JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Полевой сбор и лабораторное обслуживание гигантской ламинарии, образующей полог, для содействия восстановлению

Published: June 07, 2024
doi:
10.3791/66092
, , , , , , , , , , ,
1Department of Ecology and Evolutionary Biology,University of California, Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology,University of California, Santa Cruz, 3Facultad de Ciencias Marinas,Universidad Autónoma de Baja California, 4Facultad de Ciencias,Universidad Autónoma de Baja California, 5Instituto de Investigaciones Oceanológicas,Universidad Autónoma de Baja California, 6The Nature Conservancy

Summary

В этом протоколе описывается сбор в полевых условиях и регулярное лабораторное обслуживание субстратов, засеянных гигантской ламинарией, образующей полог, для использования в восстановительных испытаниях с целью устранения успехов и ограничений метода «зеленого гравия» в полевых условиях.

Abstract

Ламинарии, образующие растительный полог, являются важнейшими основными видами, поддерживающими биоразнообразие и предоставляющими экосистемные услуги на сумму более 500 миллиардов долларов США в год. Глобальное сокращение гигантских лесов ламинарии из-за экологических стрессоров, вызванных климатом, подчеркивает необходимость инновационных стратегий восстановления. Новый метод восстановления, известный как «зеленый гравий», направлен на посев молодых водорослей на больших площадях без значительных подводных работ и представляет собой многообещающий инструмент восстановления благодаря экономической эффективности и масштабируемости. В этой видеостатье показан протокол и инструменты для культивирования гигантской ламинарии Macrocystis pyrifera. Он также предоставляет ресурс для дальнейших исследований, направленных на изучение успехов и недостатков этого метода в полевых условиях. Мы описываем полевые и лабораторные методы сбора репродуктивной ткани, споруляции, инокуляции, выращивания, ухода и мониторинга субстратов, засеянных на ранних стадиях жизни, с использованием метода «зеленого гравия». Протокол упрощает и централизует существующие методы восстановления в этой области, чтобы помочь исследователям, менеджерам и заинтересованным сторонам в достижении целей по сохранению ламинарии.

Introduction

Ламинарии, образующие полог (бурые макроводоросли порядка Laminariales), являются глобально важными основными видами, доминирующими на прибрежных скалистых рифах в умеренных и арктических морях1. Эти ламинарии образуют структурно сложные и высокопродуктивные биогенные местообитания, известные как леса ламинарии, которые поддерживают таксономически разнообразные морские сообщества2. Леса ламинарии во всем мире предоставляют человеку множество экосистемных услуг, включая коммерческое рыболовство, круговорот углерода и питательных веществ, а также рекреационные возможности, с общей оценочной стоимостью 500 миллиардов долларов СШАв год3.

Несмотря на свою значительную ценность, леса ламинарии во многих регионах сталкиваются с растущей антропогенной нагрузкой3. Изменение климата представляет собой одну из наиболее значительных угроз для ламинарии из-за долгосрочного потепления океана в сочетании с увеличением частоты температурных аномалий 3,4,5,6,7. Повышение температуры океана связано сограничением питательных веществ8, в то время как воздействие теплового стресса, превышающего физиологические пороговые значения, может привести ксмертности9. В сочетании с различными региональными локальнымистрессорами7 популяции ламинарии сокращаются во всем мире примерно на 2% вгод10 со значительными потерями и устойчивыми сдвигами в альтернативные состояния сообществ в определенных регионах 6,11,12,13,14. Одного только естественного восстановления популяций ламинарии может быть недостаточно для того, чтобы обратить вспять масштабы текущих и прогнозируемых потерь15,16,17,18, что подчеркивает важность активного восстановления.

В настоящее время усилия по восстановлению ламинарии могут использовать комбинацию методологий для восстановления этих важных основных видов на прибрежных скалистых рифах 3,19. Методологии, выбираемые для решения проблем, связанных с конкретным объектом, зависят от географического контекста, конкретных препятствий на пути восстановления ламинарии и социально-экологического контекста11. Понимание связей и взаимозависимости социально-экологических систем является ключевым фактором, а мероприятия, в которых участвуют местные учреждения и которые получают поддержку со стороны местных общин, повышают вероятность успешных усилий по восстановлению20.

В дополнение к изменению климата, давление травоядных животных или межвидовая конкуренция стимулируют, снижают или подавляют восстановление (например, морскими ежами13, растительноядными рыбами21,22, торфяными водорослями 9,23 или инвазивными водорослями24). Восстановление может быть сосредоточено на устранении этих биотических стрессоров25, хотя эти методы требуют значительных ресурсов и постоянного обслуживания11. Для стимулирования восстановления видов ламинарии были предприняты усилия по прямому посеву, например, взвешивание сетчатых мешков, наполненных плодородными лезвиями ламинарии, до бентоса, который высвобождает зооспоры в окружающую среду26. Этот метод, однако, требует много времени и требует технической подводной установки и демонтажа. В других случаях основное внимание уделяется пересадке больших количеств целых взрослых донорских растений, что может поставить под угрозу тесно связанные и уязвимые популяции доноров и часто ограничивается небольшими масштабами из-за зависимости от постоянной трансплантации27.

Для регионов, где ограничение спор ламинарии может препятствовать восстановлению лесов ламинарии из-за фрагментации среды обитания, был внедрен относительно новый подход к восстановлению ламинарии, называемый техникой «зеленого гравия». Этот метод был успешно опробован на научно-исследовательской станции Флёдевиген на юге Норвегии28 и представлял собой многообещающий вариант для восстановления из-за экономической эффективности и масштабируемости. Рабочий процесс этого метода выглядит следующим образом: (1) споровый раствор создается из плодородной ткани, собранной с репродуктивных взрослых ламинариев в поле, а затем высевается на небольшие субстраты, такие как гравий; (2) ламинария на ранних стадиях выращивания выращивается в контролируемых лабораторно абиотических условиях на субстратах; (3) Субстраты с видимыми спорофитами размещаются в полевых условиях на определенных рифах в виде «зеленого гравия», где спорофиты продолжают расти. Обратите внимание, что типичные усилия по пересадке взрослых особей требуют трудоемкой и экономичной подводной установки водолазами, а метод «зеленого гравия» использует простое развертывание с поверхности28.

Метод «зеленого гравия» в настоящее время опробован членами многочисленных международных рабочихгрупп29 в различных условиях и несколькими видами ламинарии. В этом протоколе описываются необходимые средства, материалы и методы для сбора тканей, спороношения, посева, условий выращивания, регулярного обслуживания и мониторинга ламинарии на ранней стадии до развертывания этого метода восстановления в полевых условиях с использованием гигантской ламинарии Macrocystis pyrifera. Этот протокол является ценным ресурсом для исследователей, менеджеров и заинтересованных сторон, стремящихся получить представление об успехах и ограничениях этого метода с M. pyrifera в различных полевых условиях.

