Summary

In-Vivo Imagerie calcique des neurones sensoriels dans le ganglion trijumeau du rat

Published: February 09, 2024
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Summary

Les indicateurs calciques codés génétiquement (GECI) permettent une analyse robuste de la signalisation des neurones sensoriels à l’échelle de la population. Ici, nous avons développé une nouvelle approche qui permet de visualiser in vivo l’activité des neurones des ganglions trijumeaux chez le rat.

Abstract

Les indicateurs calciques génétiquement codés (GECI) permettent aux techniques d’imagerie de surveiller les changements dans le calcium intracellulaire dans des populations cellulaires ciblées. Leur rapport signal/bruit élevé fait des GECI un outil puissant pour détecter l’activité évoquée par un stimulus dans les neurones sensoriels. Les GECI facilitent l’analyse au niveau de la population de l’encodage des stimuli avec le nombre de neurones pouvant être étudiés simultanément. Cet encodage de population est le plus approprié in vivo. Les ganglions de la racine dorsale (DRG), qui abritent le soma des neurones sensoriels innervant les structures somatiques et viscérales sous le cou, sont les plus largement utilisés pour l’imagerie in vivo car ces structures sont relativement faciles d’accès. Plus récemment, cette technique a été utilisée chez la souris pour étudier les neurones sensoriels du ganglion trijumeau (TG) qui innervent les structures buccales et craniofaciales. Il existe de nombreuses raisons d’étudier la TG en plus de la DRG, y compris la longue liste de syndromes douloureux spécifiques aux structures buccales et craniofaciales qui semblent refléter des changements dans l’activité des neurones sensoriels, tels que la névralgie du trijumeau. Les souris sont les plus utilisées dans l’étude des neurones DRG et TG en raison de la disponibilité d’outils génétiques. Cependant, avec des différences de taille, de facilité de manipulation et des différences d’espèces potentiellement importantes, il y a des raisons d’étudier les neurones TG du rat plutôt que de la souris. Ainsi, nous avons développé une approche pour l’imagerie des neurones TG de rat in vivo. Nous avons injecté des chiots nouveau-nés (p2) par voie intrapéritonéale avec un AAV codant pour GCaMP6s, ce qui a entraîné une infection de >90% des neurones TG et DRG. La TG a été visualisée chez l’adulte après craniotomie et décortication, et les changements dans la fluorescence de GCaMP6s ont été surveillés dans les neurones TG après stimulation des régions mandibulaires et maxillaires du visage. Nous avons confirmé que les augmentations de fluorescence étaient provoquées par un stimulus avec un bloc nerveux périphérique. Bien que cette approche ait de nombreuses utilisations potentielles, nous l’utilisons pour caractériser la ou les sous-populations de neurones TG modifiées à la suite d’une lésion des nerfs périphériques.

Introduction

La somatosensation, c’est-à-dire l’encodage neuronal des stimuli mécaniques, thermiques et chimiques qui affectent la peau ou d’autres structures corporelles, y compris les muscles, les os et les viscères, commence par l’activité des neurones afférents primaires qui innerventces structures. Les approches électrophysiologiques basées sur une seule unité ont fourni une mine d’informations sur les sous-types afférents impliqués dans ce processus ainsi que sur la façon dont leurs propriétés stimulus-réponses peuvent changer au fil du temps 1,2,3. Cependant, bien qu’il reste des preuves solides à l’appui de la théorie des lignes marquées, qui suggère que des modalités sensorielles spécifiques sont véhiculées par une ou plusieurs sous-populations spécifiques de neurones, la capacité de nombreuses sous-populations de neurones à répondre aux mêmes types de stimuli mécaniques, thermiques et chimiques suggère que la majorité des stimuli somatosensoriels sont codés par plusieurs sous-populations de neurones4, 5. Le Ainsi, une meilleure compréhension de la somatosensation ne viendra qu’avec la capacité d’étudier l’activité de 10, voire de centaines, de neurones simultanément.

