Summary

In Vivo Imaging del calcio dei neuroni sensoriali nel ganglio trigeminale del ratto

Published: February 09, 2024
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Summary

Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) consentono una solida analisi a livello di popolazione della segnalazione sensoriale dei neuroni. Qui, abbiamo sviluppato un nuovo approccio che consente la visualizzazione GECI in vivo dell’attività dei neuroni dei gangli trigeminali del ratto.

Abstract

Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) consentono alle tecniche di imaging di monitorare i cambiamenti nel calcio intracellulare nelle popolazioni cellulari bersaglio. Il loro elevato rapporto segnale/rumore rende i GECI un potente strumento per rilevare l’attività evocata dallo stimolo nei neuroni sensoriali. I GECI facilitano l’analisi a livello di popolazione della codifica dello stimolo con il numero di neuroni che possono essere studiati contemporaneamente. Questa codifica di popolazione viene eseguita in modo più appropriato in vivo. I gangli delle radici dorsali (DRG), che ospitano il soma dei neuroni sensoriali che innervano le strutture somatiche e viscerali sotto il collo, sono utilizzati più ampiamente per l’imaging in vivo perché queste strutture sono accessibili in modo relativamente semplice. Più recentemente, questa tecnica è stata utilizzata nei topi per studiare i neuroni sensoriali nel ganglio trigemino (TG) che innervano le strutture orali e craniofacciali. Ci sono molte ragioni per studiare la TG oltre alla DRG, inclusa la lunga lista di sindromi dolorose specifiche per le strutture orali e craniofacciali che sembrano riflettere cambiamenti nell’attività dei neuroni sensoriali, come la nevralgia del trigemino. I topi sono utilizzati più ampiamente nello studio dei neuroni DRG e TG a causa della disponibilità di strumenti genetici. Tuttavia, con le differenze nelle dimensioni, nella facilità di manipolazione e nelle differenze di specie potenzialmente importanti, ci sono ragioni per studiare i neuroni TG dei ratti piuttosto che quelli dei topi. Pertanto, abbiamo sviluppato un approccio per l’imaging dei neuroni TG di ratto in vivo. Abbiamo iniettato cuccioli neonatali (p2) per via intraperitoneale con un AAV codificante GCaMP6s, con conseguente infezione del >90% di entrambi i neuroni TG e DRG. La TG è stata visualizzata nell’adulto dopo craniotomia e decorticazione e i cambiamenti nella fluorescenza di GCaMP6s sono stati monitorati nei neuroni TG dopo la stimolazione delle regioni mandibolari e mascellari del viso. Abbiamo confermato che gli aumenti di fluorescenza sono stati stimolati con il blocco del nervo periferico. Sebbene questo approccio abbia molti usi potenziali, lo stiamo usando per caratterizzare le sottopopolazioni di neuroni TG modificati a seguito di lesioni dei nervi periferici.

Introduction

La somatosensazione, la codifica neurale di stimoli meccanici, termici e chimici che colpiscono la pelle o altre strutture corporee, inclusi muscoli, ossa e visceri, inizia con l’attività nei neuroni afferenti primari che innervano queste strutture1. Gli approcci elettrofisiologici basati su singole unità hanno fornito una grande quantità di informazioni sui sottotipi afferenti coinvolti in questo processo e su come le loro proprietà stimolo-risposta possono cambiare nel tempo 1,2,3. Tuttavia, mentre rimangono forti prove a sostegno della teoria della linea marcata, che suggerisce che specifiche modalità sensoriali sono veicolate da specifiche sottopopolazioni di neuroni, la capacità di molte sottopopolazioni di neuroni di rispondere agli stessi tipi di stimoli meccanici, termici e chimici suggerisce che la maggior parte degli stimoli somatosensoriali sono codificati da più sottopopolazioni di neuroni4, 5. Introduzione Pertanto, una migliore comprensione della somatosensazione arriverà solo con la capacità di studiare l’attività di 10, se non centinaia, di neuroni contemporaneamente.

