Technique à haut débit en temps réel pour quantifier la formation de pièges extracellulaires à neutrophiles dans les neutrophiles humains
Summary
Nous présentons une méthode automatisée à haut débit pour quantifier les pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles en utilisant le système d’analyse de cellules vivantes, couplée à une approche à double colorant dépendant de la perméabilité membranaire.
Abstract
Les neutrophiles sont des cellules de la lignée myéloïde qui constituent une partie cruciale du système immunitaire inné. La dernière décennie a révélé d’autres rôles clés que jouent les neutrophiles dans la pathogenèse du cancer, des maladies auto-immunes et de diverses affections inflammatoires aiguës et chroniques en contribuant à l’initiation et à la perpétuation de la dérégulation immunitaire par de multiples mécanismes, y compris la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), qui sont des structures cruciales dans la défense antimicrobienne. Les limites des techniques de quantification de la formation de TNE de manière impartiale, reproductible et efficace ont limité notre capacité à mieux comprendre le rôle des neutrophiles dans la santé et les maladies. Nous décrivons une méthode automatisée, en temps réel et à haut débit pour quantifier les neutrophiles en cours de formation de TNE à l’aide d’une plateforme d’imagerie de cellules vivantes couplée à une approche à double colorant dépendant de la perméabilité membranaire utilisant deux colorants d’ADN différents pour imager l’ADN intracellulaire et extracellulaire. Cette méthodologie permet d’évaluer la physiologie des neutrophiles et de tester des molécules capables de cibler la formation de TNE.
Introduction
Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont des structures chromatiniennes en forme de toile extrudées à partir de neutrophiles en réponse à divers stimuli inflammatoires. Les TNE sont composées d’ADN, d’histones et de diverses protéines/peptides antimicrobiens, qui piègent et tuent les agents pathogènes infectieux et provoquent des réponses inflammatoires1.
Bien que les TNE soient bénéfiques pour la défense de l’hôte contre les agents pathogènes, elles ont attiré l’attention en tant que moteur potentiel de diverses maladies auto-immunes2, thrombose3, maladies métaboliques4 et croissance métastatique des cancers5. En tant que tel, l’inhibition de la formation de TNE est une option thérapeutique potentielle pour ces maladies. Cependant, malgré certaines molécules prometteuses ciblant les TNE en développement6, il n’existe toujours pas de traitement approuvé qui affecte spécifiquement ce mécanisme. Cela est, au moins en partie, attribuable à l’absence de méthodes de quantification objectives, non biaisées, reproductibles et à haut débit pour la formation de TNE.
Nous avons établi et rapporté une nouvelle méthode utilisant une plateforme d’imagerie bicolore de cellules vivantes 7,8. Des images en accéléré de neutrophiles colorés avec un colorant nucléaire perméable à la membrane et un colorant d’ADN imperméable à la membrane sont analysées par le logiciel, et le nombre de neutrophiles pré et post-formation de TNE est compté à plusieurs moments. Étant donné que l’intégrité de la membrane plasmique est perdue lors de la formation des TNE par la régulation de la lamine B médiée par PKCα et du désassemblage de la lamine A/C médiée par CDK4/69, les neutrophiles formant des TNE sont colorés par un colorant d’ADN imperméable à la membrane, contrairement aux neutrophiles sains. Cette méthode surmonte les problèmes des techniques précédemment rapportées pour quantifier la formation de NET et fournit une quantification non biaisée, à haut débit, reproductible et précise de manière automatisée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes actuelles de quantification des TNE ex vivo présentent plusieurs inconvénients qui limitent notre capacité à étudier les neutrophiles, les TNE et les cibles thérapeutiques potentielles de manière impartiale et à haut débit10,14. Par exemple, le comptage direct des cellules formant des TNE après coloration immunofluorescente, considéré comme l’étalon-or pour la quantification des TNE, est à faible débit et dépend de la visi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la section d’imagerie lumineuse du Bureau des sciences et de la technologie de l’Institut national de l’arthrite et des maladies musculo-squelettiques et cutanées des National Institutes of Health. Cette recherche a été financée par le programme de recherche intra-muros de l’Institut national de l’arthrite et des maladies musculo-squelettiques et cutanées des National Institutes of Health (ZIA AR041199).
Materials
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
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