas, gerentes, ecologistas, cientistas cidadãos, grupos de mergulho) para garantir o momento apropriado para a coleta de esporofila. Obter as autorizações necessárias para a coleta de tecidos de algas que atendam às leis e regulamentos locais. Isso pode ser uma parte demorada do processo de cultivo e deve ser incorporado aos cronogramas do projeto. Por aparelho de respiração subaquática autônomo (SCUBA) para selecionar 3-5 lâminas de esporofilos de 10-15 indivíduos férteis de M. pyrifera com soros visíveis, espaçados pelo menos 2 m entre si. Selecione esporofilos limpos e intactos, se possível, com pouca ou nenhuma incrustação ou degradação. Armazenar lâminas de esporofilo separadamente de acordo com o indivíduo pai a partir deste ponto.NOTA: Os esporófilos crescem em uma “saia” densa na base, acima do porão da alga adulta, e podem ser identificados pela falta de pneumatocistos cheios de gás1. O tecido sórus maduro é frequentemente ligeiramente elevado e de cor mais escura do que o tecido circundante1. Transporte as lâminas de esporofila em sacos coletores escuros para evitar a exposição excessiva à luz solar, com o mínimo de água do mar do local para manter as lâminas molhadas, e armazene em caixas térmicas a aproximadamente 12 °C até a chegada ao espaço de cultivo. Certifique-se de que as amostras não estão em contato direto com o gelo.NOTA: Os esporofos podem ser enviados de ou para outros locais.Enxaguar esporofilos com água do mar. Embrulho de lâminas, coletadas de um único indivíduo de M. pyrifera , em papel toalha úmido embebido em água do mar e novamente em papel alumínio para evitar penetração de luz e dessecação adicional36. Este método de armazenamento é comumente conhecido como o “método burrito”. Coloque essas embalagens em um refrigerador com gelo, com uma barreira protetora, como plástico bolha reciclado ou papelão. Prepare o refrigerador para envio noturno. Certifique-se de que alguém esteja disponível para receber a remessa e coloque os pacotes em condições refrigeradas. 4. Esporulação Se possível, processe esporofilos em um ambiente com temperatura controlada entre 10-15 °C e longe de qualquer outra cultura. Prepare e esterilize instrumentos e estações com antecedência. Use luvas de proteção ao manusear o tecido de algas para reduzir a contaminação. Opcionalmente, armazenar esporofilos por 12-48 h em condições refrigeradas, favorecendo a liberação de esporos do tecido sórus37. Para armazenar, utilize o “método burrito” descrito na secção 3.3. Selecione o tecido sorus maduro e corte-o em cortes de 25 cm2 usando tesoura estéril. Selecione 1-2 seções de sori limpas de 10-15 pais de algas individuais, para promover a diversidade genética.NOTA: Se armazenado, opcionalmente encontrar evidência de esporulação parcial nas toalhas de papel, indicando a presença de tecido sórus fértil. O tecido sórus é frequentemente ligeiramente elevado e de cor mais escura do que o tecido circundante. Para limpar, esfregue suavemente ambos os lados do tecido sórus em uma direção apenas com uma gaze estéril umedecida com água do mar esterilizada por filtro. Se necessário, raspe o tecido sórus suavemente com uma lâmina de barbear estéril para remover totalmente a incrustação. Submergir a seção de soros em um banho de água doce por 30 s a 1 min e enxaguar com água do mar esterilizada por filtro.NOTA: Refrescar o banho de água doce e esterilizar os materiais em uso ao manusear diferentes cortes de sori de diferentes indivíduos para reduzir a contaminação cruzada. Submergir cada seção de sorção em água do mar esterilizada por filtro temperada a 10-15 °C dentro de um tubo centrífugo estéril de 50 mL. Coloque os tubos a 4-12 °C no escuro para esporular por um máximo de 4 h. Se uma geladeira não estiver disponível, guarde-a em uma área fria e com pouca luz.NOTA: Alternativamente, as seções de sori podem ser esporuladas em um único recipiente estéril. Usando um microscópio composto e hemocitômetro, observe a densidade de esporos de 3-4 amostras a cada 30 min até 4 h. Altere as pontas da pipeta entre as amostras. Se as densidades forem de, pelo menos, 10.000 esporos mL-1 (ver Secção 5.1.1), avance para o passo seguinte. Se uma secção de soros não produzir esporos após 4 h, elimine a amostra. Os esporos podem se instalar dentro de horas após a liberação, mas podem ser observados nadando em um movimento circular. Remova cada seção de soros dos tubos com pinças estéreis. Combine as soluções de esporos resultantes em um único recipiente esterilizado e quantifique a densidade final combinada. 