Protocol

Ткани ламинарии, используемые в соответствии с настоящим протоколом, были собраны и контролировались Департаментом рыбных ресурсов и дикой природы штата Калифорния в соответствии с разрешением S-202020004-20205-001. 1. Подготовка оборудования и материалов Убедитесь, что установки для культивирования ламинарии могут поддерживать температуру (10-15 °C), обеспечивать полный спектр света (фотоны 0-180 мкмоль м-2 с-1) и фильтровать аэрацию (размер пор 0,2 мкм). Используйте инкубаторные системы со встроенным выпускным отверстием или портом доступа для проводов и трубок, светильников и источника воздуха (рис. 1). Если система инкубатора не входит в рамки проекта, бюджета или предполагаемого масштаба, используйте водяные бани, смягчаемые прохладной природной морской водой или чиллером (рис. 2). Обратитесь к таблице материалов для получения более подробной информации.Поместите термометр в питательную среду или используйте температурный пистолет, чтобы убедиться, что температура составляет 10-18 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Температура выращивания составляет30 градусов в зависимости от места и сезона. Запрограммируйте полный спектр света на фотопериод 12 часов света: 12 часов темноты, изменив настройки времени на источнике света или используя механический таймер. Измерьте интенсивность света с помощью водонепроницаемого квантового измерителя фотосинтетически активного излучения (PAR) под поверхностью рядом с гравием и отрегулируйте с помощью источника света с регулируемой яркостью или путем наложения слоев целлофана (в случае культивирования вегетативных гаметофитов см. раздел 9) или сетки над источником света (подробнее о регулировке интенсивности света см. раздел 6.3). Обеспечьте надлежащую аэрацию с помощью воздушных насосов31 через сутки после спороношения. Используйте фильтры (размер пор 0,2 мкм), чтобы уменьшить бактериальное загрязнение воздуха.ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования «зеленого гравия» давление аэрации должно быть достаточным для циркуляции воды во всех контейнерах для культуры, не нарушая при этом прикрепления ламинарии на ранней стадии к засеянным субстратам. При наличии объемной биомассы гаметофита (см. Раздел 9.2) давление аэрации должно быть достаточным для поддержания гаметофитов во взвешенном состоянии в питательной среде. Стерилизуйте материалы и станции. Подготовьте их заранее (см. Таблицу материалов).Очистите поверхности, используя 70% изопропиловый спирт. По возможности обрабатывайте репродуктивные ткани сори и очищайте оборудование для сбора за пределами питомника «зеленого гравия». Используйте следующие методы стерилизации: промывка лабораторным моющим средством с последующим тщательным ополаскиванием дистиллированной водой, замачивание в разбавленном растворе отбеливателя (в соответствии с инструкциями производителя) с последующим тщательным ополаскиванием дистиллированной водой и автоклавирование с использованием соответствующих настроек (стеклянная посуда или инструменты). После стерилизации материалы можно хранить в герметичной таре или обернуть фольгой. Вымойте и очистите контейнеры с крышками, которые будут использоваться для культивирования, с использованием лабораторного моющего средства с последующим тщательным ополаскиванием дистиллированной водой.ПРИМЕЧАНИЕ: Контейнеры для культур с крышками помогут уменьшить испарение питательной среды. Оставьте крышки слегка приоткрытыми, чтобы обеспечить воздухообмен, или используйте обратный клапан, чтобы уменьшить загрязнение воздуха. Если контейнеры с крышкой недоступны, запечатайте контейнеры для культур термопластичной пленкой, например, парафиновой пленкой, и сделайте 2-3 перфорации. Если используются резервуары большего размера, используйте крышки для защиты от испарения из прозрачного пластика. Убедитесь, что гравий имеет текстурированную или слегка ямчатую поверхность, так как гаметофиты с большей вероятностью будут задерживаться на субстратах с высокой складчатостью32,33. Потрите и промойте гравий, пока вода не станет прозрачной, чтобы удалить пыль или мусор. Замочите гравий в 10%-ном растворе хлорной извести не менее чем на 24 ч и промойте фильтрованной морской водой (см. раздел 2.1). В качестве альтернативы, после очистки и промывки, замочите гравий на 1 неделю в деионизированной (DI) воде32.ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале используется местный субстрат, чтобы уменьшить загрязнение места реставрации. В качестве альтернативы рекомендуется использовать гравий аквариумного качества. Избегайте известковых субстратов, таких как известняк, которые могут привести к обесцвечиванию тканей и последующей гибели пересаженных ламинарии32. 2. Приготовление питательной среды Фильтруйте и стерилизуйте морскую воду в соответствии со следующими методами, в зависимости от наличия ресурсов. Рассчитайте объем стерилизованной фильтром морской воды, необходимый для еженедельного обновления контейнеров для культур (см. Раздел 7), и запланируйте эту задачу фильтрации/стерилизации соответствующим образом. Храните большие партии отфильтрованной морской воды в темных емкостях до 6 месяцев при температуре 8-10 °C. Если холодильник недоступен, храните в темном, прохладном месте.Фильтруют воду с помощью вакуумной системы фильтрации с размером пор 0,55-1 мкм. Выключите источник вакуума до того, как вся вода будет пропущена, чтобы не повредить фильтр, и перелейте отфильтрованную воду в специальный стерильный контейнер. Для больших объемов используйте проточную систему фильтрации. Например, пропустите морскую воду через серию из трех гофрированных фильтров (10 мкм, 5 мкм и 1 мкм), расположенных от наибольшего до наименьшего размера пор.ПРИМЕЧАНИЕ: Если естественная морская вода недоступна, можно приготовить искусственную морскую воду. Кроме того, натуральную морскую воду можно приобрести в аквариумных магазинах оптом, и она часто фильтруется, дезинфицируется и балансирует pH. Для этих опций по-прежнему необходимо обогащение среды. Стерилизовать отфильтрованную морскую воду с помощью УФ-излучения и/или автоклавирования. Подключайте проточные системы к аквариумному ультрафиолетовому свету со скоростью потока, рекомендованной производителем. Автоклавная морская вода в автоклавной стеклянной посуде со слегка приоткрытыми крышками или покрытой фольгой и в жидком цикле (121°C; 1-2 PSI, 15-30 мин в зависимости от объема жидкости34.ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклавирование фильтрованной морской воды рекомендуется для ранних стадий культивирования. Обогащение стерилизованной фильтром морской воды питательными веществами и витаминами имеет решающее значение для роста M. pyrifera . Среда, обогащенная морской водой (PES) Provasoli, представляет собой широко используемую среду, предназначенную для культивирования водорослей35. Приобретайте эту среду в центрах культивирования водорослей. Препараты ПЭС и дополнительные витамины для роста M. pyrifera описаны в34.Обогатите каждый 1 л фильтрованной морской воды 20 мл PES. В качестве альтернативы можно использовать питательные среды промышленного уровня. Храните обогатительные растворы в соответствии с рекомендациями производителя. Обогащайте отфильтрованную морскую воду, когда это необходимо, чтобы избежать разложения обогатительных растворов. 3. Сбор полей Определить сроки сбора спорофиллов, чтобы имитировать естественный репродуктивный цикл локальных популяций M. pyrifera. Проконсультируйтесь с местными экспертами (например, исследователями ламинарии, менеджерами, экологами, гражданскими учеными, дайв-группами), чтобы определить подходящее время для сбора спорофилла. Получить необходимые разрешения на сбор тканей ламинарии, соответствующие местным законам и правилам. Это может быть трудоемкой частью процесса культивирования и должно быть включено в график проекта. С помощью автономного подводного дыхательного аппарата (АКВАЛАНГ) отобрать 3-5 лопастей спорофилла от 10-15 фертильных особей M. pyrifera с видимыми сори, расположенными на расстоянии не менее 2 м друг от друга. Выбирайте чистые и неповрежденные спорофиллы, если это возможно, практически без загрязнения или разложения. С этого момента храните стебли спорофилла отдельно в зависимости от родительской особи.ПРИМЕЧАНИЕ: Спорофиллы растут в плотной «юбке» у основания, над опорой взрослой ламинарии, и могут быть идентифицированы по отсутствию у них заполненных газом пневматоцист1. Зрелая ткань соруса часто слегка приподнята и имеет более темный цвет, чем окружающая ткань1. Транспортируйте лопасти спорофилла в темных мешках для сбора, чтобы избежать чрезмерного воздействия солнечных лучей, с минимальным количеством морской воды с участка, чтобы сохранить лопасти влажными, и храните в холодильниках при температуре около 12 °C до прибытия в место культивирования. Убедитесь, что образцы не находятся в прямом контакте со льдом.ПРИМЕЧАНИЕ: Спорофиллы могут быть отправлены в другие места или из других мест.Спорофиллы промыть морской водой. Оберните лезвия, собранные у одной особи M. pyrifera , влажными бумажными полотенцами, смоченными в морской воде, и снова алюминиевой фольгой, чтобы избежать проникновения света и дополнительного высыхания36. Такой способ хранения широко известен как «метод буррито». Поместите эти упаковки в холодильник со льдом с защитным барьером, таким как переработанная пузырчатая пленка или картон. Подготовьте охладитель к ночной отправке. Убедитесь, что кто-то может получить посылку, и поместите посылки в холодильные камеры. 4. Спороношение По возможности обрабатывайте спорофиллы в среде с контролируемой температурой 10-15 °C и вдали от любых других культур. Заранее подготовьте и стерилизуйте инструменты и станции. Надевайте защитные перчатки при работе с тканью ламинарии, чтобы уменьшить загрязнение. Опционально хранят спорофиллы в течение 12-48 ч в охлажденных условиях, стимулируя высвобождение спор из ткани соруса37. Для хранения используйте «метод буррито», описанный в разделе 3.3. Выберите созревшую ткань соруса и разрежьте ее на отрезки по 25см2 стерильными ножницами. Выберите 1-2 чистых участка сори от 10-15 отдельных родителей ламинарии, чтобы способствовать генетическому разнообразию.ПРИМЕЧАНИЕ: При хранении при необходимости найдите на бумажных полотенцах признаки частичного спороношения, указывающие на наличие фертильной ткани сора. Ткань соруса часто слегка приподнята и темнее по цвету, чем окружающая ткань. Для очистки аккуратно потрите обе стороны ткани соруса только в одном направлении стерильной марлей, смоченной в фильтрованной стерилизованной морской воде. При необходимости аккуратно соскребите ткань соруса стерильным лезвием бритвы, чтобы полностью удалить загрязнения. Погрузите секцию сори в пресноводную ванну на срок от 30 с до 1 минуты и промойте фильтрованной морской водой.ПРИМЕЧАНИЕ: Освежите ванну с пресной водой и стерилизуйте используемые материалы при работе с различными секциями сори от разных людей, чтобы уменьшить перекрестное загрязнение. Погрузите каждую секцию сори в стерилизованную фильтром морскую воду, темперированную до 10-15 °C, в стерильной центрифужной пробирке объемом 50 мл. Поместите пробирки при температуре 4-12 °C в темноту для спороношения максимум на 4 часа. Если холодильник недоступен, храните его в прохладном месте с низкой освещенностью.ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы срезы сори можно спорулировать в одном стерильном контейнере. С помощью составного микроскопа и гемоцитометра наблюдают за плотностью спор 3-4 образцов каждые 30 мин до 4 ч. Меняйте наконечники пипеток между образцами. Если плотность составляет не менее 10 000 спор мл-1 (см. Подраздел 5.1.1), переходите к следующему шагу. Если через 4 ч на участке сори споры не образуются, образец выбрасывают. Споры могут оседать в течение нескольких часов после высвобождения, но можно наблюдать, как они плавают круговыми движениями. Стерильным пинцетом выньте каждую секцию сори из трубок. Смешайте полученные споровые растворы в один стерилизованный контейнер и количественно определите окончательную комбинированную плотность. 5. Прививка Рассчитайте окончательный объем спорового раствора, необходимый для посева. Обеспечьте конечную концентрацию примерно 500-1000 спор мл−1 в контейнерах для культивирования.Чтобы рассчитать концентрацию объединенного спорообразного образца по счетчикам центральной сетки гемоцитометра, разделите количество на 10-4 мл (представляя собой объем раствора, рассматриваемого в гемоцитометре). Чтобы определить объем спорового раствора, добавляемого в каждую емкость, определите количество питательной среды, необходимой для погружения субстратов в контейнеры для культур. Чтобы найти общее количество спор в каждой емкости, умножьте этот объем морской воды на нужную концентрацию. Чтобы определить общий объем добавляемого спорового раствора, разделите общее количество спор на концентрацию спор на мл в споровом растворе. Поместите стерильные стеклянные предметные стекла в контейнеры для культивирования для наблюдения за развитием ламинарии. Включите не менее 30 слайдов, случайным образом распределенных по контейнерам культур для достаточного мониторинга (см. подробности в разделе 7). Рассчитанный объем спорового раствора высевают в культуральную емкость с помощью стерильного наконечника пипетки, содержащего субстраты, погруженные в питательную среду. Закройте емкость и аккуратно перемешайте, чтобы распределить споры. Запечатайте и поместите контейнер в культуральную систему. 6. Условия выращивания Установите температуру в диапазоне 10–15 °C в зависимости от температуры в месте развертывания. Через 1 день обеспечьте легкую аэрацию с помощью отфильтрованного источника воздуха. Установите светодиодные лампы полного спектра для водных растений на 12-часовой световой цикл: 12-часовой темный цикл, с интенсивностью света в диапазоне от 0 до 180 мкмоль фотон м-2 с-1:Установите интенсивность света на 5-10 мкмоль фотон м-2 с-1 с 0-1 дня и увеличьте до 20 – 30 мкмоль фотон м-2 с-1 до конца 1 недели. С этого момента увеличивайте освещенность на 10-20 мкмоль фотон м-2 с-1 каждые 3-4 дня до достижения излучения 180 мкмоль фотон м-2 с-1 в конце 6 недель. Продолжайте выращивание культур при 180 мкмоль фотон м-2 с-1 до конца 8 недель или когда спорофиты достигнут примерно 1-2 см в длину. 7. Мониторинг Отслеживайте по крайней мере два случайных предметных стекла ежедневно/через день в течение первых двух недель, чтобы оценить развитие.Для контроля обработайте предметное стекло стерилизованным пинцетом и поместите его в чистую чашку Петри, содержащую достаточное количество стерилизованной морской воды, чтобы погрузить предметное стекло в воду. Не возвращайте предметные стекла культуральным культурам во избежание перекрестного загрязнения. Используйте составной или инвертированный микроскоп с 40-400-кратным увеличением для наблюдения за ламинариями на ранних стадиях. Проследите за развитием с помощью следующей временной шкалы (примеры этапов жизненного цикла развития см. на рисунке 3).ПРИМЕЧАНИЕ: Осевшие споры наблюдаются при 0-1 сут. Споры могут прорастать в течение нескольких часов, о чем свидетельствует образование зародышевой трубки. Всхожесть обычно наблюдается через 1-2 дня. Ранние гаметофиты обычно наблюдаются в возрасте 1-4 дней. Гаметогенез, процесс, посредством которого клетки подвергаются делению и дифференцировке с образованием мужских и женских гамет, обычно наблюдается в течение первых двух недель. Женские клетки в 5-7 раз крупнее мужских. Мужские гаметофиты отращивают тонкие, нитевидные ветви, в то время как самки имеют более круглую или яйцевидную форму. Самки обычно производят яйца или яйцеклетки в течение 2-3 недель. Сперматозоиды, высвобождающиеся у самцов, плывут к самкам и оплодотворяют яйцеклетки, в результате чего образуются диплоидные зиготы. Наличие правильной плотности прививки обеспечит успешное размножение по близости38,39. Оплодотворенные яйца развиваются в эмбриональные спорофиты. Спорофиты обычно наблюдаются в течение 2-4 недель. Зигота подвергается быстрому делению клеток, в результате чего в течение примерно 6-8 недель вырастают 1-2 см лопастей. Через две недели наблюдайте по крайней мере за двумя случайными предметными стеклами 1-2 раза в неделю на предмет здорового роста и загрязнения, пока спорофиты не достигнут размера 1-2 см.ПРИМЕЧАНИЕ: Здоровый рост характеризуется золотисто-коричневой (в отличие от зеленой или прозрачной) окраской. Существует несколько количественных показателей, которые можно наблюдать на предметных стеклах с помощью перевернутого микроскопа, включая выживаемость, всхожесть, вегетативное развитие, репродуктивную зрелость и плодовитость, а также соотношение полов40. Оцените загрязнение бактериями, грибами, инфузориями и диатомовыми водорослями с помощью микроскопа. Удалите изолированные загрязнения. Контролируйте ранние признаки загрязнения диатомовыми водорослями с помощью обработки диоксидом германия (GeO2) (см. раздел 8.3). 8. Техническое обслуживание Отрегулируйте условия освещения в соответствии с разделом 6.3. Каждую неделю меняйте питательную среду, чтобы пополнить запасы питательных веществ и минералов, необходимых для роста M. pyrifera .Охладите свежую питательную среду до соответствующей температуры. Следите за тем, чтобы температура не превышала 15 °C во время этого процесса. Выкачивайте среду из контейнеров для культивирования, чтобы не повредить засеянные субстраты. Дайте носителю стечь, пока контейнер не станет почти пустым. Немедленно обновите носитель, чтобы свести к минимуму высыхание. При наполнении контейнеров для выращивания слегка наклоните их так, чтобы среда стекала по стенкам контейнера для культивирования и минимально повредила субстраты. Случайным образом меняйте положение контейнера или ванны во время еженедельной смены носителя, чтобы учесть различия в освещении.ПРИМЕЧАНИЕ: См. Дополнительный файл 1 для календаря для отслеживания активности и ожиданий в отношении культур Macrocystis. В нем указываются сроки корректировки света и аэрации, а также еженедельная смена среды. При необходимости можно контролировать загрязнение диатомовых водорослей с помощью обработки диоксидом германия (GeO2). Добавляйте 0,3-0,5 мл 250 мг/млGeO2 на каждый 1 л морской воды, добавленной к засеянным субстратам, чтобы уменьшить широко распространенное загрязнение диатомовыми водорослями.ПРИМЕЧАНИЕ: GeO2 может ингибировать производство гамет водорослей. Применяют обработку GeO2 в короткое окно после прорастания и до пиков яйцеклеток и сперматозоидов (1-7 дней) и/или после оплодотворения яйцеклеток и наблюдения за спорофитами (>21 день) с последующей сменой среды через 48 ч после удаления химиката. Эти сроки могут варьироваться в зависимости от условий культивирования, поэтому наблюдение за развитием жизненного этапа с помощью микроскопии является лучшим способом оценить сроки внесения GeO2 . Если загрязнение диатомовыми водорослями сохраняется в контейнерах с культурами и наблюдается чрезмерный рост ламинарии на ранней стадии, рассмотрите возможность повторного посева субстратов. 9. Вегетативное культивирование гаметофита гигантской ламинарии Размножайте культуры гаметофитов в вегетативных условиях круглый год, чтобы снизить зависимость от сезонного сбора спорофиллов с естественного рифа.Хранят культуры гаметофитов в соответствии с исходной популяцией в колбах, наполненных питательной средой при 4-12 °С в красном свете при интенсивности 5-20 мкмоль, фотон м-2 с-1 в цикле 12 свет: 12 темен. Обеспечьте постоянную аэрацию и меняйте среду каждые 2-6 месяцев. Чтобы увеличить биомассу гаметофитов, которые росли бесполым путем, для использования в посеве «зеленого гравия», увеличьте аэрацию для суспендирования гаметофитов, увеличьте частоту смены среды до еженедельной и фрагментируйте гаметофиты каждые две недели.Суспендировать биомассу гаметофита в колбе для культивирования путем встряхивания или перемешивания и при необходимости соскребать стенки колбы для культивирования стерильным инструментом, чтобы вытеснить прикрепленные гаметофиты. Взвешенные гаметофиты высыпают в стерильный блендер или кофемолку и взбивают раствор гаметофита в течение 1-2 с примерно 5-15 раз, в зависимости от концентрации биомассы, до тех пор, пока не исчезнут слипшиеся массы. Чтобы стимулировать размножение для посева «зеленого гравия», фрагментируйте гаметофиты, как объяснялось выше. Затем посев субстрата и увеличение полного спектра светодиодного света с 5-20 до 45-60 мкмоль фотона м-2 с-1 (+10 мкмоль фотон м-2 с-1 ежедневно для фотоакклиматизации), затем увеличивают на 10-20 мкмоль фотона м-2 с-1 каждые 3-4 дня до достижения излучения 180 мкмоль фотон м-2 с-1. 10. Развертывание После 6-8 недель лабораторного культивирования убедитесь, что молодые спорофиты имеют длину 1-2 см и готовы к развертыванию (рис. 4). Обновляйте питательные среды в контейнерах для культур за 24 часа до развертывания. Получите необходимые разрешения на укладку гравия, соответствующие местным законам и правилам. Это может быть трудоемкой частью процесса культивирования и должно быть включено в график проекта. Транспортируйте «зеленый гравий» в лотках, накрытых полотенцами, смоченными в морской воде, чтобы сохранить ламинарию увлажненной. Поместите лотки в изолированные охладители со льдом, убедившись, что они не находятся в прямом контакте со льдом. Убедитесь, что «зеленый гравий» плотно утрамбован, чтобы избежать скатывания субстратов и отслоения спорофитов во время транспортировки.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от наличия места субстраты также можно транспортировать в контейнерах для культур или ваннах, чтобы уменьшить объем обработки. Транспортируйте «зеленый гравий» на срок до 6 часов в затененном холодильнике. Развертывание должно быть рассчитано таким образом, чтобы избежать попадания прямых солнечных лучей. При развертывании с лодки используйте затененную конструкцию, чтобы избежать попадания прямых солнечных лучей во время процесса развертывания. Осторожно разбрасывайте «зеленый гравий» с поверхности на риф ниже или с помощью подводного плавания при испытаниях на новых участках и в небольших масштабах.

