İnflamatuar Bağırsak Hastalığı Hastalarından Türetilen Bağırsak Organoidleri Kullanılarak Çip Üzerinde Köpek Bağırsağında Üç Boyutlu Morfogenez

Çalışma, Washington Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi’ne (ASAF# 6993) uygun olarak onaylanmış ve yürütülmüştür. Bu protokolde, şirket içinde üretilen PDMS’den yapılmış köklü bir Çip Üzerinde Bağırsakmikroakışkan cihazı kullandık 2 (Şekil 1D). Gut-on-a-Chip mikro cihazının üretiminin ayrıntılı yöntemleri önceki raporlardabulunabilir 2,24. Bu protokol, bağırsak organoidlerinin ve bir mikroakışkan sistemin benzersiz bir entegrasyonunu gösterir (Şekil 2). 1. PDMS’den yapılmış bir Çip Üzerinde Gut-on-Chip’in yüzey aktivasyonu 50 mL’lik konik bir tüpte 49 mL damıtılmış (DI) suya 1 mL PEI çözeltisi ekleyerek %1 polietilenimin (PEI) çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi iyice karıştırmak için tüpü iki ila üç kez ters çevirin, ardından çözeltiyi 0.2 μm’lik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin.NOT: 4 °C’de saklayın. 50 mL’lik konik bir tüpte 49,9 mL DI içine 100 μL GA çözeltisi ekleyerek %0,1 glutaraldehit (GA) çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi iyice karıştırmak için tüpü iki ila üç kez ters çevirin, ardından çözeltiyi 0.2 μm’lik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin.NOT: 4 °C’de saklayın ve doğrudan ışığa maruz kalmaktan koruduğunuzdan emin olun. Gut-on-a-Chip cihazını 60 °C’ye ayarlanmış kuru bir fırına yerleştirin ve kalan nemi gidermek için en az 30 dakika inkübe edin. Gut-on-a-Chip cihazını bir UV/Ozon jeneratörü kullanarak 60 dakika boyunca UV ve Ozon tedavisine maruz bırakın.NOT: İşlem sırasında PDMS yüzeylerinin optimum aktivasyonunu sağlamak için UV lambası ile cihaz arasında yaklaşık 3 cm veya daha az bir mesafe bırakın. Verimli yüzey aktivasyonu gerçekleştirmek için jeneratördeki cihazların aşırı kalabalıklaşmasını önleyin. Üst mikro kanalın giriş, baypas ve çıkış borularını cl kullanarak sabitleyin.amp bunlar. Ayrıca alt mikro kanal için giriş borusunu da sıkıştırın. Alt mikro kanal için çıkış borusunu ayırın. Alt mikro kanalın baypas borusunun açık kaldığından emin olun. Bir P100 mikropipet kullanarak, alt mikrokanalın çıkış deliğinden 100 μL% 1 PEI çözeltisi verin.NOT: Bu işlemin, cihaz UV/Ozon maruziyetinden dolayı hala sıcakken yapılması önerilir. Mikrokanaldan akan PEI çözeltisini ve PEI çözeltisinin alt mikro kanal için baypas borusundan dışarı çıktığını gözlemleyin. Alt mikro kanal için çıkış borusunu yeniden bağlayın. Alt mikro kanalın giriş, baypas ve çıkış borularını cl kullanarak sabitleyin.amp bunlar. Ayrıca üst mikro kanal için giriş borusunu da sıkıştırın. Üst mikro kanalın çıkış borusunu ayırın. Üst mikro kanalın baypas borusunun açık kaldığından emin olun. Bir P100 mikropipet kullanarak, üst mikrokanalın çıkış deliğinden 100 μL% 1 PEI çözeltisi verin.NOT: Mikrokanaldan akan PEI solüsyonunu ve PEI solüsyonunun üst mikrokanal için baypas borusundan dışarı çıktığını gözlemleyin. Üst mikro kanalın çıkış borusunu yeniden takın. Hem üst hem de alt mikrokanallar %1 PEI çözeltisi ile doldurulduktan sonra, cihazın oda sıcaklığında (RT) 10 dakika inkübe etmesine izin verin. %0,1 GA çözeltisi ile 1.5-1.12 adımlarını gerçekleştirin. Hem üst hem de alt mikrokanallar %0.1 GA çözeltisi ile doldurulduktan sonra, cihazın RT’de 20 dakika inkübe etmesine izin verin. Fazla yüzey aktivasyon solüsyonunu çıkarmak için 1.5-1.12 adımlarını DI suyuyla gerçekleştirin. Çipi 60 °C’de kuru bir fırına koyun ve gece boyunca kurumasını bekleyin.NOT: Borunun herhangi bir şekilde çarpmasını önlemek için bağlayıcı klipsleri tüm borulardan çıkardığınızdan emin olun. Bu kurutma işlemi, Gut-on-a-Chip12 içindeki mikrokanalın eşit yüzey aktivasyonu için kritik öneme sahiptir. 