5. Inoculação Calcular o volume final de solução de esporos necessário para a inoculação. Certifique-se de que a concentração final seja de aproximadamente 500-1.000 esporos mL−1 em recipientes de cultura.Para calcular a concentração da amostra de esporos combinados a partir da contagem da grade central do hemocitômetro, divida a contagem por 10-4 mL (representando o volume de solução visualizado no hemocitômetro). Para determinar o volume da solução de esporos a ser adicionada a cada recipiente, determine a quantidade de meio de crescimento necessária para submergir substratos dentro de recipientes de cultura. Para encontrar o número total de esporos em cada recipiente, multiplique esse volume de água do mar pela concentração desejada. Para determinar o volume total de solução de esporos a ser adicionada, divida a quantidade total de esporos pela concentração de esporos por mL na solução de esporos. Coloque lâmina(s) de vidro estéril dentro de recipientes de cultura para monitorar o desenvolvimento de algas. Incluir pelo menos 30 lâminas distribuídas aleatoriamente em recipientes de cultura para monitoramento suficiente (ver detalhes na Seção 7). Inocular o volume calculado de solução de esporos no recipiente de cultura usando uma ponta de pipeta estéril que contém substratos submersos em meios de crescimento. Feche o recipiente e mexa suavemente para distribuir esporos. Lacre e coloque o recipiente no sistema de cultura. 6. Condições de criação Defina a temperatura entre 10-15 °C com base na temperatura no local de implantação. Após 1 dia, fornecer aeração leve com uma fonte de ar filtrada. Ajuste luzes LED de espectro total para plantas aquáticas para um ciclo de 12 h de luz: 12 h de escuro, com intensidades de luz variando entre 0-180 μmol de fóton m-2 s-1:Ajuste a intensidade da luz para 5-10 μmol fóton m-2 s-1 a partir de 0-1 dia e aumente para 20 – 30 μmol fóton m-2 s-1 até o final de 1 semana. A partir deste ponto, aumentar a irradiância em 10-20 μmol fóton m-2 s-1 a cada 3-4 dias até atingir uma irradiância de 180 μmol fóton m-2 s-1 ao final de 6 semanas. Continuar para culturas de criação a 180 μmol fóton m-2 s-1 até o final de 8 semanas, ou quando os esporófitos atingirem aproximadamente 1-2 cm de comprimento. 7. Monitoramento Monitore pelo menos duas lâminas de vidro aleatórias diariamente/a cada dois dias durante as duas primeiras semanas para avaliar o desenvolvimento.Para monitorar, manuseie a lâmina com uma pinça esterilizada e coloque-a em uma placa de Petri limpa contendo água do mar esterilizada suficiente para submergir a lâmina de vidro. Não devolva as lâminas de vidro às culturas após a remoção para evitar contaminação cruzada. Use um microscópio composto ou invertido em aumento de 40-400x para observar algas em estágio inicial. Acompanhe o desenvolvimento com a seguinte linha do tempo (consulte a Figura 3 para obter exemplos de estágios da história de vida do desenvolvimento).NOTA: Esporos sedimentados são observados em 0-1 d. Os esporos podem germinar em poucas horas, como demonstrado pela formação de um tubo germinativo. A germinação é tipicamente observada a 1-2 d. Os gametófitos iniciais são tipicamente observados em 1-4 d. A gametogênese, processo pelo qual as células sofrem divisão e diferenciação para formar gametas masculinos e femininos, é tipicamente observada nas primeiras duas semanas. As células femininas são 5-7 vezes maiores que as masculinas. Os gametófitos masculinos crescem ramos finos e filamentosos, enquanto as fêmeas são mais redondas ou ovoides. As fêmeas normalmente produzem ovos ou óvulos dentro de 2-3 semanas. Os espermatozoides liberados dos machos nadam até as fêmeas e fertilizam os óvulos, resultando na formação de zigotos diploides. Ter a densidade de inoculação correta garantirá o sucesso da reprodução por proximidade38,39. Ovos fertilizados se desenvolvem em esporófitos embrionários. Esporófitos são tipicamente observados dentro de 2-4 semanas. O zigoto sofre rápida divisão celular, resultando no crescimento de lâminas de 1-2 cm dentro de aproximadamente 6-8 semanas. Após duas semanas, monitorar pelo menos duas lâminas de vidro aleatórias 1-2 vezes por semana para crescimento saudável e contaminação até que os esporófitos atinjam 1-2 cm de tamanho.NOTA: O crescimento saudável é caracterizado pela coloração marrom-dourada (em oposição ao verde ou transparente). Existem várias métricas quantitativas que podem ser observadas em lâminas de vidro com microscópio invertido, incluindo sobrevivência, taxa de germinação, desenvolvimento vegetativo, maturidade e fecundidade reprodutivas e razão sexual40. Avalie a contaminação por bactérias, fungos, ciliados e diatomáceas com um microscópio. Remover a contaminação isolada. Controlar os sinais precoces de contaminação por diatomáceas com o tratamento com dióxido de germânio (GeO2) (ver Secção 8.3). 