Summary

In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

Published: February 09, 2024
doi:

Summary

מדדי סידן מקודדים גנטית (GECI) מאפשרים ניתוח חזק ברמת האוכלוסייה של איתות נוירונים חושי. כאן, פיתחנו גישה חדשנית המאפשרת הדמיית GECI in vivo של פעילות גרעיני גרעינים של חולדות.

Abstract

מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs) מאפשרים טכניקות הדמיה לניטור שינויים בסידן תוך-תאי באוכלוסיות תאים ממוקדות. יחס האות לרעש הגדול שלהם הופך את GECIs לכלי רב עוצמה לזיהוי פעילות מעוררת גירוי בנוירונים חושיים. GECIs מאפשרים ניתוח ברמת האוכלוסייה של גירוי המקודד למספר הנוירונים שניתן לחקור בו זמנית. קידוד אוכלוסייה זה נעשה בצורה המתאימה ביותר in vivo. גרעיני שורש דורסלי (DRG), המאכלסים את הסומה של נוירונים חושיים המעצבבים מבנים סומטיים וקרביים מתחת לצוואר, נמצאים בשימוש נרחב ביותר עבור דימות in vivo מכיוון שמבנים אלה נגישים בקלות יחסית. לאחרונה, טכניקה זו שימשה בעכברים לחקר נוירונים חושיים בגנגליון הטריגמינלי (TG) המעצבב מבנים אוראליים וגולגולתיים. ישנן סיבות רבות לחקור TG בנוסף ל- DRG, כולל רשימה ארוכה של תסמונות כאב ספציפיות למבני הפה והגולגולת שנראה כי הן משקפות שינויים בפעילות הנוירונים התחושתיים, כגון trigeminal neuralgia. עכברים נמצאים בשימוש נרחב ביותר במחקר של נוירונים DRG ו- TG בגלל הזמינות של כלים גנטיים. עם זאת, עם הבדלים בגודל, קלות הטיפול והבדלי מינים שעשויים להיות חשובים, יש סיבות לחקור נוירונים TG של חולדות ולא עכברים. לכן, פיתחנו גישה להדמיית תאי עצב TG של חולדות in vivo. הזרקנו לגורים ילודים (p2) תוך צפקית AAV המקודד GCaMP6s, וכתוצאה מכך נגרם זיהום של >90% הן בתאי עצב TG והן בתאי עצב DRG. TG הודגמה במבוגר לאחר קרניוטומיה ודקורציה, ושינויים בפלואורסצנטיות GCaMP6s נוטרו בנוירונים TG בעקבות גירוי של אזורים מנדיבולריים ומקסילריים של הפנים. אישרנו כי עליות פלואורסצנטיות היו מעוררות גירוי עם בלוק עצבי היקפי. בעוד שלגישה זו יש שימושים פוטנציאליים רבים, אנו משתמשים בה כדי לאפיין את תת-האוכלוסיות של נוירוני TG שהשתנו בעקבות פגיעה עצבית היקפית.

Introduction

Somatosensation, הקידוד העצבי של גירויים מכניים, תרמיים וכימיים הפוגעים בעור או במבנים גופניים אחרים, כולל שרירים, עצמות וקרביים, מתחיל בפעילות בתאי עצב ראשוניים המעצבבים מבנים אלה1. גישות אלקטרופיזיולוגיות מבוססות יחידה אחת סיפקו שפע של מידע על תת-הסוגים המשפיעים המעורבים בתהליך זה, כמו גם כיצד תכונות הגירוי-תגובות שלהם עשויות להשתנות עם הזמן 1,2,3. עם זאת, בעוד שנותרו ראיות חזקות התומכות בתיאוריית הקו המסומן, אשר מציעה כי שיטות חושיות ספציפיות מועברות על-ידי תת-אוכלוסיות ספציפיות של נוירונים, היכולת של תת-אוכלוסיות רבות של תאי עצב להגיב לאותם סוגים של גירויים מכניים, תרמיים וכימיים מצביעה על כך שרוב הגירויים הסומטוסנסוריים מקודדים על-ידי תת-אוכלוסיות מרובות של תאי עצב4, 5. לכן, הבנה טובה יותר של somatosensation תגיע רק עם היכולת לחקור את הפעילות של 10, אם לא מאות, של נוירונים בו זמנית.