2. Gut-on-a-Chip kültürü için hücre dışı matris (ECM) kaplama ve kültür ortamı hazırlama Kollajen I ve Matrigel’in nihai konsantrasyonu sırasıyla 60 μg/mL ve %2 (hacim/hacim) olacak şekilde organoid bazal besiyeri ile bir ECM karışımı hazırlayın.NOT: Bağırsak çipi başına 50 μL ECM karışımı hazırlayın (yani, her üst ve alt mikrokanal için 20 μL ECM karışımı ve 10 μL ekstra). Bunu kullanım gününde hazırlayın ve bu solüsyonu 4 °C’de saklayın veya kullanıma hazır olana kadar buzun üzerine koyun. UV/Ozon, PEI ve GA ile işlenmiş Gut-on-a-Chip’i kuru fırından çıkarın.NOT: Nem kalıntısı olup olmadığını görmek için faz kontrast mikroskobu altında inceleyin. Gut-on-a-Chip’in bir biyogüvenlik kabininde 10 dakika soğumasını bekleyin. Üst mikro kanalın giriş, baypas ve çıkış borularını cl kullanarak sabitleyin.amp bunlar. Ayrıca alt mikro kanal için giriş borusunu da sıkıştırın. Alt mikro kanal için çıkış borusunu ayırın. Bir P100 mikropipet kullanarak, alt mikrokanalın çıkış deliğinden 20 μL ECM karışımı verin.NOT: Herhangi bir hava kabarcığı sıkışması olmadan mikrokanaldan akan ECM karışımını gözlemleyin. Herhangi bir hava kabarcığı varsa, kabarcık gidene kadar alt mikro kanala ek ECM karışımı ekleyin. Alt mikro kanal için çıkış borusunu yeniden takın. Alt mikro kanalın giriş, baypas ve çıkış borularını cl kullanarak sabitleyin.amp bunlar. Ayrıca üst mikro kanal için giriş borusunu da sıkıştırın. Üst mikro kanalın çıkış borusunu ayırın. Bir P100 mikropipet kullanarak, üst mikrokanalın çıkış deliğinden 20 μL ECM karışımı verin. Üst mikro kanalın çıkış borusunu yeniden takın. Çipi, PEI ve GA ile muamele edilmiş PDMS membranı üzerinde ECM katmanını oluşturmak için 1 saat boyunca 37 °C’de %5 CO 2 içeren nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöre yerleştirin (Şekil 3A).NOT: Tüm boruların cl olduğundan emin olun.amp inkübasyon sırasında. ECM kaplamasının inkübasyonu sırasında, daha önce insan organoidlerinden türetilen Gut-on-a-Chip 2’de bildirildiği gibi, A8301’den yoksun ancak 10 μM Y-27632 ve2.5 μM CHIR99021 içeren organoid kültür ortamı olan soğuk tohumlama ortamı içeren iki adet 1 mL şırınga hazırlayın.NOT: A8301, daha önce bildirildiği gibi hücrelerin kaplanmış ECM’ye bağlanmasını geliştirmek için ortamdan çıkarılmıştır2. Gut-on-a-Chip kültürünün 0. günü yalnızca üst mikrokanal akışı gerektirir. Bu nedenle, üst kanal için tam bir şırınga hazırlayın, alt kanal için minimum 0,2 mL hazırlayın. ECM kaplaması tamamlandıktan sonra, Çipi inkübatörden çıkarın ve cl’yi serbest bırakınamp alt mikro kanala bağlı baypas borusuna. Tohumlama ortamıyla dolu 1 mL’lik bir şırıngayı, Gut-on-a-Chip’in alt mikro kanalına bağlı olan künt uçlu iğneye bağlayın. Tohumlama ortamını (~50 μL) baypas borusuna dikkatlice yerleştirin. Boru sokulan ortamla doldurulduktan sonra, alt mikro kanala bağlı baypas borusunu bir bağlayıcı klipsle sabitleyin. cl’yi serbest bırakınamp