8. Manutenção Ajustar as condições de luminosidade de acordo com o ponto 6.3. Toda semana, troque os meios de crescimento para repor os nutrientes e minerais necessários para o crescimento de M. pyrifera .Resfriar os meios de crescimento frescos até a temperatura adequada. Certifique-se de que a temperatura não exceda 15 °C durante este processo. Sifão para fora dos recipientes de cultivo para evitar perturbar os substratos semeados. Deixe a mídia escorrer até que o recipiente esteja quase vazio. Atualize a mídia imediatamente para minimizar a dessecação. Ao reabastecer recipientes de crescimento, incline-os levemente para que a mídia corra pela lateral do recipiente de cultivo para perturbar minimamente os substratos. Reorganize aleatoriamente as posições do recipiente ou da cuba durante as mudanças semanais de mídia para levar em conta as diferenças na irradiância da luz.NOTA: Consulte Arquivo Suplementar 1 para obter um calendário para rastrear atividades e expectativas para culturas de Macrocystis. Ele indica o tempo de ajustes de luz e aeração, bem como mudanças semanais de mídia. Opcionalmente, controlar a contaminação por diatomáceas com um tratamento de dióxido de germânio (GeO2). Adicionar 0,3-0,5 mL de 250 mg/mL de GeO2 a cada 1 L de água do mar adicionado aos substratos semeados para reduzir a contaminação generalizada por diatomáceas.NOTA: GeO2 pode inibir a produção de gametas de algas. Aplicar um tratamento de GeO2 na janela curta após a germinação e antes dos picos de produção de óvulos e espermatozoides (1-7 d) e/ou após a fertilização dos óvulos e observações de esporófitos (>21 d), seguido de uma mudança de meio 48 h após a remoção do produto químico. Esses prazos podem variar de acordo com as condições de cultura, portanto, monitorar o desenvolvimento do estágio de vida com microscopia é a melhor maneira de avaliar o tempo de aplicação do GeO2 . Se a contaminação por diatomáceas persistir nos recipientes de cultura e for observado crescimento excessivo em algas em estágio inicial, considere a resemeadura dos substratos. 9. Cultivo vegetativo de gametófitos de algas gigantes Propagar culturas de gametófitos em condições vegetativas durante todo o ano para reduzir a dependência da coleta sazonal de esporofilos do recife natural.Armazenar culturas de gametófitos de acordo com a população fonte em frascos preenchidos com meios de crescimento a 4-12 °C em luz vermelha a uma intensidade de 5-20 μmol fóton m-2 s-1 em um ciclo de 12 claros: 12 escuros. Fornecer aeração constante e troca de mídia a cada 2-6 meses. Para aumentar a biomassa de gametófitos que têm crescido assexuadamente para uso na semeadura de ‘cascalho verde’, aumentar a aeração para suspender gametófitos, aumentar a frequência de mudanças de meios para semanalmente e fragmentar gametófitos a cada duas semanas.Suspender a biomassa de gametófitos no frasco de cultura agitando ou agitando e raspar as laterais do frasco de cultura com uma ferramenta estéril para desalojar os gametófitos aderidos, se necessário. Despeje os gametófitos suspensos em um liquidificador estéril ou moedor de café e pulse a solução gametófita por 1-2 s aproximadamente 5-15 vezes, dependendo da concentração de biomassa, até que nenhuma massa aglomerada seja visível. Para induzir a reprodução para semeadura de cascalho verde, fragmentar gametófitos, como explicado acima. Em seguida, inocular substrato e aumentar a luz LED de espectro total de 5-20 para 45-60 μmol fóton m-2 s-1 (+10 μmol fóton m-2 s-1 diariamente para foto-aclimatação), em seguida, aumentar em 10-20 μmol fóton m-2 s-1 a cada 3-4 d até atingir uma irradiância de 180 μmol fóton m-2 s-1. 10. Implantação Após 6-8 semanas de cultivo em laboratório, certifique-se de que os esporófitos juvenis tenham 1-2 cm de comprimento e estejam prontos para implantação (Figura 4). Atualize a mídia de crescimento em contêineres de cultura 24 h antes da implantação. Obter as licenças necessárias para implantação de cascalho que atendam às leis e regulamentos locais. Isso pode ser uma parte demorada do processo de cultivo e deve ser incorporado aos cronogramas do projeto. Transporte ‘cascalho verde’ em bandejas cobertas com toalhas embebidas em água do mar para manter a alga hidratada. Coloque as bandejas em caixas térmicas isoladas com gelo, garantindo que elas não estejam em contato direto com o gelo. Certifique-se de que o “cascalho verde” está bem embalado para evitar o rolamento dos substratos e o desprendimento de esporófitos durante o transporte.NOTA: Dependendo da disponibilidade de espaço, os substratos também podem ser transportados em seus recipientes de cultura ou cubas para reduzir o manuseio. Transporte ‘cascalho verde’ por até 6 h em um refrigerador sombreado. A implantação deve ser cronometrada para evitar a luz solar mais direta. Se estiver implantando a partir de um barco, utilize uma estrutura sombreada para evitar o sol direto durante o processo de implantação. Espalhe cuidadosamente o “cascalho verde” da superfície para o recife abaixo ou via SCUBA ao testar em novos locais e em pequenas escalas.

