Создание двумерной однослойной системы культивирования первичного энтероида крупного рогатого скота для применения в трансляционных биомедицинских исследованиях

Все протоколы были выполнены в соответствии с институциональными и национальными руководящими принципами и правилами по благополучию животных. 1. Приготовление реагента ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы и конечные концентрации реагентов, использованных в данном исследовании, приведены в таблице 1. Подготовьте буфер для взятия проб: смешайте 1 л ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), гентамицин (25 мкг/мл) и каспофунгин (2,5 мкг/мл). Храните исходный раствор при температуре 4 °C. Приготовьте реагент для диссоциации #1: смешайте 18,55 мл буфера для сбора образцов (как описано на шаге 1.1), 1,422 мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, 0,422 М/pH 7,4), 20 мкл 1 М раствора 1,4-дитиотрейтола (DTT), 4 мкл раствора Y-27632 (5000x/50 мМ). Хранить раствор при температуре 4 °C. Приготовьте диссоциационный реагент #2: смешайте 18,57 мл буфера для сбора (как описано в шаге 1.1), 1,422 мл ЭДТА (0,422 М/рН 7,4), 4 мкл раствора Y-27632 (5000x/50 мМ). Хранить раствор при температуре 37 °C. Подготовьте запас питательной среды для энтероидов: смешайте 9,875 мл органоидной питательной среды плюс добавку, 100 мкл пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), 5 мкл гентамицина (25 мкг/мл) и 20 мкл каспофунгина (2,5 мкг/мл). Хранить раствор при температуре 4 °C. Подготовьте материал для дифференцировки энтероидов: смешайте 10 мл среды для дифференцировки органоидов с добавкой, 100 мкл пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), 5 мкл гентамицина (25 мкг/мл) и 20 мкл каспофунгина (2,5 мкг/мл). Хранить раствор при температуре -20 °C. Подготовьте промывочную среду: смешайте 48,45 мл среды DMEM/F-12 1,1 (с L-глютамином, без HEPES), 1 мл добавки B27 без витамина A (50x бульона), 500 мкл пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), 25 мкл гентамицина (50 мг/мл бульона) и 25 мкл каспофунгина (5 мг/мл бульона). Хранить раствор при температуре 4 °C. Подготовьте буфер для покрытия: смешайте 25 мл полной среды DMEM: F12 без ингибиторов и 25 мг бычьего сывороточного альбумина (BSA). Хранить раствор при температуре 4 °C. 2. Выделение кишечных крипт из цельной ткани (рисунок 1) ПРИМЕЧАНИЕ: Энтероиды тонкого кишечника крупного рогатого скота были получены из подвздошной ткани, полученной от здоровых взрослых бычков голштинской породы (>2 года) с местного завода по переработке говядины. Для этой серии экспериментов был использован один донор. Подготовка образцов тканей кишечникаПоместите собранные образцы кишечной ткани размером ~10 дюймов (25 см) в ~400 мл ледяного буфера для сбора (антибиотики/антимикотики PBS+) и положите на лед для транспортировки в лабораторию. С помощью хирургических ножниц (например, ножниц Майо) и щипцов (например, щипцов Адсона) удалите лишний жир и брыжейку из образца ткани кишечника. Разрежьте ткань на две равные части. Хирургическими ножницами вскрыть ткань в продольном направлении и промыть ткань в стерильном ПБС. Аккуратно удалите слой слизи образца кишечника с помощью предметного стекла стерильного стекла для микроскопа и промойте ткань свежим PBS.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап помогает удалить ворсинки и способствует повышению чистоты фракций крипты на последующих этапах. Для каждого кусочка размером 5 дюймов (13 см) разрежьте ткань на две части по 2,5 дюйма (6,5 см), а затем разрежьте каждый кусок на 4 примерно равных маленьких кусочка, чтобы облегчить диссоциацию тканей. Диссоциация тканей кишечникаПриготовьте объем 20 мл реагента для диссоциации ткани #1 в стерильной конической пробирке объемом 50 мл и поместите небольшие образцы тканей в коническую пробирку до тех пор, пока объемное смещение не переместит мениск с отметки 20 мл на отметку 35 мл на конической пробирке. Повторите описанный выше шаг для оставшихся кусочков образца ткани тонкой кишки. Запечатайте конические трубки парапленкой и вручную встряхните коническую трубку 10 раз.ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего протокола ручное встряхивание должно выполняться обдуманно, но осторожно. Поместите конические трубки горизонтально на лед в контейнере на орбитальной встряхивающей платформе. Встряхните конические трубки на льду в контейнере в течение 30 минут со скоростью 80 оборотов в минуту (об/мин). Каждые 10 минут вручную встряхивайте коническую трубку. Приготовьте 20 мл предварительно нагретого (37 °C) тканевого реагента для диссоциации #2 (формула, как указано выше, но без DTT) в конической пробирке объемом 50 мл. Поместите образцы тканей из конических пробирок, содержащих диссоциационный реагент #1, в конические пробирки, содержащие диссоциационный реагент #2. Запечатайте конические трубки парапленкой и вручную встряхните конические трубки 10 раз. Поместите конические пробирки на предварительно разогретую (37 °C) водяную баню для встряхивания, наклоненную под углом примерно 60 °C, и встряхивайте при 150 об/мин в течение 10 минут, с ручным встряхиванием через 5 минут и снова после общей 10-минутной инкубации. Изоляция фрагментов криптыНаклейте этикетку на 10 стерильных конических пробирок #1 – #10. Добавьте 20 мл стерильного ледяного PBS в каждую коническую пробирку с маркировкой. Переложите кусочки ткани из конических пробирок, содержащих реагент для диссоциации #2, в новую стерильную коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую ледяной PBS #1. Вручную встряхните конические трубки 10 раз. Заклейте конические трубки парапленкой и положите их горизонтально на лед. Встряхивайте конические трубки на орбитальном шейкере в течение 10 мин при 80 об/мин. Через 10 минут вручную встряхните коническую трубку #1 10 раз. Это считается стиркой #1. Аккуратно перенесите образцы тканей с помощью хирургических щипцов в коническую трубку #2. Повторите шаги 2.3.2 – 2.3.4, это считается Wash #2. Повторяйте стирки до стирки #10. Надосадочная жидкость из каждой промывки содержит крипты, которые будут использоваться для генерации энтероидов. Держите пробирки с надосадочной жидкостью при температуре 4 °C до тех пор, пока не будут завершены все 10 стирок. После того, как10-я промывка будет завершена и срез ткани будет отброшен, центрифугируют надосадочную жидкость конических пробирок #6-#10 при 400 x g в течение 2 мин при 4 °C, чтобы гранулировать изолированные крипты.ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки 6-10 содержат самые чистые фракции неповрежденных склепов с ограниченным количеством мусора и одиночных ячеек. Таким образом, рекомендуется использовать только эти фракции для генерации энтероидов, а более ранние промывки (#2-#5) отбрасывать) Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 4 мл свежего, ледяного ПБС в крипты, не подвергая их ресуспендированию (это помогает сохранить фрагменты нетронутыми до микроскопии). Оценивают чистоту диссоциированных крипт для каждой конической пробирки #6-#10 с помощью микроскопии.Добавьте 50 мкл PBS в 384-луночный планшет. Добавьте 10 мкл суспензии крипт в PBS и используйте объектив с 40-кратным увеличением, чтобы определить чистоту, целостность и количество крипт.ПРИМЕЧАНИЕ: Рисование креста на нижней части пластины облегчает подсчет. 3. Генерация ex vivo и пассаж бычьих подвздошных энтероидов (рис. 2) ПРИМЕЧАНИЕ: Крипты из конических пробирок с наиболее чистыми, неповрежденными кишечными криптами будут использоваться для последующих анализов. Для всех этапов, связанных с криптами и энтероидами, наконечники пипеток, скребки для клеток и пробирки должны быть предварительно покрыты буфером для покрытия, и следует избегать пузырьков, чтобы предотвратить потерю крипт. Если не указано иное, следует использовать наконечник для пипетки объемом 1000 мкл, чтобы предотвратить разрушение фрагментов крипты. Генерация энтероидов из фрагментов криптыСмешайте самые чистые фракции крипты (обычно #6-#10) в одну коническую трубку. Центрифугируют коническую пробирку, содержащую крипты, при 400 x g в течение 2 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, аспирировав ее пипеткой, и повторно суспендируйте гранулу крипты в промывочной среде. Центрифуга, как показано на шаге 3.1.2. Сцедите надосадочную жидкость и добавьте 2 мл промывочного средства к грануле крипты. Подсчитайте количество крипт, как описано в шаге 2.3.11.1. Центрифугу, как показано на шаге 3.1.2, гранулируют крипты, отбрасывают надосадочную жидкость и повторно суспендируют во внеклеточном матриксе (BME) базальной мембраны (BME) с 100% сниженным фактором роста, чтобы достичь концентрации примерно 400 крипт/100 мкл.