Representative Results

Метод восстановления «зеленого гравия» все еще находится на стадии пилотирования, с ограниченными данными о выживаемости наружных растений для других видов28 и без опубликованных данных для Macrocystis pyrifera. Используя полевой сбор и лабораторное обслуживание, описанные в этом протоколе, мы проверили значимость условий выращивания для двух различных популяций ламинарии-донора перед гипотетическим развертыванием «зеленого гравия» (рис. 5). Репродуктивная ткань ламинарии была собрана в Калифорнии (США) из более холодных (Санта-Крус 36,60167 ° с.ш., 121,88508 ° з. д.) и более теплых K4 (Сан-Диего, 32,85036 ° с.ш., -117,27600 ° з.д.) популяций и выращена при двух температурах: (1) 12 °C (стандартная температура культивирования для аквакультуры морских водорослей и средняя зимняя ТПМ для K1) и (2) 20 °C (средняя летняя ТПМ для K4, и жара 4 °C для K1). Все предметные стекла, используемые для мониторинга развития жизненной стадии ламинарии, были помечены стандартизированной сеткой, и изображения с высоким разрешением были получены с использованием этой сетки в качестве эталона, чтобы можно было наблюдать фиксированные поля во времени с помощью инвертированного микроскопа и камеры (N = 5 изображений на образец, 2,479 мм x 1,859 мм). Через 24 дня после спороношения гаметофиты подсчитывали по изображениям микроскопа (N = 300 изображений из 60 образцов). Для проверки различий в количестве гаметофитов были использованы обобщенные линейные модели смешанных эффектов с распределением Пуассона с использованием функции glmmTMB() в пакете glmmTMB41, а попарные сравнения были проведены с emtrends() из пакета emmeans42в R. Наши результаты показывают, что реакция гаметофитов на тепловую изменчивость была разной между популяциями К1 и К4 (t = 2,7, p = 0,007), где температура не оказывала влияния на более теплую популяцию К4 (оценка = -0,01, стандартная ошибка [SE] = 0,01, доверительный интервал [ДИ] = [-0,03, 0,01]), но оказывала влияние на более холодную популяцию К1 (оценка = -0,06, SE = 0,02, CI = [-0,10, -0,03]) (рис. 6А), что позволяет предположить возможную адаптивную дивергенцию признаков термотолерантности. Гаметофиты ламинарии часто изображаются какстадия устойчивости 43, что означает, что они производят универсальный фенотип, устойчивый к стрессу и относительно нечувствительный к изменчивости окружающей среды. Тем не менее, эти результаты указывают на то, что тепловая изменчивость оказывает значительное давление на этой ранней стадии. Через 32 дня после спороношения на каждом предметном стекле размером 2,5 см на 7,5 см подсчитывали видимые спорофиты длиной более примерно 1 мм (всего N = 72 образца). Для проверки различий в количестве видимых спорофитов были использованы обобщенные линейные модели смешанных эффектов с распределением Пуассона с использованием функции glmmTMB() в пакете glmmTMB , а также проведены попарные сравнения с emtrends() из пакета emmeans в R. Наши результаты показывают, что реакция спорофитов на термическую изменчивость сходна в дифференцированных популяциях К1 и К4 (z = 0,92, p = 0,36), где температура оказывала влияние как на более теплую популяцию К4 (оценка = -0,66, SE = 0,04, ДИ = [-0,74, -0,57]), так и на более холодную популяцию К1 (оценка = -0,85, SE = 0,13, ДИ = [-1,10, -0,60]) (рис. 6B). В образцах, выращенных при 20 °C, росло мало видимых спорофитов (среднее ± SE = 0,4 ± 0,2) по сравнению с образцами, выращенными при 12 °C (среднее ± SE = 82,4 ± 9,8). Этот результат свидетельствует о том, что производство спорофитов более чувствительно к температуре, чем стадия гаметофита, и что температура культивирования не должна превышать 15 °C для достижения развития спорофита, как указано в протоколе. Рисунок 1: Схема инкубаторной системы «зеленый гравий». (A) Красный источник света для вегетативно набухающих гаметофитных культур. (B) Порт доступа для электрических проводов и трубок, ведущий к внешней розетке. (C) Структура, блокирующая полный спектр света из секции красных фонарей. (D) Секция культивирования «зеленого гравия». (E) источники света полного спектра. (F) Трубопроводы, подключенные к внешнему источнику отфильтрованного воздуха. (G) Обратные клапаны для уменьшения загрязнения воздуха. (H) Индивидуальные контейнеры для культивирования, которые сводят к минимуму загрязнение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Схема системы водяной бани «зеленый гравий». (A) Чиллер с погружным насосом (в I). (B) Ванна на 20 галлонов для водяной бани. (C) Слейте воду для рециркуляции водяной бани. (D) Клапан для рециркуляции водяной бани. (E) Источник света. (F) Контейнер для зеленого гравия объемом 2,5 л с прозрачной крышкой и отверстием для аэрации. (G) Источник аэрации. (H) Трубы, по которым осуществляется рециркуляция воды с использованием погружных насосов. (I) Ресивер водяной бани от/к чиллеру из/в ванны с погружными насосами. (J) Акриловое покрытие для минимизации испарения на водяной бане. (K) Сетчатый оттенок для регулировки интенсивности света. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Развитие Macrocystis pyrifera . Этапы жизненного цикла Macrocystis pyrifera по результатам лабораторных исследований роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: «Зеленый гравий», засеянный Macrocystis pyrifera. Зеленый гравий , засеянный Macrocystis pyrifera, культивируется в лаборатории до тех пор, пока спорофиты не достигнут 1-2 см. Затем «зеленый гравий» развертывается и продолжает расти в поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Экспериментальные временные ряды. Примеры изображений из временного ряда, следующего за экспериментальным ростом и развитием гаметофитов и спорофитов Macrocystis pyrifera , происходящих из двух популяций, собранных в Калифорнии (США) и культивируемых при двух разных температурах. K1 = Санта-Крус, K4 = Сан-Диего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Репрезентативные результаты. Стадии жизни Macrocystis pyrifera, наблюдаемые для популяций происхождения K1 Санта-Крус, К4 Санта-Крус, культивируемых при постоянных температурных условиях 12 и 20 °C. Столбцы погрешности, среднее ± 1 SE. Звездочкой (*) обозначены статистически значимые различия (p < 0,05). (A) Гаметофиты на 24-й день (N = 300 изображений из 60 образцов). (B) Видимые спорофиты на 32-й день (N = 72 образца в пределах стандартизированной площади 2,5 см на 7,5 см). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Антропогенное изменение климата представляет собой растущую угрозу здоровью Мирового океана 44,45,46,47,48, приводя к серьезным нарушениям и утрате биоразнообразия 49,50,51,52. В целях ускорения восстановления деградировавших экосистем Организация Объединенных Наций объявила период с 2021 по 2030 год «Десятилетием ООН по восстановлению экосистем», совпавшим с «Десятилетием ООН, посвященным науке об океане в интересах устойчивого развития», целью которого является обращение вспять ухудшения состояния океана53. В соответствии с этим глобальным призывом к действию Альянс лесов ламинарии запустил программу Kelp Forest Challenge, направленную на восстановление 1 миллиона гектаров и защиту 3 миллионов гектаров лесов ламинарии к 2040году54. Восстановление морской среды недооценивается55, а экосистемам ламинарии уделяется значительно меньше внимания, чем таким местам обитания, как коралловые рифы, мангровые леса и луга морских водорослей56. Восстановление деградировавших экосистем показало свою эффективность в восстановлении морских экосистем, но может стоить в среднем от 80 000 до 1 600 000 долларов США за гектар, при этом средние общие затраты, вероятно, будут в два-четыре раза выше. Текущие и прогнозируемые потери требуют разработки масштабируемых, осуществимых и экономически эффективных методик восстановления ламинарии в качестве срочных мер по сохранению ламинарии.