Representative Results

A técnica de restauração de cascalho verde ainda está em fase piloto, com dados limitados de sobrevivência de plantões para outras espécies28, e ainda não há dados publicados para Macrocystis pyrifera. Usando a coleta de campo e a manutenção laboratorial descritas neste protocolo, testamos a significância das condições de criação sítio-específicas para duas populações distintas de algas doadoras antes da hipotética implantação de “cascalho verde” (Figura 5). O tecido reprodutivo das algas marinhas foi coletado na Califórnia (EUA) de populações K1 mais frias (Santa Cruz 36,60167°N, 121,88508°W) e K4 mais quentes (San Diego, 32,85036°N, -117,27600°W) e criadas em duas temperaturas: (1) 12 °C (temperatura padrão de cultivo para aquicultura de algas marinhas e TSM média de inverno para K1) e (2) 20 °C (TSM média de verão para K4, e uma onda de calor de 4 °C para K1). Todas as lâminas de vidro utilizadas para monitorar o desenvolvimento do estágio de vida das algas foram marcadas com uma grade padronizada, e imagens de alta resolução foram capturadas usando essa grade como referência para permitir a observação de campos fixos ao longo do tempo usando um microscópio invertido e uma câmera (N = 5 imagens por amostra, 2,479 mm x 1,859 mm). Após 24 dias após a esporulação, os gametófitos foram contados a partir de imagens de microscópio (N = 300 imagens de 60 amostras). Para testar diferenças na contagem de gametófitos, modelos lineares generalizados de efeitos mistos foram empregados com distribuição de Poisson usando a função glmmTMB() no pacote glmmTMB41, e comparações pareadas foram realizadas com emtrends() do pacote emmeans42em R. Nossos resultados ilustram que a resposta dos gametófitos à variabilidade térmica foi diferente entre as populações K1 e K4 (t = 2,7, p = 0,007), onde a temperatura não teve efeito para a população K4 mais quente (estimativa = -0,01, erro padrão [EP] = 0,01, intervalo de confiança [IC] = [-0,03, 0,01]), mas teve efeito para a população K1 mais fria (estimativa = -0,06, SE = 0,02, IC = [-0,10, -0,03]) (Figura 6A), sugerindo uma possível divergência adaptativa nas características de tolerância térmica. Os gametófitos de Kelp são frequentemente descritos como um estágio de resistência43, o que significa que eles produzem um fenótipo para todos os fins que é tolerante ao estresse e relativamente insensível à variabilidade ambiental. No entanto, esses resultados indicam que a variabilidade térmica impõe uma pressão significativa nessa fase inicial. Após 32 dias após a esporulação, esporófitos visíveis com comprimentos superiores a aproximadamente 1 mm foram contados na totalidade de cada lâmina de vidro de 2,5 cm por 7,5 cm (N = 72 amostras totais). Para testar diferenças na contagem de esporófitos visíveis, modelos lineares generalizados de efeitos mistos foram empregados com distribuição de Poisson usando a função glmmTMB() no pacote glmmTMB e comparações pareadas foram realizadas com emtrends() de emmeans de pacote em R. Nossos resultados ilustram que a resposta dos esporófitos à variabilidade térmica é semelhante entre populações diferenciadas K1 e K4 (z = 0,92, p = 0,36), onde a temperatura teve efeito para a população K4 mais quente (estimativa = -0,66, SE = 0,04, IC = [-0,74, – 0,57]), bem como para a população K1 mais fria (estimativa = -0,85, SE = 0,13, IC = [-1,10, -0,60]) (Figura 6B). As amostras criadas a 20 °C cresceram poucos esporófitos visíveis (média ± SE = 0,4 ± 0,2) em comparação com aquelas criadas a 12 °C (média ± EP = 82,4 ± 9,8). Este resultado sugere que a produção de esporófitos é mais sensível à temperatura do que o estádio gametófito, e que as temperaturas de cultivo sítio-específicas não devem exceder 15 °C para alcançar o desenvolvimento esporófito, conforme descrito no protocolo. Figura 1: Diagrama do sistema de incubadora de cascalho verde . (A) Fonte de luz vermelha para culturas de gametófitos de volume vegetativo. (B) Porta de acesso para fios elétricos e tubulações, levando a uma tomada externa. (C) Estrutura para bloquear a luz de espectro total da seção de luz vermelha. (D) Uma seção de cultivo de “cascalho verde”. (E) fontes luminosas de espectro total. (F) Linhas de tubulação conectadas a uma fonte de ar filtrada externa. (G) Válvulas de retenção para reduzir a contaminação transportada pelo ar. (H) Recipientes de cultura individuais que minimizam a contaminação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Diagrama do sistema de banho-maria de cascalho verde . (A) Chiller com bomba submersa (em I). (B) Banheira de 20 litros para banho-maria. (C) Dreno para recirculação em banho-maria. (D) Válvula para recirculação de banho-maria. (E) Fonte de luz. F) Recipiente de 2,5 L «cascalho verde» com tampa transparente e abertura de aeração. (G) Fonte de aeração. (H) Tubulações que recirculam água com uso de bombas submersas. (I) Receptor de banho-maria de/para chiller de/para banheiras com bombas submersíveis. (J) Cobertura de acrílico para minimizar a evaporação em banho-maria. (K) Sombra de malha para ajustar a intensidade da luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Desenvolvimento de Macrocystis pyrifera . Estágios da história de vida de desenvolvimento de Macrocystis pyrifera a partir de ensaios de crescimento em laboratório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Cascalho verde semeado com Macrocystis pyrifera. ‘ Cascalho verde’ semeado com Macrocystis pyrifera é cultivado em laboratório até que os esporófitos atinjam 1-2 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Séries temporais experimentais. Imagens de exemplo de uma série temporal que acompanha o crescimento e desenvolvimento experimental de gametófitos e esporófitos de Macrocystis pyrifera originários de duas populações coletadas na Califórnia (EUA) e cultivadas em duas temperaturas diferentes. K1 = Santa Cruz, K4 = San Diego. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Resultados representativos. Estágios de vida de Macrocystis pyrifera observados para populações de origem K1 Santa Cruz San Diego K4 Santa Cruz cultivadas em condições térmicas constantes de 12 e 20 °C. Barras de erro, média ± 1 EP. Asterisk (*) denota diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05). (A) Gametófitos aos 24 dias (N = 300 imagens totais de 60 amostras). (B) Esporófitos visíveis aos 32 dias (N = 72 amostras, dentro de uma área padronizada de 2,5 cm por 7,5 cm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Arquivo Suplementar 1. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

As mudanças climáticas antropogênicas são uma ameaça crescente à saúde dos oceanos no mundo 44,45,46,47,48, resultando em grandes perturbações e perda de biodiversidade 49,50,51,52. Para acelerar a restauração de ecossistemas degradados, as Nações Unidas declararam de 2021 a 2030 a “Década das Nações Unidas sobre a Restauração de Ecossistemas”, coincidindo com a “Década das Nações Unidas da Ciência Oceânica para o Desenvolvimento Sustentável”, que visa reverter a deterioração da saúde dos oceanos53. Em linha com este apelo global à ação, a Kelp Forest Alliance lançou o Kelp Forest Challenge para restaurar 1 milhão de hectares e proteger 3 milhões de hectares de florestas de algas até o ano de 204054. A restauração marinha é subvalorizada55, e os ecossistemas de algas recebem consideravelmente menos atenção do que habitats como recifes de coral, florestas de mangue e prados de ervas marinhas56. A restauração de ecossistemas degradados tem se mostrado eficaz na reconstrução de ecossistemas marinhos, mas pode custar, em média, entre US$ 80.000 e US$ 1.600.000 por hectare, com custos totais médios provavelmente duas a quatro vezes maiores57. As perdas atuais e projetadas exigem o desenvolvimento de metodologias escaláveis, viáveis e econômicas de restauração de algas marinhas como intervenções urgentes de conservação.

Os esforços atuais de restauração de algas usam uma combinação de metodologias para abordar fatores específicos de perda de algas, incluindo transplante de algas adultas, semeadura direta de zoósporos e/ou gametófitos, controle de pastejo e instalação de recifes artificiais11. No entanto, esses métodos exigem recursos substanciais e têm escalabilidade limitada. O transplante típico de algas adultas requer a trabalhosa implantação de materiais ou estruturas artificiais nos bentos, por mergulhadores. Intervenções bottom-up para restabelecer recifes rochosos costeiros, como o controle de competidores e pastadores, também são restringidas pelos custos de mão de obra, pois dependem da remoção subaquática manual ou exclusão desses estressores bióticos11. A técnica de “cascalho verde” supera essas limitações com a implantação simples a partir da superfície, não exigindo instalação subaquática ou conhecimento técnico e escalabilidade a custos relativamente baixos28. Essa abordagem inovadora fornece uma ferramenta de restauração promissora, incentivando testes extensivos em diversos locais e ambientes para desbloquear todo o seu potencial32.

Embora esforços bem-sucedidos de restauração com “cascalho verde” tenham sido documentados em fiordes abrigados na Noruega usando a alga açucareira, Saccharina latissima26, esta técnica ainda está em fase piloto para Macrocystis pyrifera no Pacífico Oriental. Ensaios adicionais são necessários para abordar a sobrevivência esperada de plantas externas de M. pyrifera dentro de sua área de distribuição. Em condições de exposição à onda típicas do crescimento de M. pyrifera , cascalhos menores podem ser mais propensos ao movimento e à abrasão, levando a plantas externas danificadas. Além disso, a flutuabilidade positiva proporcionada por pneumatocistos de M. pyrifera preenchidos com gás pode levar a que as plantas de cascalho verde sejam efetivamente levadas para longe do local de restauração e, portanto, o tamanho e o peso da brita são fatores importantes a serem explorados para esta espécie. Em um estudo piloto recente (maio de 2022; Ensenada, Baja California, México), foi observado sucesso preliminar no campo com M. pyrifera , indicado pela fixação de hapteros ao substrato circundante e crescimento de juvenis que atingiram 1,2 m de comprimento após dois meses no campo (Figura 4). Isso demonstra uma oportunidade clara que ainda precisa ser explorada na utilização de “cascalho verde” para M. pyrifera no Pacífico Oriental. Este vídeo mostra a técnica de “cascalho verde” com M. pyrifera e é um recurso valioso que simplifica e centraliza as práticas existentes na fase de cultivo da restauração para apoiar estudos que abordam sucessos e limitações em diferentes configurações de campo.