ПРИМЕЧАНИЕ: важно правильно размораживать BME при 4 °C, так как изменения температуры изменяют его консистенцию. Преждевременное затвердевание BME можно предотвратить с помощью охлаждающего блока и предварительно охлажденных наконечников пипеток.Использование другой рецептуры матрицы базальной мембраны может потребовать разбавления BME при создании куполов. Обратитесь к инструкциям производителя, относящимся к используемому BME. Пипетируйте вверх и вниз, чтобы полностью подвесить крипты в BME. Изготовьте купола crypt-BME, медленно пипетируя 50 мкл суспензии crypt-BME на 6-луночный планшет для культуры тканей на нагревательной пластине, установленной на 37 °C, до 8 куполов на лунку.ПРИМЕЧАНИЕ: 6-луночная пластина должна быть предварительно прогрета в инкубаторе при 37 °C в течение ночи перед обшивкой куполов. Держите планшет с 6 лунками на нагревательной пластине в течение 1 минуты, прежде чем осторожно переместить планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5%CO2 . Через 2 минуты переверните 6-луночную пластину так, чтобы крышка была обращена вниз, и инкубируйте еще 30 минут, чтобы купола полимеризовались. Через 30 мин осторожно добавьте 3 мл энтероидной питательной среды комнатной температуры (RT) с добавлением 10 мкМ SB202190, 0,5 мкМ LY2157299 и 10 мкМ Y-27632 в лунки, содержащие купола. Инкубируют при 37 °C, 5%СО2. Каждые 2-3 дня удаляйте среду и заменяйте ее свежей средой для роста энтероидов с добавлением ингибиторов. Пассаж энтероидовЧерез 7-10 дней убедитесь, что крипты сформировали 3D-энтероиды с множеством почковавшихся структур, как показано на рисунке 2E, и готовы к выходу. Выбросьте фильтрующий материал из колодцев, содержащих купола. На каждые 4 купола в лунке добавьте 1 мл ледяного раствора для неферментативной диссоциации клеток с добавлением 10 мкМ Y-27632 в каждую лунку, содержащую купола. С помощью скребка для клеток с предварительно нанесенным покрытием аккуратно отделите купол от планшета для культуры тканей. Соберите энтероиды в коническую пробирку объемом 15 мл и растирайте пипетками вверх и вниз 10 раз. Коническую пробирку, содержащую фрагментированные энтероиды, инкубируют при РТ на орбитальном шейкере при 80 об/мин в течение 10 мин. Добавьте к энтероидам 10 мл ледяной промывочной среды с 10 мкМ Y-27632. Центрифугируйте коническую пробирку при 300 x g в течение 5 мин при RT. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 10 мл свежей промывочной среды и перелейте в новую коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте коническую пробирку при 300 x g в течение 5 мин при RT. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл энтероидной питательной среды в пробирке микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Центрифугу микроцентрифужной пробирки при 300 x g в течение 5 мин при RT и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте энтероидную гранулу в ледяной 100% BME и выполните шаги 3.1.6-3.1.13. Репассаж энтероидов каждые 7 дней. Время расширения может варьироваться в зависимости от плотности, жизнеспособности и степени бутонизации. Множественные зарождающиеся структуры, создающие большие энтероидные структуры, указывают на то, что энтероиды нуждаются в прохождении. Криоконсервация энтероидовДля криоконсервации убедитесь, что энтероиды пассируют в культуре не более пяти раз.ПРИМЕЧАНИЕ: Это не было проверено экспериментально и основано на наблюдении авторов о том, что более поздние пассажи снижают жизнеспособность и дают переменные результаты. Для сбора энтероидов используйте буфер диссоциации, как описано в шагах 3.2.2-3.2.9.