I progressi negli approcci ottici con l’avvento relativamente recente delle tecniche di imaging confocale e, successivamente, multifotone e digitale hanno facilitato la capacità di eseguire analisi relativamente non invasive a livello di popolazione dell’attività neuronale 6,7. Uno degli ultimi ostacoli nell’applicazione di questa tecnologia è stato lo sviluppo di strumenti per consentire la valutazione ottica dell’attività neurale. Data la velocità di un potenziale d’azione che può iniziare e finire in meno di un millisecondo, un colorante sensibile al voltaggio con la capacità di seguire le variazioni del potenziale di membrana alla velocità di un potenziale d’azione sarebbe lo strumento ideale per questo scopo. Ma mentre ci sono stati enormi progressi in quest’area 7,8,9,10, il rapporto segnale-rumore per molti di questi coloranti non è ancora abbastanza alto da consentire un’analisi della popolazione di centinaia di neuroni a livello di singola cellula. Come approccio alternativo, i ricercatori si sono rivolti al monitoraggio dei cambiamenti nella concentrazione intracellulare di Ca2+ ([Ca2+]i). I limiti di questa strategia sono stati chiari fin dall’inizio e includono il fatto che un aumento di [Ca2+]i è una misura indiretta dell’attività neurale11; che un aumento di [Ca2+]i può verificarsi indipendentemente dall’afflusso di Ca2+ associato all’attivazione dei canali Ca2+ voltaggio-dipendenti (VGCC)12,13; che l’entità e la durata di un transitorio di Ca2+ possono essere controllate da processi indipendenti dall’attività del VGCC 11,12,14; e che il decorso temporale dei transitori di Ca2+ supera di gran lunga quello di un potenziale d’azione15. Tuttavia, ci sono una serie di vantaggi significativi associati all’uso di Ca2+ come misura indiretta dell’attività neurale. Non ultimo di questi è il rapporto segnale-rumore associato alla maggior parte degli indicatori di Ca2+, che riflette sia l’entità del cambiamento nel Ca2+ intracellulare che il fatto che il segnale proviene dallo spazio tridimensionale del citosol piuttosto che dallo spazio bidimensionale della membrana cellulare. Inoltre, con lo sviluppo di indicatori di Ca2+ geneticamente codificati (GECI), è possibile sfruttare strategie genetiche per guidare l’espressione degli indicatori di Ca2+ in specifiche sottopopolazioni di cellule, facilitando le analisi a livello di popolazione in preparati intatti (ad esempio, vedi16).

Dato il numero di strumenti genetici ora disponibili nei topi, non dovrebbe sorprendere che i GECI siano stati utilizzati più ampiamente in questa specie. Sono state sviluppate linee murine con espressione GECI costitutiva in sottopopolazioni di neuroni sensoriali 7,16,17. Con lo sviluppo di linee murine che esprimono ricombinasi in specifici tipi di cellule, è possibile utilizzare strategie ancora più sofisticate per controllare l’espressione di GECI15. Tuttavia, mentre questi strumenti sono sempre più potenti, ci sono una serie di ragioni per cui altre specie, come i ratti, potrebbero essere più appropriate per alcune domande sperimentali. Questi includono le dimensioni maggiori, che facilitano una serie di manipolazioni sperimentali che sono difficili, se non impossibili, nel topo più piccolo; la facilità di addestrare i ratti in compiti comportamentali relativamente complessi; e almeno alcune prove che le proprietà biofisiche e i modelli di espressione di diversi canali ionici nei neuroni sensoriali di ratto possono essere più simili a quelli osservati nei neuroni sensoriali umani di quanto non lo siano gli stessi canali nel topo rispetto a quelli umani18.