Com a técnica de “cascalho verde“, muitas unidades de cascalho menores e individuais podem ser semeadas em uma escala que pode aumentar a probabilidade de sucesso em comparação com abordagens de transplante mais comuns com plantas adultas. No entanto, o principal aspecto escalável desta técnica é a sua simples implantação a partir da superfície, o que pode facilitar a restauração de grandes áreas por barco. Para ambientes de campo onde a implantação de cascalho pequeno não é adequada, este protocolo pode ser adaptado para transplantar M. pyrifera em uma ampla gama de substratos, incluindo cascalho maior ou mesmo pedregulhos pequenos, corda que pode ser amarrada a âncoras subaquáticas naturais ou implantadas, ou telhas que podem ser aparafusadas ou coladas usando epóxi marinho no fundo do mar em condições mais expostas. Essas adaptações de implantação não alterarão as instalações necessárias para o cultivo de M. pyrifera , mas aumentarão subsequentemente o custo de implantação.

As perturbações antropogénicas e as alterações climáticas estão actualmente a superar a capacidade de adaptação das populações naturais. Isso coloca desafios significativos aos esforços tradicionais de conservação que restauram os ecossistemas aos seus estados históricos 58,59,60,61,62,63. Assim, os marcos conservacionistas têm se expandido para incluir o manejo antecipatório considerando resiliência e capacidade adaptativa64. O manejo antecipatório para enfrentar as mudanças climáticas está sendo implementado para espécies arbóreas em ecossistemas florestais65 e tem sido proposto para esforços adicionais de restauração para aumentar o potencial evolutivo dos plantõesexternos 66,67. Embora essas estratégias sejam inerentemente mais fáceis de manipular em ambientes terrestres, vários estudos estão começando a explorar sua aplicação em ambientes marinhos 62,68,69,70. Por exemplo, os recifes de coral estão ameaçados por numerosos estressores antropogênicos que resultaram em declínios sem precedentes71,72. Em resposta às perdas dessas importantes espécies de fundação, técnicas de restauração ativa e adaptação assistida são cada vez mais defendidas para conservar os recifes de corais remanescentes e suas funções associadas 62,73,74. Uma técnica envolve a translocação de indivíduos dentro de sua faixa de distribuição atual para aumentar a tolerância ao estresse térmico75. Em relação à restauração de algas formadoras de dossel, a brita verde possui uma estrutura personalizável para explorar técnicas de adaptação assistida, como translocação de genótipos resilientes para áreas vulneráveis, manipulação não genética, como hibridização, ou aclimatização de indivíduos ao estresse ambiental62, com resultados que visam à obtenção de linhagens mais resistentes para programas de restauração76,77.

Aproveitar o apoio local para melhorar os esforços de restauração é crucial para sustentar o sucesso da conservação do ecossistema de algas. O envolvimento das partes interessadas locais pode aumentar a adesão local às necessidades de restauração 6,50 e promover a gestão costeira que poderia subsequentemente resultar em maior financiamento e longevidade da proteção do ecossistema de algas. Tal como acontece com todas as outras metodologias de restauração de algas, estruturas estruturadas de tomada de decisão que integram diversos objetivos ecológicos, socioeconômicos e de conservação ajudarão a alcançar resultados ótimos para os ecossistemas de algas e as comunidades que eles apoiam11.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo California Sea Grant Kelp Recovery Research Program R/HCE-17 para JBL e MESB, um prêmio de estágio de pesquisa da National Science Foundation DGE-1735040 para PDD, The Nature Conservancy, Schmidt Marine Technology Partners, Sustainable Ocean Alliance, Tinker Foundation para AP-L e The Climate Science Alliance Baja Working Group para RBL e JL. Agradecemos a Steven Allison, Cascade Sorte, Samantha Cunningham, Sam Weber e Caitlin Yee da Universidade da Califórnia, Irvine; Mark Carr, Peter Raimondi, Sarah Eminhizer, Anne Kapuscinski da Universidade da Califórnia, Santa Cruz; Walter Heady e Norah Eddy na The Nature Conservancy; Filipe Alberto e Gabriel Montecinos, da Universidade de Wisconsin, Milwaukee; Jose Antonio Zertuche-González, Alejandra Ferreira-Arrieta e Liliana Ferreira-Arrieta na Universidad Autónoma de Baja California; Luis Malpica-Cruz, Alicia Abadía-Cardoso e Daniel Díaz-Guzmán, do MexCal; os mergulhadores MexCalitos Alejandra Reyes, Monica Peralta, Teresa Tavera, Julia Navarrete, Ainoa Vilalta, Jeremie Bauer e Alfonso Ferreira; e Nancy Caruso pela assessoria técnica. Agradecemos ao Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California por fornecer instalações usadas para desenvolver o sistema de banho-maria. Agradecemos a Ira Spitzer pelo conteúdo de vídeo subaquático e de drones.

