Tecnica real-time ad alto rendimento per quantificare la formazione di trappole extracellulari di neutrofili nei neutrofili umani
Summary
Presentiamo un metodo automatizzato ad alto rendimento per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive, accoppiato con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana.
Abstract
I neutrofili sono cellule di linea mieloide che costituiscono una parte cruciale del sistema immunitario innato. L’ultimo decennio ha rivelato ulteriori ruoli chiave che i neutrofili svolgono nella patogenesi del cancro, delle malattie autoimmuni e di varie condizioni infiammatorie acute e croniche, contribuendo all’inizio e alla perpetuazione della disregolazione immunitaria attraverso molteplici meccanismi, tra cui la formazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET), che sono strutture cruciali nella difesa antimicrobica. I limiti delle tecniche per quantificare la formazione di NET in modo imparziale, riproducibile ed efficiente hanno limitato la nostra capacità di comprendere ulteriormente il ruolo dei neutrofili nella salute e nelle malattie. Descriviamo un metodo automatizzato, in tempo reale e ad alto rendimento per quantificare i neutrofili sottoposti a formazione di NET utilizzando una piattaforma di imaging di cellule vive accoppiata con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana che utilizza due diversi coloranti di DNA per visualizzare il DNA intracellulare ed extracellulare. Questa metodologia è in grado di aiutare a valutare la fisiologia dei neutrofili e testare molecole in grado di colpire la formazione di NET.
Introduction
Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono strutture di cromatina simili a ragnatele estruse dai neutrofili in risposta a vari stimoli infiammatori. I NET sono composti da DNA, istoni e varie proteine/peptidi antimicrobici, che intrappolano e uccidono gli agenti patogeni infettivi e invocano risposte infiammatorie1.
Sebbene i NET siano utili per la difesa dell’ospite contro gli agenti patogeni, hanno attirato l’attenzione come potenziale motore di varie malattie autoimmuni2, trombosi3, malattie metaboliche4 e crescita metastatica dei tumori5. In quanto tale, l’inibizione della formazione di NET è una potenziale opzione terapeutica per queste malattie. Tuttavia, nonostante alcune promettenti molecole mirate ai NET in fase di sviluppo6, non esiste ancora una terapia approvata che influisca specificamente su questo meccanismo. Ciò è, almeno in parte, attribuibile alla mancanza di metodi di quantificazione oggettivi, imparziali, riproducibili e ad alto rendimento per la formazione di NET.
Abbiamo stabilito e segnalato un nuovo metodo che utilizza una piattaforma di imaging a due colori su cellule vive 7,8. Le immagini time-lapse di neutrofili colorati con colorante nucleare permeabile alla membrana e colorante DNA impermeabile alla membrana vengono analizzate dal software e il numero di neutrofili pre e post-formazione di NET viene conteggiato in più punti temporali. Poiché l’integrità della membrana plasmatica viene persa durante la formazione di NET dalla regolazione deldisassemblaggio della lamina B mediata da PKCα e della lamina A/C mediata da CDK4/6 CDK4/6 9, i neutrofili che formano NET sono colorati da un colorante di DNA impermeabile alla membrana, mentre i neutrofili sani non lo sono. Questo metodo supera i problemi delle tecniche precedentemente riportate per quantificare la formazione di NET e fornisce una quantificazione imparziale, ad alto rendimento, riproducibile e accurata di NET in modo automatizzato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli attuali metodi per quantificare i NET ex vivo presentano diversi inconvenienti che limitano la nostra capacità di studiare neutrofili, NET e potenziali bersagli terapeutici in modo imparziale e ad alto rendimento10,14. Ad esempio, il conteggio diretto delle cellule che formano NET dopo la colorazione immunofluorescente, considerato il gold standard per la quantificazione dei NET, è a basso rendimento e dipende dalla visione soggettiva dell’operator…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Sezione di Imaging Luminoso dell’Ufficio di Scienza e Tecnologia dell’Istituto Nazionale di Artrite e Malattie Muscoloscheletriche e della Pelle del National Institutes of Health. Questa ricerca è stata supportata dal Programma di Ricerca Intramurale del National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institutes of Health (ZIA AR041199).
Materials
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Induction and quantification of NETosis. Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