В настоящее время в рамках усилий по восстановлению ламинарии используется комбинация методологий для устранения специфических факторов утраты ламинарии, включая трансплантацию взрослых водорослей, прямой посев зооспор и/или гаметофитов, борьбу с травоядными и установку искусственных рифов11. Однако эти методы требуют значительных ресурсов и имеют ограниченную масштабируемость. Типичная пересадка взрослых водорослей требует трудоемкого размещения искусственных материалов или структур на бентосе водолазами. Мероприятия по принципу «снизу вверх» для восстановления прибрежных скалистых рифов, такие как борьба с конкурентами и травоядными, также ограничены затратами на рабочую силу, поскольку они основаны на ручном подводном удалении или исключении этих биотических стрессоров11. Метод «зеленого гравия» преодолевает эти ограничения за счет простого развертывания с поверхности, не требуя подводной установки или технических знаний и масштабируемости при относительнонизких затратах. Этот инновационный подход представляет собой многообещающий инструмент для реставрации, что требует проведения широкомасштабных испытаний в различных местах и условиях, чтобы полностью раскрыть его потенциал32.

В то время как успешные усилия по восстановлению с использованием «зеленого гравия» были задокументированы в защищенных фьордах в Норвегии с использованием сахарной ламинарии Saccharina latissima26, этот метод все еще находится на стадии пилотирования для Macrocystis pyrifera в восточной части Тихого океана. Необходимы дополнительные испытания для решения вопроса об ожидаемой выживаемости наружных растений M. pyrifera в пределах ареала. В условиях волнообразного воздействия, типичных для роста M. pyrifera , более мелкий гравий может быть более склонен к движению и истиранию, что приводит к повреждению наружных растений. Кроме того, положительная плавучесть, обеспечиваемая газонаполненными пневматоцистами M. pyrifera , может привести к тому, что «зеленые гравийные» растения будут эффективно уноситься с места восстановления, и, таким образом, размер и вес гравия являются важными факторами для изучения этого вида. В недавнем пилотном исследовании (май 2022 г.; Ensenada, Нижняя Калифорния, Мексика), наблюдался предварительный успех в поле с M. pyrifera , о чем свидетельствует прикрепление гаптеры к окружающему субстрату и рост молоди, достигающей 1,2 м в длину после двух месяцев пребывания в поле (рис. 4). Это свидетельствует о явной возможности, которую еще предстоит изучить в использовании «зеленого гравия» для M. pyrifera в восточной части Тихого океана. В этом видео демонстрируется техника «зеленого гравия» с M. pyrifera и является ценным ресурсом, который упрощает и централизует существующие методы культивирования на этапе восстановления для поддержки исследований, направленных на изучение успехов и ограничений в различных полевых условиях.

С помощью метода «зеленого гравия» можно засеять множество небольших отдельных гравийных единиц в масштабе, который может увеличить вероятность успеха по сравнению с более распространенными подходами к пересадке со взрослыми растениями. Тем не менее, ключевым масштабируемым аспектом этой техники является ее простое развертывание с поверхности, что может облегчить восстановление больших площадей с помощью лодки. Для полевых условий, где размещение мелкого гравия не подходит, этот протокол может быть адаптирован для пересадки M. pyrifera на широкий спектр субстратов, включая более крупный гравий или даже небольшие валуны, веревку, которую можно привязать к естественным или развернутым подводным якорям, или плитку, которую можно прикрутить или приклеить с помощью морской эпоксидной смолы к морскому дну в более открытых условиях. Эти адаптации не изменят оборудование, необходимое для культивирования M. pyrifera , но впоследствии увеличат стоимость размещения.

Антропогенные нарушения и изменение климата в настоящее время превышают способность природных популяций к адаптации. Это создает серьезные проблемы для традиционных природоохранных усилий, которые восстанавливают экосистемы до их исторического состояния 58,59,60,61,62,63. Таким образом, рамки охраны природы расширились и теперь включают упреждающее управление с учетом устойчивости и адаптационного потенциала64. Упреждающее управление для решения проблемы изменения климата осуществляется в отношении древесных пород в лесных экосистемах65 и было предложено для дальнейших усилий по восстановлению с целью повышения эволюционного потенциала наружных растений66,67. Несмотря на то, что этими стратегиями по своей природе легче манипулировать в наземных условиях, несколько исследований начинают изучать их применение в морской среде 62,68,69,70. Например, коралловым рифам угрожают многочисленные антропогенные стрессоры, которые привели к беспрецедентному сокращению численности71,72. В ответ на утрату этих важных основных видов все чаще пропагандируются методы активного восстановления и вспомогательной адаптации для сохранения оставшихся коралловых рифов и связанных с ними функций 62,73,74. Один из методов включает в себя перемещение особей в пределах их текущего ареала распространения для повышения устойчивости к тепловомустрессу. Что касается восстановления ламинарии, образующей полог ламинарии, «зеленый гравий» имеет настраиваемую структуру для изучения вспомогательных методов адаптации, таких как транслокация устойчивых генотипов в уязвимые районы, негенетические манипуляции, такие как гибридизация, или акклиматизация особей к стрессу окружающей среды62 с результатами, направленными на получение более устойчивых штаммов для программ восстановления76,77.