ПРИМЕЧАНИЕ: Механически диссоциируют энтероиды с помощью пипетки объемом 5 мл. Подсчитайте количество энтероидных фрагментов, как описано в шаге 2.3.11.1. Центрифугируйте коническую пробирку при 300 x g в течение 5 мин при RT. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте энтероидные фрагменты в криоконсервационной среде с добавлением 10 мкМ Y-27632 для достижения концентрации ~2000 энтероидных фрагментов/мл и аликвоты 1 мл в предварительно меченных криовиалах. Поместите криовиалы в контейнер с контролируемой заморозкой и храните при температуре -80 °C в течение ночи. Переведите криовиалы в жидкий азот в паровой фазе для длительного хранения. Реанимация фрагментов кишечных криптПоместите 6-луночную тарелку на ночь внутрь инкубатора. Предварительно покройте пробирку объемом 5 мл 5 мл средства для покрытия. Извлеките криовиалы из хранилища жидкого азота. Сразу после размораживания перенесите крипты из криовиальной пробирки в предварительно покрытую пробирку объемом 5 мл. Промойте криовиал промывочным средством и добавьте в пробирку объемом 5 мл. Избегайте пузырей. Доведите объем до 5 мл с помощью промывочной среды и центрифуги при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Во время центрифугирования предварительно покрыте пробирку объемом 1,5 мл средой для покрытия. После центрифугирования слейте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в среде, оставшейся в пробирке, и переложите в предварительно покрытую пробирку объемом 1,5 мл. Промойте пробирку объемом 5 мл средством для промывки и перелейте ее в пробирку объемом 1,5 мл. Центрифуга при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Доведите объем до 1,5 мл с помощью питательной среды для энтероидов. Центрифугу, как описано выше (шаг 3.4.7), и осторожно аспирируйте. Возьмите BME от 4 °C и положите на лед/ледяную глыбу. Ресуспендируйте энтероидную гранулу в ледяном 100% BME и выполните шаги 3.1.6-3.1.12. Меняйте носитель каждые 2-3 дня. 4. Генерация и оценка 2D монослоев из 3D энтероидов ПРИМЕЧАНИЕ: Как и выше, на всех этапах, связанных с криптами и энтероидами, наконечники пипеток, скребки для клеток и пробирки должны быть предварительно покрыты буфером для покрытия, и следует избегать пузырьков, чтобы предотвратить потерю крипт. Подготовка трансвеллерных вставок для формирования 2D монослояПоместите вкладыши в 24-луночный адаптер для тканевой культуры и предварительно покройте апикальную сторону 24-луночных вставок для клеточных культур ПЭТ размером 1 мкм 100 мкл разведения 1:15 BME в энтероидной питательной среде. Всегда наносите дополнительную вставку, которая будет использоваться в качестве контрольной при измерении целостности барьера. Поместите вкладыш с покрытием в 24-луночный планшет-адаптер для тканевой культуры в инкубаторе.ПРИМЕЧАНИЕ: С трансвелл-вставками необходимо использовать специальный адаптер или планшет-компаньон для культуры тканей. Инкубируйте культуральные вставки при 37 °C, 5% CO2 в течение 1 ч для полимеризации.ПРИМЕЧАНИЕ: Прозрачники с покрытием BME можно загерметизировать парапленкой и хранить при температуре 4 °C до 1 недели, если они не используются немедленно. По окончании инкубации аспирируют 3D энтероидную питательную среду. Диссоциация 3D энтероидовГенерация 2D-энтероидных монослоев из криоконсервированных энтероидных фрагментов, которые были реанимированы, покрыты и культивированы, как описано выше в разделе 3.1, для формирования 3D-энтероидов. Оттопленные энтероиды проводят не менее двух раз, при этом последний пассаж культивируют не менее 5 дней перед обработкой для получения 2D-монослойных культур. Соберите энтероиды, добавив ледяную промывочную среду с добавлением 10 мкМ Y-27632 в купола энтероидов (используйте примерно 1 мл диссоциационного буфера для 4 куполов) Отсоедините купола скребком для ячеек и соберите их в коническую пробирку объемом 15 мл. Тритурируйте 30 раз с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл для получения энтероидных фрагментов. Тритурируйте 40 раз наконечником пипетки на 200 мкл для дальнейшего разрушения фрагментов энтероидов. Доведите объем конической пробирки объемом 15 мл с фрагментами энтероидов до 10 мл с помощью ледяной промывочной среды. Центрифугируйте коническую пробирку при 300 x g в течение 5 мин при RT. Аспирируйте надосадочную жидкость, включая слой BME, стараясь не повредить энтероидную гранулу.