Materials

0.22 µm filters Milipore SCGPS05RE Natural seawater sterilization
1 L glass bottles Amazon B07J6JP4D1 Natural seawater sterilization
1 µm filters (water + air) Amazon B01M1VWUWL Natural seawater sterilization
1'' PVC 90-Degree Elbow Home Depot 203812125 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
10 µm filters Amazon B00D04BG56 Natural seawater sterilization
20 µm filters Amazon B082WS9NPH Natural seawater sterilization
3x5mm tubing Amazon B0852HXPN6 Option 1 Small scale – Incubator
4×4'' Sterile Gauze Amazon B07NDK8XM3 Sporulation
4x6mm tubing Amazon B08BCRV1FY Option 1 Small scale – Incubator
5 µm filters Amazon B082WS9NPH Natural seawater sterilization
50 mL falcon tubing Amazon B01M04HGPJ Sporulation
8x10mm tubing Amazon B01MSM3LLZ Option 1 Small scale – Incubator
Air filters Thermo Fisher MTGR85010 Option 1 Small scale – Incubator
Alcohol lamp Amazon B07XWD9WWC Sporulation
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate ACS reagent, 99% Sigma 215406-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Aquarium Grade Gravel Amazon B07XRCKFBJ Option 1 Small scale – Incubator
Biotin powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 99% Sigma B4639-100MG Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Boric Acid, 99.8%, 10043-35-3, MFCD00011337, BH3O3, 61.83, 500g Thermo Fisher 5090113707 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Calcium D-Pantothenate,ge98.0% (T),C9H17NO5,137-08-6,25g,D-Pantothenic Acid Calcium Salt, P0012-25G 1/EA Thermo Fisher P001225G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Check valves Amazon B08HRZR4MM Option 1 Small scale – Incubator
Clear tubing 3/8'' – 10 ft Amazon B07MTYMW13 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
COBALT(II) SULFATE HEPTAH-100G, WARNING – California – Cancer Hazard, 93-2749-100G 1/EA Thermo Fisher 5090114752 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Compound microscope with camera OMAX M83EZ-C50S Monitoring
Culture flask Thermo Fisher 07-250-080 Option 1 Small scale – Incubator
Culture light Amazon B07RRRPJ63 Option 1 Small scale – Incubator
Culture stoppers Amazon B07DX6J7QD Option 1 Small scale – Incubator
Drainage connector Amazon B00GUZ6CV0 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
EDTA CAS Number: 6381-92-6 Molecular Formula: C10H14N2O8Na2- 2H2O Molecular Weight: 372.2 Thermo Fisher 50213299 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Graduations: 0.2 mL, 0.5 mL, 1.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.10 mL, 0.17 mL, 0.25 mL Thermo Fisher S81273 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 50 mL, 100 mL, 250 mL, Graduations: 1.0 mL, 1.0 mL, 2.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.25 mL, 0.50 mL, 1.0 mL Thermo Fisher S81275 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Volumetric Flask Sets – Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Closure Material: Glass, Closure Size: Stopper Number: 9, 9, 13, Closure Type: Penny Stopper, Graduated: Ye Thermo Fisher S81271 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Filter holder Amazon B07LCKBKCT Natural seawater sterilization
Fisherbrand Graduated Cylinders, Capacity: 500 mL, Graduations: 5 mL, Borosilicate Glass, Autoclavable: Yes, Limit of Error: +/-4.0 mL, Recommended Applications: Education, Subdivision: 5 mL, S63460 1/EA Thermo Fisher S63460 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
FLEXACAM C1 Camera Leica FLEXACAM C1 Monitoring
Folic acid, C19H19N7O6, CAS Number59303, vitamin m, pteroylglutamic acid, vitamin b9, folvite, folacin, folacid, pteroyllglutamic acid, pteglu, folic acid, folate, 25g, 100781, CHEBI:27470, Yellow to Orange, 2004190, 441.41, OVBPIULPVIDEAOLBPRGKRZSAN Thermo Fisher AAJ6083314 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Free Standing 20 Gallon Utility Sink Amazon B094TLH19L Option 2 – Medium scale – Water bath systems
GERMANIUM DIOXIDE 99.99 10GR Thermo Fisher AC190000100 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass Graduated Cylinders, Class A Round Base, Eisco, For Use With: Measuring liquids, Capacity: 1000 mL, Graduations: 10 mL White, CH0344OWT 1/EA Thermo Fisher S88442 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass slides Amazon B00L1S93PS Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Glycerol phosphate disodium salt hydrate isomeric mixture Sigma G6501-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Growth containers -3.4 Qt- 3.25 Lt transparent containers with transparent lid Container store #10014828 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Growth light Amazon B086R14MFW Option 1 Small scale – Incubator
Hemocytometer Amazon B07TJQDKLJ Sporulation
HEPES 99.5% (titration) Sigma H3375-500G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Hinged plastic jars SKS Bottle & Packaging 40280125.01S Option 1 Small scale – Incubator
