Los neutrófilos de sujetos humanos sanos se obtuvieron después de que se proporcionara el consentimiento informado según el protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El protocolo sigue las directrices del comité de ética de la investigación en seres humanos de los NIH. 1. Tinción de los neutrófilos y preparación de la placa de ensayo Tomar sangre periférica con el consentimiento informado por escrito adecuado siguiendo las directrices de cada instituto y aislar los neutrófilos utilizando cualquier método deseado. Por ejemplo, el método Ficoll-dextrano 10,11 es un método comúnmente utilizado para el aislamiento de neutrófilos de sangre periférica humana.NOTA: Aunque el método discutido aquí utiliza neutrófilos humanos, los neutrófilos de ratón también pueden analizarse utilizando un protocolo similar. Resuspenda los neutrófilos en el medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI; consulte la Tabla de materiales) 1640 a 2.0 x 106 neutrófilos/mL y coloque la suspensión de neutrófilos en un tubo de centrífuga de 1.5 mL.NOTA: Por lo general, no agregamos suero fetal bovino (FBS) a los medios de cultivo porque la albúmina en FBS puede reducir la formación de NET12 y la nucleasa termoestable en FBS puede degradar NET13. Agregue colorante de ADN rojo permeable a la membrana (consulte la Tabla de materiales) a 1 μL por 1,5 mL de suspensión de neutrófilos. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad. Centrifugar a 2500 x g durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Resuspender los neutrófilos en 1 mL de RPMI, luego centrifugar a 2500 x g durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Repita 2 veces (lave en total 3 veces). Resuspenda los neutrófilos en 1 mL de RPMI y cuente usando un contador de células. Diluir la suspensión de neutrófilos a 1,5 x 105 neutrófilos/ml. Agregue 4 μL de colorante de ADN verde impermeable a la membrana 1:100 prediluido (ver Tabla de materiales) por 1 mL de suspensión de neutrófilos. Coloque 100 μL de suspensión de neutrófilos por pocillo en una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejido transparente (consulte la Tabla de materiales). Establezca cada condición por triplicado.NOTA:Hemos demostrado previamente que no hay diferencia en la formación y cuantificación de NET con este método si los neutrófilos se colocan en placas con o sin recubrimiento de poli-L-lisina. Por lo tanto, el uso de placa tratada con cultivo de tejidos es suficiente para este método. Añadir 100 μL de RPMI que contenga reactivos de estímulo con o sin inhibidor, o cualquier otro reactivo de interés en los pocillos respectivos. Utilice siempre pocillos de control positivo añadiendo 500 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) o 2,5 μM de ionóforo de calcio (A23187), aquí se utilizó un inhibidor de AKT de 30 μM. Coloque la placa en el sistema de análisis de células vivas (consulte la Tabla de materiales) que se encuentra en una incubadora de CO2 al 5%.NOTA: Puede aparecer condensación en la parte superior e inferior de la placa unos minutos después de este paso. Esto puede inhibir la obtención adecuada de imágenes. Limpie y elimine bien la condensación antes de comenzar el escaneo. Coloque la placa en la máquina, inicie el software, ingrese el protocolo de escaneo y luego limpie la placa justo antes del primer escaneo. 2. Placa de escaneo para visualizar neutrófilos formadores de NET Inicie el software (consulte la Tabla de materiales para obtener más información sobre el software). Inicie Add Vessel presionando + en la esquina superior izquierda. Elija Escanear según programación. Elija Nuevo.NOTA: Una vez creado esto, ejecute el mismo protocolo de escaneo eligiendo Copiar anterior y seleccionando el protocolo almacenado en la siguiente pantalla. Elija Estándar. Establezca la configuración de escaneo como: Opciones de celda por celda: Ninguna; Canales de imagen: Fase, Verde (Tiempo de adquisición: 200 ms), Rojo (Tiempo de adquisición: 400 ms); Objetivo: 20x. Elija la placa que se está utilizando de la lista. Seleccione la ubicación del recipiente donde colocar la placa en la bandeja del sistema de adquisición de imágenes de células vivas. Seleccione los pocillos en los que haya muestras y decida cuántas imágenes tomar por