alt mikro kanala bağlı çıkış borusunun. Tohumlama ortamını dikkatlice alt mikro kanala sokun ve sistemden sorunsuz bir şekilde akmasını sağlayın. Perfüzyondan sonra alt mikro kanala bağlı çıkış borusunu bir bağlayıcı klipsle sabitleyin. Ardından, üst mikro kanala bağlı baypas borusunu açın. Tohumlama ortamıyla dolu 1 mL’lik bir şırıngayı, Gut-on-a-Chip’in üst mikro kanalına bağlı olan künt uçlu iğneye bağlayın. Tohumlama ortamını (~50 μL) baypas borusuna dikkatlice yerleştirin. Boru sokulan ortamla doldurulduktan sonra, üst mikro kanala bağlı baypas borusunu bir bağlayıcı klipsle sabitleyin. Alt mikro kanala bağlı çıkış borusunu serbest bırakın. Tohumlama ortamını dikkatlice üst mikro kanala sokun ve sistemden düzgün bir şekilde akmasını sağlayın. Perfüzyondan sonra üst mikrokanala bağlı çıkış borusunu bir bağlayıcı klipsle sabitleyin. 3. Tohumlama için köpek bağırsak organoid hücre hazırlığı NOT: Çip üzerinde Bağırsak modelini oluşturmak için, bu protokolde IBD hasta köpeklerinden türetilen köpek kolon organoidleri (kolonoidler olarak adlandırılır) kullanılmıştır. Bu kolonoidler, daha önce bildirilen bir yöntem15,18 izlenerek, biyopsi yapılan kolon dokusunun üç ila beş küçük parçasından türetilmiştir. En iyi sonuçlar için, in vitro uygulamalara uygun stabil organoidler oluşturmak için en az üç kültür geçişinden geçmiş köpek kolonoidlerinin kullanılması çok önemlidir. Organoidler içindeki çok soylu hücrelerin yeterli farklılaşmasını kolaylaştırmak, fonksiyonel olgunluklarını ve Gut-on-a-Chip modelinde sonraki deneyler için uygunluklarını sağlamak için köpek kolonoidlerinin en az 3-4 günlük bir süre boyunca kültürlenmesi önerilir. Bu çalışma için pasajın maksimum sınırı, 20 ardışık pasaj25 boyunca değiştirilmemiş fenotip ve karyotipi gösteren önceki bir çalışmada belirtildiği gibi, 20’den azdır. Bu donörlerin sinyalleri Ek Tablo S1’de sunulmuştur. Köpek kolonoidlerini, 30 μL Matrigel 15,18 içine gömülü 24 oyuklu plakalarda, daha önce bildirilen ortam 15,26,27’den modifiye edilmiş Malzeme Tablosunda listelenen organoid kültür ortamı ile kültürleyin. Şartlandırılmış besiyeri, Noggin 28’i salgılamak üzere tasarlanmış Rspo1 hücreleri veHEK293 hücrelerinin yetiştirilmesiyle elde edildi. Organoid kültür ortamını vakum emme yoluyla atın ve her bir oyuğa buz gibi soğuk bir sıcaklıkta 500 μL Hücre Geri Kazanım Çözeltisi ekleyin. 4 °C’de 30 dakika inkübe edin.NOT: Tipik olarak, 24 kuyulu bir olgun köpek bağırsak organoidi plakasından üç oyuk, x10 büyütmede 40-50 organoid / bir görüş alanına sahip tek bir Çip Üzerinde Bağırsak cihazını tohumlamak için yeterli miktarda ayrışmış hücre sağlar. Bir P1000 mikropipet kullanarak Matrigel kubbelerini 5 saniye boyunca mekanik olarak bozun. Daha sonra, organoid süspansiyonu 15 mL’lik konik bir tüpte toplayın. Konik tüpü 200 × g ve 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatantın çıkarılması. Oda sıcaklığında 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş 1 mL tripsin benzeri proteaz ekleyin ve bir P1000 mikropipet kullanarak pipetleyerek hücre peletini yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 37 °C’ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin ve karışımı periyodik olarak çalkalarken 10 dakika inkübe edin. 5 mL ılık organoid bazal ortam ekleyin ve herhangi bir görünür hücre kümesi olmadan bulanıklaşana