ההתקדמות בגישות אופטיות עם הופעתן לאחרונה יחסית של טכניקות הדמיה קונפוקליות, ולאחר מכן, מולטיפוטונים ודיגיטליים אפשרו את היכולת לבצע ניתוחים לא פולשניים יחסית ברמת האוכלוסייה של פעילות עצבית 6,7. אחד המכשולים האחרונים ביישום טכנולוגיה זו היה פיתוח כלים המאפשרים הערכה אופטית של פעילות עצבית. בהתחשב במהירות של פוטנציאל פעולה שיכול להתחיל ולהסתיים בפחות מאלפית השנייה, צבע רגיש למתח עם היכולת לעקוב אחר שינויים בפוטנציאל הממברנה במהירות של פוטנציאל פעולה יהיה הכלי האידיאלי למטרה זו. אולם בעוד שחלה התקדמות עצומה בתחום זה 7,8,9,10, יחס האות לרעש עבור רבים מהצבעים האלה עדיין אינו גבוה מספיק כדי לאפשר ניתוח אוכלוסייה של מאות תאי עצב ברמת התא הבודד. כגישה חלופית, החוקרים פנו לניטור שינויים בריכוז Ca2+ תוך תאי ([Ca2+]i). המגבלות באסטרטגיה זו היו ברורות מלכתחילה וכוללות את העובדה שעלייה ב-[Ca2+]i היא מדד עקיף לפעילות עצבית11; שעלייה ב-[Ca2+]i עשויה להתרחש ללא תלות בזרם Ca2+ הקשור להפעלת ערוצי Ca2+ מגודרים במתח (VGCCs)12,13; שהגודל ומשך הזמן של ארעי Ca2+ ניתנים לשליטה על ידי תהליכים שאינם תלויים בפעילות VGCC 11,12,14; וכי מהלך הזמן של Ca2+ transients עולה בהרבה על זה של פוטנציאל פעולה15. עם זאת, ישנם מספר יתרונות משמעותיים הקשורים לשימוש Ca2+ כמדד עקיף של פעילות עצבית. לא פחות מהם הוא יחס האות לרעש הקשור לרוב מחווני Ca2+, המשקף הן את גודל השינוי ב- Ca2+ תוך תאי והן את העובדה שהאות נובע מהמרחב התלת-ממדי של הציטוזול ולא מהמרחב הדו-ממדי של קרום התא. יתר על כן, עם הפיתוח של אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECI’s), ניתן לנצל אסטרטגיות גנטיות כדי להניע את הביטוי של אינדיקטורים Ca2+ בתת-אוכלוסיות ספציפיות של תאים, להקל על ניתוח ברמת האוכלוסייה בהכנות שלמות (למשל, ראה16).

בהתחשב במספר הכלים הגנטיים הזמינים כיום בעכברים, אין זה מפתיע ש- GECI נמצא בשימוש נרחב ביותר במין זה. קווי עכבר עם ביטוי GECI מכונן בתת-אוכלוסיות של נוירונים חושיים פותחו 7,16,17. עם התפתחות קווי עכבר המבטאים רקומבינאזות בסוגי תאים ספציפיים, ניתן להשתמש באסטרטגיות מתוחכמות עוד יותר כדי לשלוט בביטוי GECI15. עם זאת, בעוד שהכלים האלה חזקים יותר מאי פעם, ישנן מספר סיבות לכך שמינים אחרים, כמו חולדות, עשויים להתאים יותר לשאלות ניסוייות מסוימות. אלה כוללים את הגודל הגדול יותר, המאפשר מספר מניפולציות ניסיוניות שקשות, אם לא בלתי אפשריות, בעכבר הקטן יותר; קלות אילוף חולדות במשימות התנהגותיות מורכבות יחסית; ולפחות כמה ראיות לכך שתכונות ביופיזיות ודפוסי ביטוי של כמה תעלות יונים בנוירונים חושיים של חולדות עשויים להיות דומים יותר לאלה שנצפו בנוירונים חושיים אנושיים מאשר אותם ערוצים בעכבר ביחס לבני אדם18.

בעוד שהטרנסדוקציה של גירויים סומטוסנסוריים מתרחשת בדרך כלל במסופים ההיקפיים של האפרנטים הראשוניים, פוטנציאל הפעולה המתחיל בפריפריה חייב לעבור דרך המבנה המאכלס סומאטה אפרנטית ראשונית, המכונה גרעיני שורש גבי (DRG) או טריגמינל (TG) לפני שהוא מגיע למערכת העצבים המרכזית19. בעוד שישנן ראיות לכך שלא כל פוטנציאל פעולה המתפשט לאורך אקסון אפירנט ראשוני יפלוש לגוף התא20, תוצאה של העובדה שהסומטה האפרנטית הראשונית מחוברת לאקסון האמפרנט הראשי דרך צומת T19, נראה שרוב פוטנציאלי הפעולה המופעלים בפריפריה פולשים לסומה21. זה מעניק שלושה יתרונות ניסיוניים בעת שימוש ב- GECIs כדי להעריך קידוד אוכלוסייה ב- afferents ראשוניים: הגודל הגדול של גוף התא ביחס לאקסונים מגדיל עוד יותר את האות לרעש בעת שימוש ב- [Ca2+]i כמדד עקיף לפעילות afferent; DRG הם בדרך כלל קל לגישה; והערכת הפעילות באתר המרוחק מרחבית מהטרמינלים האפרנטיים ממזערת את ההשפעה הפוטנציאלית של הניתוח הדרוש לחשיפת הגרעינים על תכונות הגירוי-תגובה של הטרמינלים האפרנטיים. עם זאת, מאחר שTG ממוקמים מתחת למוח (או מעל לוח הצבעים), הם הרבה יותר קשים לגישה מאשר DRG. יתר על כן, בעוד שיש קווי דמיון רבים בין נוירונים DRG ונוירונים TG, יש רשימה הולכת וגדלה של הבדלים גם כן. זה כולל את הארגון הסומטוטופי בערך של תאי עצב ב- TG22, מבנים ייחודיים עצביים, דפוסי סיום מסוף מרכזי שונים 23,24,25,26, וכעת רשימה הולכת וגדלה של הבדלים הן בביטוי גנים 27,28 והן בביטוי קולטן פונקציונלי29. בנוסף, מכיוון שאנו מתעניינים בזיהוי מנגנונים היקפיים של כאב, המספר הגדול יחסית של תסמונות כאב שנראות ייחודיות למערכת הטריגמינלית (למשל, מיגרנה, נוירלגיה טריגמינלית, תסמונת הפה השורף) שנראות כמערבות פעילות חריגה בגורמים ראשוניים 30,31,32, מצביע על כך שיש לחקור את TG ישירות.