Использование местной поддержки для активизации усилий по восстановлению имеет решающее значение для поддержания успеха в сохранении экосистемы ламинарии. Привлечение местных заинтересованных сторон может увеличить местнуюподдержку потребностей в восстановлении 6,50 и способствовать рациональному использованию прибрежных районов, что впоследствии может привести к увеличению финансирования и долговечности защиты экосистемы ламинарии. Как и в случае со всеми другими методологиями восстановления ламинарии, структурированные механизмы принятия решений, объединяющие различные экологические, социально-экономические и природоохранные цели, помогут достичь оптимальных результатов для экосистем ламинарии и сообществ, которые ониподдерживают11.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была профинансирована Калифорнийским морским грантом по исследовательской программе восстановления ламинарии R/HCE-17 для JBL и MESB, грантом Национального научного фонда на исследовательскую стажировку DGE-1735040 для PDD, The Nature Conservancy, Schmidt Marine Technology Partners, Sustainable Ocean Alliance, Tinker Foundation для AP-L и рабочей группой Climate Science Alliance Baja для RBL и JL. Мы благодарим Стивена Эллисона, Cascade Sorte, Саманту Каннингем, Сэма Вебера и Кейтлин Йи из Калифорнийского университета в Ирвайне; Марк Карр, Питер Раймонди, Сара Эминхайзер, Энн Капущински из Калифорнийского университета в Санта-Круз; Уолтер Хиди и Нора Эдди из The Nature Conservancy; Филипе Альберто и Габриэль Монтесинос из Висконсинского университета, Милуоки; Хосе Антонио Зертуче-Гонсалес, Алехандра Феррейра-Арриета и Лилиана Феррейра-Арриета в Автономном университете Нижней Калифорнии; Луис Мальпика-Крус, Алисия Абадия-Кардосо и Даниэль Диас-Гусман из MexCal; прыгуны в воду MexCalitos Алехандра Рейес, Моника Перальта, Тереза Тавера, Джулия Наваррете, Айноа Вилалта, Жереми Бауэр и Альфонсо Феррейра; и Нэнси Карузо за технические консультации. Мы благодарим Институт океанологических исследований (Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California) за предоставление оборудования, используемого для разработки системы водяных бань. Благодарим Айру Спитцера за подводный и беспилотный видеоконтент.