Les progrès des approches optiques avec l’avènement relativement récent des techniques d’imagerie confocale et, par la suite, multiphotonique et numérique ont facilité la capacité d’effectuer des analyses relativement non invasives de l’activité neuronale à l’échelle de la population 6,7. L’un des derniers obstacles à l’application de cette technologie a été le développement d’outils permettant l’évaluation optique de l’activité neuronale. Compte tenu de la vitesse d’un potentiel d’action qui peut commencer et se terminer en moins d’une milliseconde, un colorant sensible à la tension ayant la capacité de suivre les changements de potentiel membranaire à la vitesse d’un potentiel d’action serait l’outil idéal à cet effet. Mais bien qu’il y ait eu d’énormes progrès dans ce domaine 7,8,9,10, le rapport signal/bruit pour beaucoup de ces colorants n’est pas encore assez élevé pour permettre une analyse de population de centaines de neurones au niveau d’une seule cellule. Comme approche alternative, les chercheurs se sont tournés vers la surveillance des changements dans la concentration intracellulaire de Ca2+ ([Ca2+]i). Les limites de cette stratégie sont claires dès le départ et comprennent le fait qu’une augmentation de [Ca2+]i est une mesure indirecte de l’activité neuronale11 ; qu’une augmentation de [Ca2+]i peut se produire indépendamment de l’afflux de Ca2+ associé à l’activation des canaux Ca2+ voltage-dépendants (VGCC)12,13 ; que l’amplitude et la durée d’un transitoire de Ca2+ peuvent être contrôlées par des processus indépendants de l’activité du VGCC 11,12,14 ; et que l’évolution temporelle des transitoires Ca2+ dépasse de loin celle d’un potentiel d’action15. Néanmoins, il existe un certain nombre d’avantages significatifs associés à l’utilisation du Ca2+ comme mesure indirecte de l’activité neuronale. Le rapport signal/bruit associé à la plupart des indicateurs de Ca2+ n’est pas le moindre, reflétant à la fois l’ampleur du changement de Ca2+ intracellulaire et le fait que le signal provient de l’espace tridimensionnel du cytosol plutôt que de l’espace bidimensionnel de la membrane cellulaire. De plus, avec le développement d’indicateurs de Ca2+ codés génétiquement (GECI), il est possible de tirer parti de stratégies génétiques pour stimuler l’expression des indicateurs de Ca2+ dans des sous-populations spécifiques de cellules, facilitant ainsi les analyses au niveau de la population dans des préparations intactes (voir par exemple, voir16).

Compte tenu du nombre d’outils génétiques maintenant disponibles chez la souris, il n’est pas surprenant que les GECI aient été les plus largement utilisés chez cette espèce. Des lignées de souris avec une expression constitutive de GECI dans des sous-populations de neurones sensoriels ont été développées 7,16,17. Avec le développement de lignées de souris exprimant des recombinases dans des types cellulaires spécifiques, il est possible d’utiliser des stratégies encore plus sophistiquées pour contrôler l’expression de GECI15. Cependant, bien que ces outils soient de plus en plus puissants, il existe un certain nombre de raisons pour lesquelles d’autres espèces, telles que les rats, pourraient être plus appropriées pour certaines questions expérimentales. Il s’agit notamment de la plus grande taille, facilitant un certain nombre de manipulations expérimentales qui sont difficiles, voire impossibles, chez la souris plus petite ; la facilité d’entraîner les rats à des tâches comportementales relativement complexes ; et au moins quelques preuves que les propriétés biophysiques et les modèles d’expression de plusieurs canaux ioniques dans les neurones sensoriels du rat peuvent être plus similaires à ceux observés dans les neurones sensoriels humains que ne le sont les mêmes canaux chez la souris par rapport à l’homme18.