pocillo. En función del número de imágenes por pocillo, genere una duración estimada del escaneo de la placa. Por lo general, 4 imágenes por pocillo son suficientes; Sin embargo, esto puede variar según las condiciones y la frecuencia de las exploraciones. Introduzca la información de cada pozo (por ejemplo, el tipo de célula y el compuesto) haciendo clic en Crear mapa de placas para proporcionar un nombre para el estudio.NOTA: El mapa de placas se puede preparar y guardar de antemano utilizando el editor de mapas de placas en el software. Los datos del mapa de placas guardados se pueden importar durante este paso. Si lo desea, la introducción de la información del mapa de placas se puede omitir y realizar más tarde. Los datos también se pueden obtener sin ingresar información sobre el diseño de la placa. Sin embargo, se recomienda introducir la información de la placa para facilitar el análisis posterior. En la siguiente pantalla, seleccione Basic Analyzer como tipo de análisis y elija Protocolo de análisis en la lista desplegable, que muestra las definiciones de análisis utilizadas anteriormente (no los protocolos de análisis). La desmezcla espectral tanto para el verde como para el rojo puede dejarse en 0,0 %.NOTA: Este paso puede omitirse, si lo desea. Programar el escaneo. Para el experimento aquí, escanee cada 15-20 minutos durante 8 h . Establezca la hora de inicio del escaneo arrastrando la barra blanca y gris en la parte superior de la pantalla.NOTA: Evite escanear con demasiada frecuencia, de lo contrario, es posible que la máquina no funcione bien debido al sobrecalentamiento. El tiempo de escaneo no debe exceder las 12 h por 24 h. Es posible que vea una alerta si el escaneo es demasiado frecuente. Verifique la configuración de escaneo en la siguiente pantalla y presione Agregar a la programación para comenzar a escanear. Espere hasta que se escanee el conjunto inicial de imágenes para confirmar si todo funciona bien.A veces, es posible que las células no estén enfocadas correctamente. En ese caso, verifique si hay condensación (y limpie en consecuencia), si la placa está correctamente colocada en la bandeja o si la posición de la placa está especificada correctamente, etc. Si las células todavía están flotando y no se han asentado en el fondo del pozo, espere unos 5 minutos antes de escanear. 3. Establecer la definición de análisis para cuantificar los NET Abra el estudio (recipiente) que se va a analizar en la pestaña Ver. Presione Iniciar análisis a la izquierda de la pantalla. Elija Create New Analysis Definition (Crear nueva definición de análisis).Si se ha realizado un análisis anteriormente, utilice la misma definición de análisis con pequeñas modificaciones seleccionando Copiar definición de análisis existente. En este caso, vaya al paso 3.3. Si utiliza el análisis sin ninguna alteración, seleccione Usar definición de análisis existente; Esto no se recomienda porque el nivel de fluorescencia puede variar entre ensayos en diferentes días y, por lo general, son necesarias algunas correcciones menores. Seleccione Analizador básico. Utilice todos los canales de imagen: Fase, Verde, Rojo y Superposición.NOTA: Aunque normalmente usamos máscaras de objetos verdes y rojas para contar las NET, la máscara de objetos superpuesta es útil cuando los escombros son importantes. En tales casos, el número de objetos superpuestos se utilizará como numeradores en lugar del recuento de objetos verdes (consulte el paso 3.9). Si se utiliza el recuento de objetos superpuestos en lugar del recuento de objetos verdes, todas las señales rojas deben contarse correctamente. Ajuste la configuración de la señal roja para contar todos los objetos rojos con señal roja baja en las imágenes tomadas en puntos de tiempo posteriores, pero no para contar los residuos. Elija de 6 a 8 imágenes de muestra representativas para el entrenamiento. Para el experimento aquí, incluya las siguientes imágenes:Imágenes tomadas entre 0 y 20 minutos para optimizar el ajuste de la señal verde para compensar las señales verdes sutiles que se pueden generar en neutrófilos no formadores de NETImágenes de NET máximos con control positivo, tomadas entre 3 y 6 h (el tiempo varía en función de la estimulación utilizada) para optimizar