Materials

0.22 µm filters Milipore SCGPS05RE Natural seawater sterilization
1 L glass bottles Amazon B07J6JP4D1 Natural seawater sterilization
1 µm filters (water + air) Amazon B01M1VWUWL Natural seawater sterilization
1'' PVC 90-Degree Elbow Home Depot 203812125 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
10 µm filters Amazon B00D04BG56 Natural seawater sterilization
20 µm filters Amazon B082WS9NPH Natural seawater sterilization
3x5mm tubing Amazon B0852HXPN6 Option 1 Small scale – Incubator
4×4'' Sterile Gauze Amazon B07NDK8XM3 Sporulation
4x6mm tubing Amazon B08BCRV1FY Option 1 Small scale – Incubator
5 µm filters Amazon B082WS9NPH Natural seawater sterilization
50 mL falcon tubing Amazon B01M04HGPJ Sporulation
8x10mm tubing Amazon B01MSM3LLZ Option 1 Small scale – Incubator
Air filters Thermo Fisher MTGR85010 Option 1 Small scale – Incubator
Alcohol lamp Amazon B07XWD9WWC Sporulation
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate ACS reagent, 99% Sigma 215406-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Aquarium Grade Gravel Amazon B07XRCKFBJ Option 1 Small scale – Incubator
Biotin powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 99% Sigma B4639-100MG Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Boric Acid, 99.8%, 10043-35-3, MFCD00011337, BH3O3, 61.83, 500g Thermo Fisher 5090113707 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Calcium D-Pantothenate,ge98.0% (T),C9H17NO5,137-08-6,25g,D-Pantothenic Acid Calcium Salt, P0012-25G 1/EA Thermo Fisher P001225G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Check valves Amazon B08HRZR4MM Option 1 Small scale – Incubator
Clear tubing 3/8'' – 10 ft Amazon B07MTYMW13 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
COBALT(II) SULFATE HEPTAH-100G, WARNING – California – Cancer Hazard, 93-2749-100G 1/EA Thermo Fisher 5090114752 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Compound microscope with camera OMAX M83EZ-C50S Monitoring
Culture flask Thermo Fisher 07-250-080 Option 1 Small scale – Incubator
Culture light Amazon B07RRRPJ63 Option 1 Small scale – Incubator
Culture stoppers Amazon B07DX6J7QD Option 1 Small scale – Incubator
Drainage connector Amazon B00GUZ6CV0 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
EDTA CAS Number: 6381-92-6 Molecular Formula: C10H14N2O8Na2- 2H2O Molecular Weight: 372.2 Thermo Fisher 50213299 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Graduations: 0.2 mL, 0.5 mL, 1.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.10 mL, 0.17 mL, 0.25 mL Thermo Fisher S81273 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Graduated Cylinder Sets Class A, ASTM, Capacity: 50 mL, 100 mL, 250 mL, Graduations: 1.0 mL, 1.0 mL, 2.0 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Graduated: Yes, Tolerance: 0.25 mL, 0.50 mL, 1.0 mL Thermo Fisher S81275 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Eisco Safety Pack Volumetric Flask Sets – Class A, ASTM, Capacity: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Borosilicate 3.3 Glass, Autoclavable: Yes, Class: Class A, Closure Material: Glass, Closure Size: Stopper Number: 9, 9, 13, Closure Type: Penny Stopper, Graduated: Ye Thermo Fisher S81271 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Filter holder Amazon B07LCKBKCT Natural seawater sterilization
Fisherbrand Graduated Cylinders, Capacity: 500 mL, Graduations: 5 mL, Borosilicate Glass, Autoclavable: Yes, Limit of Error: +/-4.0 mL, Recommended Applications: Education, Subdivision: 5 mL, S63460 1/EA Thermo Fisher S63460 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
FLEXACAM C1 Camera Leica FLEXACAM C1 Monitoring
Folic acid, C19H19N7O6, CAS Number59303, vitamin m, pteroylglutamic acid, vitamin b9, folvite, folacin, folacid, pteroyllglutamic acid, pteglu, folic acid, folate, 25g, 100781, CHEBI:27470, Yellow to Orange, 2004190, 441.41, OVBPIULPVIDEAOLBPRGKRZSAN Thermo Fisher AAJ6083314 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Free Standing 20 Gallon Utility Sink Amazon B094TLH19L Option 2 – Medium scale – Water bath systems
GERMANIUM DIOXIDE 99.99 10GR Thermo Fisher AC190000100 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass Graduated Cylinders, Class A Round Base, Eisco, For Use With: Measuring liquids, Capacity: 1000 mL, Graduations: 10 mL White, CH0344OWT 1/EA Thermo Fisher S88442 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Glass slides Amazon B00L1S93PS Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Glycerol phosphate disodium salt hydrate isomeric mixture Sigma G6501-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Growth containers -3.4 Qt- 3.25 Lt transparent containers with transparent lid Container store #10014828 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Growth light Amazon B086R14MFW Option 1 Small scale – Incubator
Hemocytometer Amazon B07TJQDKLJ Sporulation
HEPES 99.5% (titration) Sigma H3375-500G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Hinged plastic jars SKS Bottle & Packaging 40280125.01S Option 1 Small scale – Incubator
Inositol research grade, USP/NF For bacteriology. Optically inactive. Tested for its suitability in tissue culture. Size – 100G Storage Conditions – +15 C TO +30 C Catalog Number – 26310.01 CAS 87-89-8 Thermo Fisher 50247745 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Instant Ocean – 50 G Amazon B000255NKA Option 1 Small scale – Incubator
Inverted Microscope Leica DMi1 Leica DMi1 Monitoring
Iron(III) chloride hexahydrate ACS reagent, 97% Sigma 236489-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Licor Ligth Meter Data Logger Licor LI-250A Monitoring
Light/temperature HOBO data logger Amazon B075X2SWKN Monitoring
Lights 150W Amazon B0799DQM9V Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Manganese sulfate monohydrate meets USP testing specifications Sigma M8179-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Medium size rocks 2-3 inch, 20 pounds Home Depot 206823930 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Nicotinic Acid, 99%, C6H5NO2, CAS Number59676, daskil, apelagrin, acidum nicotinicum, akotin, 3carboxypyridine, niacin, 3pyridinecarboxylic acid, nicotinic acid, pellagrin, wampocap, 250g, 109591, CHEBI:15940, 1.4, 2004410, 293 deg.C (559 deg.F), 123.11, Thermo Fisher AAA1268330 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
p-Aminobenzoic acid 99.82% 4-aminobenzoic acid, C7H7NO2, CAS Number: 150-13-0, 25g, 0210256925 1/EA Thermo Fisher ICN10256925 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
PCV cement Amazon B001D9WRWG Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve Amazon B0006JLVE4 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Plastic water valve Amazon B07G5FY7X1 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Precision scale 1mg Amazon B08DTH95FN Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Pump for filtered air Amazon B0BG2BT9RX Option 1 Small scale – Incubator
PVC tubing 1×24'' Home Depot 202300505 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Quantum Light meter Apogee Instruments MQ-510 Monitoring
Refrigerated Incubator Thermo Fisher 15-103-1566 Option 1 Small scale – Incubator
Rubber Grommets Amazon B07YZD22ZP Option 1 Small scale – Incubator
Salinity refractometer ATC B018LRO1SU Monitoring
Shade mesh 6×50 ft Home depot 316308418 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Sodium Nitrate ge 99.0% Nitric Acid, Sodium Salt, NNaO3, CAS Number: 7631-99-4, 500g, 1/EA Thermo Fisher BP360500 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Soldering for aeration opening Amazon B08R3515SF Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Spray isporopyl alcohol Amazon ‎ B08LW5P844 Sporulation
Stainless steel sissors Amazon B07BT4YLHT Sporulation
Stainless steel tray Amazon B08CV33YXG Sporulation
Stainless steel twizzers Amazon B01JTZTAJS Sporulation
Stir Bars Amazon B07C4TNKXB Materials to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Submersible circulation pump 400 GPH Amazon B07RZKRM13 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Submersible Spherical Quantum Sensor Waltz US-SQS/L Monitoring
Temperature gun Infrared Thermometer 749 B07VTPJXH9 Monitoring
Thiamine hydrochloride BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture Sigma T1270-25G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Thymine 99% 2, 4-Dihydroxy-5-methylpyrimidine, C5H6N2O2, CAS Number: 65-71-4, 25g, 157850250 1/EA Thermo Fisher AC157850250 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Transparent Acrylic sheet 24×48 inch Home Depot 202038048 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Tubing water circulation 1''x10 ft Amazon B07ZC1PSF3 Option 2 – Medium scale – Water bath systems
UV light for natural seawater sterilization Amazon B018OI7PYS Natural seawater sterilization
Vacum pump Amazon B087XBTPVW Natural seawater sterilization
Vitamin B12 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, 98% Sigma V6629-100MG Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 1000 mL, CH0446IWT 1/EA Thermo Fisher S89446 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Volumetric Flasks, Class A Glass, Eisco, with Polypropylene Stopper, Graduated, White printed markings, Capacity: 500 mL, CH0446HWT 1/EA Thermo Fisher S89445 Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
Water Chiller 200-600GPM Amazon B07BHHP71C Option 2 – Medium scale – Water bath systems
Y-splitters for 4x6mm tubing Amazon B08XTJKFCH Option 1 Small scale – Incubator
Zinc sulfate heptahydrate BioReagent, suitable for cell culture Sigma Z0251-100G Chemicals to create Provasoli’s Enriched Seawater (PES) and vitamins for media enrichment
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiel, D. R., Foster, M. S. . The Biology and Ecology of Giant Kelp Forests. , (2015).
  2. Smale, D. A., Burrows, M. T., Moore, P., O’Connor, N., Hawkins, S. J. Threats and knowledge gaps for ecosystem services provided by kelp forests: a northeast Atlantic perspective. Ecol Evol. 3 (11), 4016-4038 (2013).
  3. Eger, A. M., et al. The value of ecosystem services in global marine kelp forests. Nat Comm. 14 (1), 1894 (2023).
  4. Bennett, S., Wernberg, T., Arackal Joy, B., de Bettignies, T., Campbell, A. H. Central and rear-edge populations can be equally vulnerable to warming. Nat Comm. 6 (1), 10280 (2015).
  5. Jueterbock, A., et al. Climate change impact on seaweed meadow distribution in the North Atlantic rocky intertidal. Ecol Evol. 3 (5), 1356-1373 (2013).
  6. Rogers-Bennett, L., Catton, C. A. Marine heat wave and multiple stressors tip bull kelp forest to sea urchin barrens. Sci Rep. 9 (1), 15050 (2019).
  7. Krumhansl, K. A., et al. Global patterns of kelp forest change over the past half-century. PNAS. 113 (48), 13785-13790 (2016).
  8. Zimmerman, R. C., Kremer, J. N. Episodic nutrient supply to a kelp forest ecosystem in Southern California. J Mar Res. 42 (3), 591-604 (1984).
  9. Rothäusler, E., et al. Physiological performance of floating giant kelp Macrocystis pyrifera (phaeophyceae): Latitudinal variability in the effects of temperature and grazing. J Phycol. 47 (2), 269-281 (2011).
  10. Wernberg, T., Krumhansl, K., Filbee-Dexter, K., Pedersen, M. F. Chapter 3 – Status and trends for the world’s kelp forests. World Seas: An Environmental Evaluation (Second Edition). , 57-78 (2019).