ПРИМЕЧАНИЕ: Слой BME будет выглядеть как мутный желатиновый слой прямо над гранулой. На каждые 4 купола повторно суспендируйте гранулу в 1 мл предварительно подогретого экспресс-фермента TrypLE с добавлением 10 мкМ Y-27632. Добавьте смесь энтероида и трипЛЭ в 24-луночный планшет и инкубируйте при 37 °C, 5% CO2 в течение 10 мин. Через 10 мин процедите смесь энтероидов и трипЛЭ 40 раз с помощью пипетки объемом 1 мл для дальнейшего фрагментирования энтероидов. Затем пипетку 40 раз профилируют пипеткой на 200 мкл, чтобы разбить фрагменты на отдельные клетки. Используя шприц объемом 3 мл или 5 мл с прикрепленной стерильной иглой 22-G, аспирируйте и дозируйте клеточную суспензию 4 раза, чтобы получить одноклеточную суспензию. Контролируйте диссоциацию клеток с помощью микроскопии, как описано в шаге 2.3.11.1, до тех пор, пока 80% энтероидов не будут расщеплены на отдельные клетки. Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и погасите ферментативную реакцию, добавив 4-кратный объем промывочной среды с добавлением 10% FBS. Дважды отфильтруйте энтероиды через предварительно покрытое ситечко с 40 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл. Гранулируйте отдельные ячейки, центрифугируя коническую пробирку при 300 x g в течение 5 минут. 2D однослойный посев на трансвеллерных вставках.Декантируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в небольшом объеме (~600 мкл) органоидной питательной среды, дополненной 20% фетальной бычьей сывороткой (FBS) при ОТ. Определите плотность и жизнеспособность энтероидных клеток с помощью метода исключения красителя Trypan Blue, гемацитометра или автоматического счетчика клеток. Средняя жизнеспособность ожидается на уровне 75%. Осторожно удалите излишки раствора покрытия, нанесенного на шаге 1.3, с вкладыша для клеточных культур непосредственно перед посевом клеток. Высевают одиночные клетки по 1 x 105 клеток в объеме 200 мкл на вставку на апикальную поверхность предварительно покрытой клеточной культуры. Добавьте 700 мкл полной среды с добавлением 20% FBS на базолатеральную сторону вставки для клеточной культуры. Переместите пластину 10 раз в форме цифры 8, чтобы ячейки равномерно распределились по вставке. Держите тарелку на тарелке в теплом месте в течение 10 минут в шкафу биобезопасности. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C и 5% CO2. Через 48 ч замените питательную среду на апикальном и базальном компартментах свежей питательной средой для энтероидов с добавлением 20% FBS и ингибиторов. На третий день удалите среду из апикального и базолатерального отделов, тщательно промойте вкладыш 1x PBS и замените его средой для дифференцировки энтероидов, дополненной только ингибиторами. Меняйте носители в обоих отсеках каждые 2-3 дня. Количественное измерение целостности эпителиального барьера и слияния монослоевПРИМЕЧАНИЕ: Целостность барьера может быть оценена с помощью эпителиального вольтомметра для измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER).Извлеките планшет для культуры из инкубатора и дайте ей уравновеситься при RT в течение нескольких минут в шкафу биобезопасности. Убедитесь, что электроды STX2 были предварительно подготовлены, а вольтомметр откалиброван до 1000 Ом в соответствии с инструкциями производителя. Введите длинную палочку зонда в базолатеральный отдел, а короткий конец в апикальный отсек культуры эпителиальных клеток трансвелла. Следите за тем, чтобы не нарушить монослой и не повредить пластину. После стабилизации запишите 3 измерения TEER на каждую вставку Transwell, включая вставку без ячеек. Сделайте среднее значение измерений для каждой пластины. Рассчитайте скорректированное значение TEER, вычитая среднее измерение пустой лунки из средних измерений экспериментальных лунок и затем умножая его на площадь поверхности вставки для определения сопротивления эпителиального барьера (TEER [Ω.см2] = [Rcell layer – Rblank] × Area).