Alors que la transduction des stimuli somatosensoriels se produit généralement dans les terminaisons périphériques des afférences primaires, le potentiel d’action initié à la périphérie doit passer à travers la structure qui abrite les somates afférents primaires, appelés ganglions de la racine dorsale (DRG) ou du trijumeau (TG) avant d’atteindre le système nerveux central19. Bien qu’il existe des preuves que tous les potentiels d’action se propageant le long d’un axone afférent primaire n’envahiront pas le corps cellulaire20, conséquence du fait que les somata afférents primaires sont connectés à l’axone afférent principal via une jonction en T19, la majorité des potentiels d’action initiés à la périphérie semblent envahir le soma21. Cela confère trois avantages expérimentaux lors de l’utilisation de GECI pour évaluer le codage de population dans les afférences primaires : la grande taille du corps cellulaire par rapport aux axones augmente encore le rapport signal/bruit lors de l’utilisation de [Ca2+]i comme mesure indirecte de l’activité afférente ; les DRG sont généralement faciles d’accès ; et l’évaluation de l’activité sur un site éloigné dans l’espace des terminaisons afférentes minimise l’impact potentiel de la chirurgie nécessaire pour exposer les ganglions sur les propriétés stimulus-réponse des terminaisons afférentes. Cependant, comme les TG sont situés sous le cerveau (ou au-dessus de la palette), ils sont beaucoup plus difficiles d’accès que les DRG. De plus, bien qu’il existe de nombreuses similitudes entre les neurones DRG et TG, il existe également une liste croissante de différences. Cela inclut l’organisation grossièrement somatotopique des neurones dans le TG22, des structures uniques innervées, différents modèles de terminaison terminale centrale 23,24,25,26, et maintenant une liste croissante de différences dans l’expression des gènes27,28 et l’expression des récepteurs fonctionnels29. De plus, parce que nous nous intéressons à l’identification des mécanismes périphériques de la douleur, le nombre relativement élevé de syndromes douloureux qui semblent être uniques au système trijumeau (par exemple, migraine, névralgie du trijumeau, syndrome de la bouche brûlante) qui semblent impliquer une activité aberrante dans les afférences primaires 30,31,32, suggère que le TG doit être étudié directement.

Ainsi, bien que les propriétés stimulus-réponse des neurones TG aient été étudiées avec des GECI chez la souris16, parce que les raisons énumérées ci-dessus suggèrent que le rat pourrait être une espèce plus appropriée pour répondre à une variété de questions expérimentales, le but de la présente étude était de développer une approche pour utiliser les GECI pour étudier les neurones TG chez le rat. Pour y parvenir, nous avons utilisé une approche virale pour piloter l’expression des GECI GCaMP6 dans le système nerveux périphérique. Nous avons ensuite retiré le cerveau antérieur pour permettre l’accès au TG. Enfin, des stimuli mécaniques et thermiques ont été appliqués au visage tandis que les réponses neuronales ont été évaluées par microscopie à fluorescence. Ensemble, ces données soutiennent un rôle dans l’utilisation du rat pour étudier les changements dans le TG dans de nombreux États, élargissant ainsi la boîte à outils pour les chercheurs intéressés par le codage sensoriel dans le système trijumeau.

Protocol

Toutes les expériences impliquant l’utilisation d’animaux dans la recherche ont été réalisées conformément aux normes mises de l’avant par les National Institutes of Health et l’Association internationale pour l’étude de la douleur et ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh (protocole #22051100). À la fin de chaque expérience, les rats ont été euthanasiés par exanguination avec perfusion cardiaque de solution s…

Representative Results

Comme nous avons déjà eu du succès avec le sérotype AAV9 pour l’infection des neurones sensoriels du rat15, nous avons utilisé ce sérotype pour l’expression des GCaMP6 dans les neurones TG du rat. Nous avons donc d’abord cherché à évaluer l’efficacité de l’infection des neurones sensoriels par AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) lorsque ce virus a été administré à des ratons nouveau-nés20. Ce virus utilise le promoteur CAG, qui entraîne et main…

Discussion

Ici, nous démontrons un moyen rapide et non invasif de générer un rat GECI pour l’imagerie du TG. Nous avons choisi un promoteur CAG pour piloter et maintenir des niveaux élevés d’expression génique. Alors que des études antérieures suggèrent que d’autres sérotypes d’AAV peuvent influencer efficacement l’expression des gènes dans les neurones DRG39, nos résultats sont cohérents avec une étude récente impliquant l’injection intrapéritonéale d’AAV chez les nouveau-nés…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier les Drs Kathy Albers et Brian Davis pour l’utilisation de leur programme Leica Microscope and Metamorph, Charles Warwick pour l’aide qu’il a apportée à la construction de notre appareil thermique Peltier, et le Dr Raymond Sekula pour son aide au dépannage de la préparation chirurgicale. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health : F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) et R01NS122784 (MSG et RS).

Materials

AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

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Cite This Article
Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

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