  11. Eger, A. M., Layton, C., McHugh, T. A., Gleason, M., Eddy, N. Kelp restoration guidebook: Lessons learned from kelp restoration projects around the world. TNCKelp Forest Alliance. , (2022).
  12. Filbee-Dexter, K., et al. Marine heatwaves and the collapse of marginal North Atlantic kelp forests. SciRep. 10 (1), 13388 (2020).
  13. Filbee-Dexter, K., Scheibling, R. E. Sea urchin barrens as alternative stable states of collapsed kelp ecosystems. Mar Ecol Prog Ser. 495, 1-25 (2014).
  14. Filbee-Dexter, K., Wernberg, T. Rise of turfs: A new battlefront for globally declining kelp forests. BioSci. 68 (2), 64-76 (2018).
  15. Assis, J., Araújo, M. B., Serrão, E. A. Projected climate changes threaten ancient refugia of kelp forests in the North Atlantic. Glob Change Biol. 24 (1), e55-e66 (2018).
  16. Davis, T., Champion, C., Coleman, M. Ecological interactions mediate projected loss of kelp biomass under climate change. Divers Distrib. 28 (2), 306-317 (2021).
  17. Goldsmit, J., et al. Kelp in the eastern Canadian arctic: Current and future predictions of habitat suitability and cover. Front Mar Sci. 18, 742209 (2021).
  18. Ling, S. D., Cornwall, C. E., Tilbrook, B., Hurd, C. L. Remnant kelp bed refugia and future phase-shifts under ocean acidification. PLoS One. 15 (10), e0239136 (2020).
  19. Eger, A. M., et al. Global kelp forest restoration: past lessons, present status, and future directions. Biol Rev. 97 (4), 1449-1475 (2022).
  20. Waylen, K. A., Fischer, A., McGowan, P. J., Thirgood, S. J., Milner-Gulland, E. J. Effect of local cultural context on the success of community-based conservation interventions. Biol Consv. 24 (4), 1119-1129 (2010).
  21. Vergés, A., et al. The tropicalization of temperate marine ecosystems: climate-mediated changes in herbivory and community phase shifts. Proc Royal Soc. B. 281 (1789), 20140846 (2014).
  22. Zarco-Perello, S., Wernberg, T., Langlois, T. J., Vanderklift, M. A. Tropicalization strengthens consumer pressure on habitat-forming seaweeds. Sci Rep. 7 (1), 820 (2017).
  23. Worm, B., Lotze, H. K. Chapter 21 – Marine biodiversity and climate change. Climate Change (Third Edition). , 445-464 (2021).
  24. Félix-Loaiza, A. C., Rodríguez-Bravo, L. M., Beas-Luna, R., Lorda, J., de La Cruz-González, E., Malpica-Cruz, L. Marine heatwaves facilitate invasive algae takeover as foundational kelp. Botanica Marina. 65 (5), 315-319 (2022).
  25. Miller, K. I., Blain, C. O., Shears, N. T. Sea urchin removal as a tool for macroalgal restoration: A review on removing "the spiny enemies&#34. Fron Mar Sci. 9, 831001 (2022).
  26. Westermeier, R., et al. Repopulation techniques for Macrocystis integrifolia (Phaeophyceae: Laminariales) in Atacama, Chile. J Appl Phycol. 26, 511-518 (2014).
  27. Layton, C., et al. Kelp forest restoration in Australia. Fron Mar Sci. 7, 74 (2020).
  28. Fredriksen, S., et al. gravel: a novel restoration tool to combat kelp forest decline. Sci Rep. 10 (1), 3983 (2020).
  29. . Projects of the Green Gravel Action Group Available from: https://www.greengravel.org/ (2024)
  30. Fain, S. R., Murray, S. N. Effects of light and temperature on net photosynthesis and dark respiration of gametophytes and embryonic sporophytes of macrocystis pyrifera. J Phycol. 18 (1), 92-98 (1982).
  31. Westermeier, R., Patiño, D., Piel, M. I., Maier, I., Mueller, D. G. A new approach to kelp mariculture in Chile: production of free-floating sporophyte seedlings from gametophyte cultures of Lessonia trabeculata and Macrocystis pyrifera. Aquac Res. 37 (2), 164-171 (2006).
  32. Alsuwaiyan, N. A., et al. Green gravel as a vector of dispersal for kelp restoration. Fron Mar Sci. 9, 910417 (2022).
  33. Falace, A., Kaleb, S., De La Fuente, G., Asnaghi, V., Chiantore, M. Ex situ cultivation protocol for Cystoseira amentacea var. stricta (Fucales, Phaeophyceae) from a restoration perspective. PloS One. 13 (2), e0193011 (2018).
  34. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. . New England seaweed culture handbook. , (2014).
  35. Provasoli, L., McLaughlin, J. J. A., Droop, M. R. The development of artificial media for marine algae. Arch Mikrobiol. 25, 392-428 (1957).
  36. Navarro, D., Navarro, D. E. . California Kelp Forest Restoration: Science Activity Guide for Teachers. , (2006).
  37. Alsuwaiyan, N. A., et al. A review of protocols for the experimental release of kelp (Laminariales) zoospores. Ecol Evol. 9 (14), 8387-8398 (2019).
  38. Lüning, K., Müller, D. G. Chemical interaction in sexual reproduction of several Laminariales (Phaeophyceae): release and attraction of spermatozoids. Z. Pflanzenphysiol. 89 (4), 333-341 (1978).
  39. Müller, D. G., Maier, I., Gassmann, G. Survey on sexual pheromone specificity in Laminariales (Phaeophyceae). Phycologia. 24 (4), 475-477 (1985).
  40. Vieira, V. M., Oppliger, L. V., Engelen, A. H., Correa, J. A. A new method to quantify and compare the multiple components of fitness-a study case with kelp niche partition by divergent microstage adaptations to temperature. Plos One. 10 (3), e0119670 (2015).
  41. Brooks, M. E., et al. glmmTMB balances speed and flexibility among packages for zero-inflated generalized linear mixed modeling. The R Journal. 9 (2), 378-400 (2017).
  42. Russell, L. emmeans: estimated marginal means, aka least-squares means. R package version. 1 (2), (2018).
  43. Ladah, L. B., Zertuche-González, J. A. Survival of microscopic stages of a perennial kelp (Macrocystis pyrifera) from the center and the southern extreme of its range in the Northern Hemisphere after exposure to simulated El Niño stress. Mar Biol. 152, 677-686 (2007).
  44. Halpern, B. S., et al. A global map of human impact on marine ecosystems. Science. 319 (5865), 948-952 (2008).
  45. Halpern, B. S., et al. Spatial and temporal changes in cumulative human impacts on the world’s ocean. Nat Comm. 6 (1), 1-7 (2015).
  46. Halpern, B. S., et al. Recent pace of change in human impact on the world’s ocean. Sci Rep. 9 (1), 11609 (2019).
  47. Micheli, F., et al. Cumulative human impacts on Mediterranean and Black Sea marine ecosystems: assessing current pressures and opportunities. PloS One. 8 (12), e79889 (2013).
  48. Portner, H. -. O., et al. . IPCC, 2022: Summary for policymakers. , (2022).
  49. Butchart, S. H. M., et al. Global biodiversity: Indicators of recent declines. Science. 328 (5982), 1164-1168 (2010).
  50. Rocha, J., Yletyinen, J., Biggs, R., Blenckner, T., Peterson, G. Marine regime shifts: Drivers and impacts on ecosystems services. Phil Trans Roy Soc. B. 370 (1659), 20130273 (2015).
  51. Worm, B., et al. Impacts of biodiversity loss on ocean ecosystem services. Science. 314 (5800), 787-790 (2006).
  52. Worm, B., Lotze, H. K. Marine biodiversity and climate change. Climate Change (Third Edition). Chapter 21, 445-464 (2021).
  53. Waltham, N. J., et al. UN decade on ecosystem restoration 2021-2030-What chance for success in restoring coastal ecosystems. Fron Mar Sci. 7, (2020).
  54. . Kelp Forest Challenge Available from: https://kelpforestalliance.com/ (2024)
  55. Gordon, T. A. C., Radford, A. N., Simpson, S. D., Meekan, M. G. Marine restoration projects are undervalued. Science. 367 (6478), 635-636 (2020).
  56. Morris, R. L., et al. Key principles for managing recovery of kelp forests through restoration. BioScience. 70 (8), 688-698 (2020).
  57. Bayraktarov, E., et al. The cost and feasibility of marine coastal restoration. Ecol Appl. 26 (4), 1055-1074 (2016).
  58. Breed, M. F., et al. Priority actions to improve provenance decision-making. BioScience. 68 (7), 510-516 (2018).
  59. Breed, M. F., et al. The potential of genomics for restoring ecosystems and biodiversity. Nat Rev Genet. 20 (10), 615-628 (2019).
  60. Gurgel, C. F. D., Camacho, O., Minne, A. J. P., Wernberg, T., Coleman, M. A. Marine heatwave drives cryptic loss of genetic diversity in underwater forests. Curr Biol. 30 (7), 1199-1206.e2 (2020).
  61. Hobbs, R. J., Higgs, E., Harris, J. A. Novel ecosystems: implications for conservation and restoration. Trends Ecol Evol. 24 (11), 599-605 (2009).
  62. Oppen, M. J. H., van Oliver, J. K., Putnam, H. M., Gates, R. D. Building coral reef resilience through assisted evolution. PNAS. 112 (8), 2307-2313 (2015).
  63. Perring, M. P., et al. Advances in restoration ecology: Rising to the challenges of the coming decades. Ecosphere. 6 (8), art131 (2015).
  64. Coleman, M. A., et al. Restore or redefine: Future Trajectories for Restoration. Fron MarSci. 7, 237 (2020).
  65. O’Neill, G. A. . Assisted migration to address climate change in British Columbia: recommendations for interim seed transfer standards. , (2008).
  66. Broadhurst, L. M., et al. Seed supply for broadscale restoration: maximizing evolutionary potential. Evol App. 1 (4), 587-597 (2008).
  67. Vitt, P., Havens, K., Kramer, A. T., Sollenberger, D., Yates, E. Assisted migration of plants: Changes in latitudes, changes in attitudes. Biol Cons. 143 (1), 18-27 (2010).
  68. Buerger, P., et al. Heat-evolved microalgal symbionts increase coral bleaching tolerance. Sci Adv. 6 (20), eaba2498 (2020).
  69. Chakravarti, L. J., van Oppen, M. J. H. Experimental evolution in coral photosymbionts as a tool to increase thermal tolerance. Fron Mar Sci. 5, (2018).
  70. van Oppen, M. J. H., et al. Shifting paradigms in restoration of the world’s coral reefs. Global Change Biology. 23 (9), 3437-3448 (2017).
  71. Harborne, A. R., Rogers, A., Bozec, Y. -. M., Mumby, P. J. Multiple Stressors and the Functioning of Coral Reefs. Ann Rev Mar Sci. 9 (1), 445-468 (2017).
  72. Hughes, T. P., et al. Climate change, human impacts, and the resilience of coral reefs. Science. 301 (5635), 929-933 (2003).
  73. Anthony, K., et al. New interventions are needed to save coral reefs. Nat Ecol & Evol. 1 (10), 1420-1422 (2017).
  74. Darling, E. S., Côté, I. M. Seeking resilience in marine ecosystems. Science. 359 (6379), 986-987 (2018).
  75. van Oppen, M. J. H., Puill-Stephan, E., Lundgren, P., De’ath, G., Bay, L. K. First-generation fitness consequences of inter-populational hybridization in a Great Barrier Reef coral and its implications for assisted migration management. Coral Reefs. 33 (3), 607-611 (2014).
  76. Coleman, M. A., Goold, H. D. Harnessing synthetic biology for kelp forest conservation1. J Phycol. 55 (4), 745-751 (2019).
  77. Liboureau, P., Pearson, G. A., Barreto, L., Serrao, E. A., Kreiner, A., Martins, N. Effects of thermal history on reproductive success and cross-generational effects in the kelp Laminaria pallida (Phaeophyceae). Mar Ecol Prog Ser. 715, 41-56 (2023).

Tags

KelpMacrocystis PyriferaKelp CulturingGreen Gravel TechniqueKelp RestorationTemperature ControlLight RequirementsAerationSterilizationGravel SubstrateSeawater Filtration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dawkins, P. D., Paz-Lacavex, A., Fiorenza, E. A., Rush, M. A., Beas-Luna, R., Lorda, J., Malpica-Cruz, L., Sandoval-Gil, J. M., McHugh, T. A., Han, M. K., Bracken, M. E. S., Lamb, J. B. Field Collection and Laboratory Maintenance of Canopy-Forming Giant Kelp to Facilitate Restoration. J. Vis. Exp. (208), e66092, doi:10.3791/66092 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image