el ajuste de la señal verde para definir los neutrófilos formadores de NETImágenes tomadas alrededor del punto de tiempo de 1 h para contar el número total de células (teñidas con tinte rojo) ya que la señal roja nuclear es la más fuerte alrededor del punto de tiempo de 1 h (cuando todas las células se han asentado en el fondo del pocillo) y disminuye gradualmente debido a la muerte celular.Imágenes que contengan escombros, para excluirlos del recuento. Establezca la definición del análisis. Los objetos rojos y los objetos verdes se corresponden con los núcleos de todos los neutrófilos y los que están formando NETs, respectivamente. Comience con el siguiente ejemplo de y presione Vista previa actual o Vista previa de todo, y module cada parámetro para optimizar los resultados:Para verde: Segmentación- Resta de fondo: Sombrero de copa; Radio: 100 μM; Umbral: 0,3 GCU; División de bordes: Activado; Sensibilidad de los bordes: -20; Limpieza -Relleno de agujeros: 100 μm2; Ajuste el tamaño 0 píxeles; Filtros- Área: mín. 20 μm2, máx. 500 μm2; Excentricidad: máx. 0,97; Intensidad media: min 1.00Para Rojo: Segmentación- Resta de fondo: Sombrero de copa; Radio: 10 μM; Umbral: 1.0 GCU; División de bordes: ON; Sensibilidad de los bordes: -50; Relleno del orificio de limpieza: 50 μm2; Ajuste el tamaño 0 píxeles; Filtros- Área: mín. 20 μm2, máx. 400 μm2; Intensidad media: min 1.5.Si aparece una señal verde excesiva en neutrófilos que no deberían estar formando TNE (por ejemplo, neutrófilos no estimulados a 0 min que tienen núcleos lobulados), puede deberse a un desbordamiento de la señal roja detectada en el canal verde. En tal caso, regrese al paso 3.1, abra Capas de imagen a la izquierda de la pantalla y elimine las señales rojas del canal verde utilizando Desmezcla espectral. Otra opción es configurar un pocillo para tinción única con tinte rojo nuclear para aclarar qué parte de la señal roja debe eliminarse del canal verde. Por otro lado, por lo general, el sangrado de la señal verde en el canal rojo no afecta a los análisis.NOTA: No importa si la sensibilidad a la señal roja es baja y no todas las señales rojas se capturan en las imágenes que se toman en puntos de tiempo posteriores (por ejemplo, punto de tiempo de 6 h). El número máximo de objetos rojos en cada imagen se considera como el número total de neutrófilos en la imagen y se utilizará como denominador en el paso 3.9. Por lo general, las señales rojas nucleares alcanzan su punto máximo alrededor de 1 h y disminuyen gradualmente debido a la muerte celular (Figura 1B). Por lo tanto, ajuste la configuración de la señal roja para contar correctamente los objetos rojos en las imágenes con señales rojas máximas. Seleccione los tiempos de escaneo y los pozos que se van a analizar. Por lo general, se deben analizar todos los puntos de tiempo y pozos. Proporcione una etiqueta a la definición de análisis. Compruebe el resumen e inicie el análisis. Se tarda unas horas en completar el análisis (la duración depende del número de puntos de tiempo y pozos). Una vez iniciado, el nombre de la definición de análisis se mostrará debajo del nombre del estudio en la pestaña Ver y la fecha completa se mostrará cuando finalice. Una vez completado, abra el estudio analizado haciendo doble clic en el nombre de la definición del análisis. Abra Capas a la izquierda de la pantalla y verifique si cada celda está marcada correctamente. Si no está marcado correctamente, vuelva al paso 3.1 y repita los pasos siguientes. Haga clic en Métricas de gráfico a la izquierda de la pantalla para exportar los datos. Seleccione Recuento verde, Recuento rojo o Recuento de superposición (por imagen) y, a continuación, elija los puntos de tiempo y los pozos que desea exportar. Para seleccionar agrupación, seleccione Réplicas de mapa de placas si todos los pozos se especifican correctamente al finalizar la exploración. Exporte los datos. Calcule el porcentaje de celdas formadoras de NET para cada condición/punto de tiempo mediante la siguiente ecuación utilizando un software apropiado.NOTA: La razón por la que el denominador es el recuento máximo de objetos rojos es que el número de objetos rojos alcanza su punto máximo alrededor de 1 h y disminuye gradualmente debido a la muerte de la célula.