kadar bir P1000 mikropipet kullanarak hücre süspansiyonunu kuvvetlice pipetleyin. Matrigel kalıntılarını ve büyük hücre kümelerini ortadan kaldırmak için hücre süspansiyonunu 70 μm’lik bir kesikli bir hücre süzgecinden geçirin. Konik boruyu 200 × g ve 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin, ardından peletin tohumlama ortamında yeniden süspansiyonunu uygulayın. Bir köpek Çip Üzerinde Bağırsak cihazının tohumlanması için, hücre peletini yeniden süspanse etmek için 20 μL tohumlama ortamı kullanın (yani, bir Çip Üzerinde Bağırsak cihazını tohumlarken 20 μL tohumlama ortamı kullanın). Canlı hücrelerin konsantrasyonunu, daha önce bildirildiği gibi tohumlama ortamı ile 1 × 107 hücre / mL’ye değiştirin2. 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL Tripan mavisi ile birleştirerek bir hemositometre kullanarak canlılık değerlendirmesi yapın ve ardından hücreleri mikroskop altında gözlemleyin.NOT: Optimum hücre bağlanmasını ve çip zarı üzerinde tek tip bir tek tabaka oluşumunu sağlamak için hücre konsantrasyonunu uygun şekilde ayarlamak çok önemlidir. İlk hücre sayısı yetersizse, birleşik bir tek tabakanın gecikmeli veya başarısız bir şekilde kurulmasına neden olabilir. Tersine, hücre sayısı fazlaysa, yapışık olmayan hücreler kanal içinde kümeler halinde toplanabilir ve bu da istenmeyen konsantrasyon etkilerine yol açabilir. 4. 2D hücre tek tabakasının tohumlanması ve oluşumu Üst mikro kanalın çıkış borusunu ayırın. Üst mikro kanalın baypas borusunun açık kaldığından emin olun. Alt mikro kanalın hem girişini hem de çıkışını, cl için bağlayıcı klipsler kullanarak sabitleyin.amp bunlar. Bir P100 veya P20 mikropipet kullanarak, Protokol 3’ten 20 μL hücre süspansiyonunu üst mikrokanalın çıkış deliğine sokun (Şekil 3B Tohumlama). Üst mikro kanalın baypas ve giriş borusunu cl kullanarak sabitleyin.amp için. Ardından, çıkış borusunu üst mikro kanalın çıkış deliğine yeniden takın ve üst mikro kanala herhangi bir basınç uygulanmasını önlemek için borunun işlem boyunca açık kalmasını sağlayın. Bu adımdan sonra, üst kanalın çıkış borusunu kelepçelemek için bir bağlayıcı klips kullanarak yavaşça sabitleyin. Hücrelerin üst mikrokanal boyunca eşit olarak dağıldığını bir mikroskop kullanarak doğrulayın.NOT: İstenen hücre bağlantısı tamamlanana kadar kararlı statik koşullara izin vermek için ortamın kanal içindeki hareketini durdurmak için boruyu kelepçelemek önemlidir. Çipi 37 °C’de nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöre yerleştirin.NOT: Köpek bağırsak organoid hücrelerinin ECM kaplamasına yapışması yaklaşık 3 saat sürer (Şekil 3B Eki). Gut-on-a-Chip’in üst mikro kanalına bağlı şırıngayı bir CO2 inkübatörü içine yerleştirilmiş bir şırınga pompasına bağlayın.NOT: Şırınga pompasının düğmesini kullanarak ortamı dikkatlice mikrokanala yıkayın ve bağlanmamış hücreleri çıkarın. Bağlanmamış hücrelerin etkili bir şekilde yıkandığından emin olmak için çipi mikroskop altında inceleyin. Tohumlama ortamı ile 30 μL / s’de kültür ortamının akışını başlatın. Bu sürekli akış, başlangıçta bir Gut-on-a-Chip üzerinde 2D tek katmanlı kuruluma kadar yalnızca üst mikro kanal içindir. Alt mikro kanal için, mikro kanalları kenetlenmiş ve ortamı yıkamadan bırakın. Hücrelerin tohumlanmasından sonraki günden itibaren, kültür ortamını, tohumlama ortamından A8301 içeren ve 10 μM Y-27632 ve 2.5 μM CHIR99021 içermeyen organoid kültür ortamına değiştirin. Tek katman oluşturulduktan sonra, alt mikro kanala da sürekli ortam akışını başlatın. Köpek bağırsak organoid epitel hücrelerinin epitelyal tek tabakalar oluşturması genellikle 2 ila 3 gün sürer (Şekil 3C). 