Inositol research grade, USP/NF For bacteriology. Optically inactive. Tested for its suitability in tissue culture. Size – 100G Storage Conditions – +15 C TO +30 C Catalog Number – 26310.01 CAS 87-89-8 Thermo Fisher 50247745 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Instant Ocean – 50 G Amazon B000255NKA Option 1 Small scale – Incubator
Inverted Microscope Leica DMi1 Leica DMi1 Monitoring
Iron(III) chloride hexahydrate ACS reagent, 97% Sigma 236489-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Licor Ligth Meter Data Logger Licor LI-250A Monitoring
Light/temperature HOBO data logger Amazon B075X2SWKN Monitoring
Lights 150W Amazon B0799DQM9V Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Manganese sulfate monohydrate meets USP testing specifications Sigma M8179-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Medium size rocks 2-3 inch, 20 pounds Home Depot 206823930 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Nicotinic Acid, 99%, C6H5NO2, CAS Number59676, daskil, apelagrin, acidum nicotinicum, akotin, 3carboxypyridine, niacin, 3pyridinecarboxylic acid, nicotinic acid, pellagrin, wampocap, 250g, 109591, CHEBI:15940, 1.4, 2004410, 293 deg.C (559 deg.F), 123.11, Thermo Fisher AAA1268330 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
p-Aminobenzoic acid 99.82% 4-aminobenzoic acid, C7H7NO2, CAS Number: 150-13-0, 25g, 0210256925 1/EA Thermo Fisher ICN10256925 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
PCV cement Amazon B001D9WRWG Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve Amazon B0006JLVE4 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve Amazon B07G5FY7X1 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Precision scale 1mg Amazon B08DTH95FN Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Pump for filtered air Amazon B0BG2BT9RX Option 1 Small scale – Incubator
PVC tubing 1×24'' Home Depot 202300505 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Quantum Light meter Apogee Instruments MQ-510 Monitoring
Refrigerated Incubator Thermo Fisher 15-103-1566 Option 1 Small scale – Incubator
Rubber Grommets Amazon B07YZD22ZP Option 1 Small scale – Incubator
Salinity refractometer ATC B018LRO1SU Monitoring
Shade mesh 6×50 ft Home depot 316308418 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Sodium Nitrate ge 99.0% Nitric Acid, Sodium Salt, NNaO3, CAS Number: 7631-99-4, 500g, 1/EA Thermo Fisher BP360500 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Soldering for aeration opening Amazon B08R3515SF Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Spray isporopyl alcohol Amazon ‎ B08LW5P844 Sporulation
Stainless steel sissors Amazon B07BT4YLHT Sporulation
Stainless steel tray Amazon B08CV33YXG Sporulation
Stainless steel twizzers Amazon B01JTZTAJS Sporulation
Stir Bars Amazon B07C4TNKXB Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Submersible circulation pump 400 GPH Amazon B07RZKRM13 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Submersible Spherical Quantum Sensor Waltz US-SQS/L Monitoring
Temperature gun Infrared Thermometer 749 B07VTPJXH9 Monitoring
Thiamine hydrochloride BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture Sigma T1270-25G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Thymine 99% 2, 4-Dihydroxy-5-methylpyrimidine, C5H6N2O2, CAS Number: 65-71-4, 25g, 157850250 1/EA Thermo Fisher AC157850250 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Transparent Acrylic sheet 24×48 inch Home Depot 202038048 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Tubing water circulation 1''x10 ft Amazon B07ZC1PSF3 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
UV light for natural seawater sterilization Amazon B018OI7PYS Natural seawater sterilization
Vacum pump Amazon B087XBTPVW Natural seawater sterilization
Vitamin B12 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 98% Sigma V6629-100MG Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 1000 mL, CH0446IWT 1/EA Thermo Fisher S89446 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 500 mL, CH0446HWT 1/EA Thermo Fisher S89445 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Water Chiller 200-600GPM Amazon B07BHHP71C Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Y-splitters for 4x6mm tubing Amazon B08XTJKFCH Option 1 Small scale – Incubator
Zinc sulfate heptahydrate BioReagent, suitable for cell culture Sigma Z0251-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
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References

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Dawkins, P. D., Paz-Lacavex, A., Fiorenza, E. A., Rush, M. A., Beas-Luna, R., Lorda, J., Malpica-Cruz, L., Sandoval-Gil, J. M., McHugh, T. A., Han, M. K., Bracken, M. E. S., Lamb, J. B. Field Collection and Laboratory Maintenance of Canopy-Forming Giant Kelp to Facilitate Restoration. J. Vis. Exp. (208), e66092, doi:10.3791/66092 (2024).
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