לכן, בעוד תכונות גירוי-תגובה של נוירונים TG נחקרו עם GECIs בעכבר16, מאחר שהסיבות המפורטות לעיל מצביעות על כך שהחולדה עשויה להיות מין מתאים יותר לענות על מגוון שאלות ניסוייות, מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח גישה לשימוש ב-GECIs לחקר נוירוני TG בחולדה. כדי להשיג זאת, השתמשנו בגישה ויראלית כדי להניע את הביטוי של GECI GCaMP6s במערכת העצבים ההיקפית. לאחר מכן הסרנו את המוח הקדמי כדי לאפשר גישה ל-TG. לבסוף, גירויים מכניים ותרמיים הוחלו על הפנים בעוד תגובות עצביות הוערכו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יחד, נתונים אלה תומכים בתפקיד של ניצול החולדה לחקר שינויים בTG במצבים רבים, ומרחיבים את ארגז הכלים לחוקרים המעוניינים בקידוד חושי במערכת הטריגמינלית.

Protocol

כל הניסויים הכרוכים בשימוש בבעלי חיים במחקר בוצעו בהתאם לסטנדרטים שנקבעו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות והאגודה הבינלאומית לחקר הכאב ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פיטסבורג (פרוטוקול #22051100). בסוף כל ניסוי, חולדות הומתו באמצעות הרדמה עם זילוח לב של מלח …

Representative Results

מאחר שבעבר הייתה לנו הצלחה עם סרוטיפ AAV9 לזיהום של נוירונים חושיים15 של חולדות, השתמשנו בסרוטיפ הזה לביטוי של GCaMP6s בתאי עצב TG של חולדות. לכן ביקשנו תחילה להעריך את יעילות הזיהום של תאי עצב חושיים של AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) כאשר הנגיף הזה ניתן לגורי חולדות בילודים20. ויר…

Discussion

כאן, אנו מדגימים דרך מהירה ולא פולשנית ליצירת חולדת GECI לצורך הדמיה של TG. בחרנו בפרומוטור CAG כדי להניע ולשמור על רמות גבוהות של ביטוי גנים. בעוד שמחקרים קודמים מצביעים על כך שסרוטיפים אחרים של AAV עשויים להניע ביעילות ביטוי גנים בנוירוני DRG39, התוצאות שלנו עולות בקנה אחד עם מחקר שנ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לד”ר קתי אלברס וד”ר בריאן דייוויס על השימוש בתוכנית המיקרוסקופ והמטמורף של Leica שלהם, לצ’ארלס וורוויק על עזרתם בבניית מכשיר פלטייה תרמי שלנו, ולד”ר ריימונד סקולה על עזרתו בפתרון בעיות בהכנה הניתוחית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) ו- R01NS122784 (MSG ו- RS).

Materials

AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40  Addgene 100844-AAV9 AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate Covetrus 11695-0095-5 10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection AKORN Animal Health 23076-35-9 20 mg/mL
CTR5500 Electronics box Leica 11 888 820 Power Supply
Cutwell burr drill bit Ransom & Randolph ¼ round
DM 6000 FS Leica 11 888 928 Base Stand
EL6000 Leica EL6000 Light source with 120 W mercury bulb
Forceps FST 11252-00 Dumont No. 05
Friedman rongeurs FST 16000-14 2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs FST 16021-14 1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad) STRYKER 8002-062-022
Ketamine hydrochloride Covetrus 1695-0703-1 100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40 Leica MRH00105 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen Bovie HIT1 handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B Photometrics Prime 95B CMOS Camera
Saline Fisher Scientific NC0291799 0.9% Sterile Saline
Scalpel blade Fisher Scientific 22-079-701 size 15 disposable blade
Spatula BRI 48-1460 brain spatula
Spring scissors FST 91500-09 Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors FST 15012-12 Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel Leica 11 501 255 Control Panel
Syringe Hamilton 80201 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater Adroit HTP-1500

References

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. . The Senses: A Comprehensive Reference. , (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826 (2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083 (2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199 (2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225 (2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535 (2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007 (2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959 (2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526 (2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84 (2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173 (2019).

Play Video

Cite This Article
Gedeon, J. Y., Pineda-Farias, J. B., Gold, M. S. In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion. J. Vis. Exp. (204), e65978, doi:10.3791/65978 (2024).

View Video