Mentre la trasduzione degli stimoli somatosensoriali avviene generalmente nei terminali periferici delle afferenze primarie, il potenziale d’azione avviato in periferia deve passare attraverso la struttura che ospita i somati afferenti primari, denominati gangli della radice dorsale (DRG) o trigemino (TG) prima di raggiungere il sistema nervoso centrale19. Mentre ci sono prove che non tutti i potenziali d’azione che si propagano lungo un assone afferente primario invaderanno il corpo cellulare20, una conseguenza del fatto che i somati afferenti primari sono collegati all’assone afferente principale tramite una giunzione a T19, la maggior parte dei potenziali d’azione iniziati nella periferia sembrano invadere il soma21. Ciò conferisce tre vantaggi sperimentali quando si utilizzano GECI per valutare la codifica di popolazione nelle afferenze primarie: le grandi dimensioni del corpo cellulare rispetto agli assoni aumentano ulteriormente il rapporto segnale/rumore quando si utilizza [Ca2+]i come misura indiretta dell’attività afferente; i DRG sono generalmente di facile accesso; E la valutazione dell’attività in un sito spazialmente lontano dai terminali afferenti riduce al minimo il potenziale impatto dell’intervento chirurgico necessario per esporre i gangli sulle proprietà stimolo-risposta dei terminali afferenti. Tuttavia, poiché i TG si trovano sotto il cervello (o sopra la tavolozza), sono molto più difficili da accedere rispetto ai DRG. Inoltre, mentre ci sono molte somiglianze tra i neuroni DRG e TG, c’è anche un elenco crescente di differenze. Ciò include l’organizzazione approssimativamente somatotopica dei neuroni nel TG22, strutture uniche innervate, diversi modelli di terminazione terminale centrale 23,24,25,26 e ora un elenco crescente di differenze sia nell’espressione genica27,28 che nell’espressione funzionale del recettore29. Inoltre, poiché siamo interessati all’identificazione dei meccanismi periferici del dolore, il numero relativamente elevato di sindromi dolorose che sembrano essere uniche per il sistema trigemino (ad esempio, emicrania, nevralgia del trigemino, sindrome della bocca urente) che sembrano coinvolgere un’attività aberrante nelle afferenze primarie 30,31,32, suggerisce che la TG deve essere studiata direttamente.

Così, mentre le proprietà stimolo-risposta dei neuroni TG sono state studiate con GECI nel topo16, perché le ragioni sopra elencate suggeriscono che il ratto potrebbe essere una specie più appropriata per affrontare una varietà di domande sperimentali, lo scopo del presente studio è stato quello di sviluppare un approccio per utilizzare i GECI per studiare i neuroni TG nel ratto. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo utilizzato un approccio virale per guidare l’espressione dei GECI GCaMP6 nel sistema nervoso periferico. Abbiamo quindi rimosso il prosencefalo per consentire l’accesso al TG. Infine, sono stati applicati stimoli meccanici e termici al viso mentre le risposte neuronali sono state valutate al microscopio a fluorescenza. Insieme, questi dati supportano un ruolo per l’utilizzo del ratto per studiare i cambiamenti nel TG in molti stati, ampliando il kit di strumenti per i ricercatori interessati alla codifica sensoriale nel sistema trigemino.

Protocol

Tutti gli esperimenti che prevedono l’uso di animali nella ricerca sono stati eseguiti in conformità con gli standard stabiliti dal National Institutes of Health e dall’International Association for the Study of Pain e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l’Uso degli Animali dell’Università di Pittsburgh (protocollo #22051100). Alla fine di ogni esperimento, i ratti sono stati sottoposti a eutanasia tramite eutanasia con perfusione cardiaca di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (…

Representative Results

Poiché in precedenza abbiamo avuto successo con il sierotipo AAV9 per l’infezione dei neuroni sensoriali di ratto15, abbiamo usato questo sierotipo per l’espressione di GCaMP6 nei neuroni TG di ratto. Abbiamo quindi cercato di valutare l’efficienza dell’infezione da neuroni sensoriali di AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) quando questo virus è stato somministrato a cuccioli di rattoneonatale 20. Questo virus utilizza il promotore CAG, che guida e mantiene alti livell…

Discussion

Qui, dimostriamo un modo rapido e non invasivo di generare un ratto GECI per l’imaging del TG. Abbiamo scelto un promotore CAG per guidare e mantenere alti livelli di espressione genica. Mentre studi precedenti suggeriscono che altri sierotipi AAV possono guidare in modo efficiente l’espressione genica nei neuroni DRG39, i nostri risultati sono coerenti con un recente studio che coinvolge l’iniezione intraperitoneale di AAV nei neonati32, indicando che il sierotipo AAV9 è …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare i dottori Kathy Albers e Brian Davis per l’uso del loro microscopio Leica e del programma Metamorph, Charles Warwick per aver contribuito a costruire il nostro dispositivo termico Peltier e il dottor Raymond Sekula per aver contribuito alla risoluzione dei problemi della preparazione chirurgica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) e R01NS122784 (MSG e RS).

Materials

AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

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Cite This Article
Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

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