5. Köpek Gut-on-a-Chip’te 3D morfogenezin kurulması NOT: Gut-on-a-Chip’te birleşik tek tabakalar oluşturulduktan sonra, Şekil 2’de gösterildiği gibi 3D morfogenezi 2D tek tabakaya başlatmak için hem üst kanalın hem de alt kanalın ve hücre suşunun orta akışı sokuldu. Bir Gut-on-a-Chip sisteminde 3D morfogenezin gelişimini başlatmak için organoid kültür ortamını hem üst hem de alt mikrokanallara sokun. Mevcut Gut-on-a-Chip tasarımında (yani 500 μm yüksekliğindeki mikrokanal) 0,02 dyne/cm2’lik kesme gerilimi elde etmek için akış hızını 50 μL/sa29’a yükseltin. İn vitro kültürlenmiş hücrelere döngüsel suş uygulayan bilgisayar tarafından düzenlenen bir biyoreaktör kullanarak, 10’den önce önerildiği gibi hücre suşunun %0.15’unu ve 2 Hz frekansı başlatın. Bu işlem, Gut-on-a-Chip cihazına vakum emişi uygulayacaktır. Bu kültür koşullarını en az 2 ila 3 gün sürdürün. Köpek bağırsak tek tabakasının 3D morfogenezi genellikle Dural kanal akışı ve vakum emişi başlatıldıktan 2 ila 3 gün sonra ortaya çıkar (Şekil 3C). 6. Köpek Gut-on-a-Chip’in karakterizasyonu Canlı hücre görüntülemeŞırınga pompasını kullanarak ortamı hafifçe akıtarak Gut-on-a-Chip’teki hava kabarcıklarını giderin. Gut-on-a-Chip cihazını şırınga pompasından ayırın.NOT: Çip Üzerinde Bağırsak içinde basınç uygulayabilecek herhangi bir manevradan kaçının. Yerleşik 3D epitelin görüntülerini yakalamak için cihazı bir mikroskop üzerine yerleştirin. Faz kontrastı kullanarak 3B epitel katmanlarının yapısını görselleştirmek için 10x ve 20x objektifler kullanın (Şekil 3C). İmmünofloresan boyama% 2 BSA yapmak için 1 g BSA’yı 50 mL Fosfat tampon salin (PBS) içinde çözerek bloke edici çözeltiyi hazırlayın. Çözeltiyi filtrasyon için 0,2 μm’lik bir şırınga filtresinden geçirin. Bu çözeltiyi 4 °C’de saklayın. 150 μL Triton X-100’ü 50 mL bloke edici çözelti ile birleştirerek geçirgenleştirici çözeltiyi hazırlayın, bu da %0.3’lük bir nihai konsantrasyon elde edilmesini sağlar. Çözeltiyi filtrasyon için 0,2 μm’lik bir şırınga filtresinden geçirin. Bu çözeltiyi 4 °C’de saklayın. Adım 2.4-2.11’de açıklandığı gibi hem üst hem de alt mikro kanallara 100 μL% 4 PFA enjekte ederek hücrelerin fiksasyonunu gerçekleştirin. Adım 2.4-2.11’de açıklandığı gibi hem üst hem de alt mikro kanallara 100 μL PBS enjekte ederek hücreleri durulayın. Adım 2.4-2.11’de açıklandığı gibi hem üst hem de alt mikrokanallara 100 μL% 0.3 Triton enjekte ederek hücrelerin geçirgenliğini gerçekleştirin. Cihazı 30 dakika boyunca RT’ye yerleştirin. Adım 2.4-2.11’de açıklandığı gibi hem üst hem de alt mikro kanallara 100 μL PBS enjekte ederek hücreleri durulayın. Adım 2.4-2.11’de açıklandığı gibi hem üst hem de alt mikro kanallara 100 μL% 2 BSA enjekte ederek spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için hücrelerin bloke edilmesini sağlayın. Cihazı 1 saat boyunca RT’ye yerleştirin. % 2 BSA içinde seyreltilmiş 20 μL primer antikor çözeltisi enjekte edin ve 3 saat boyunca RT’ye yerleştirin, ardından 4 ° C’de gece boyunca inkübasyon yapın.NOT: Tüm boruların cl olduğundan emin olun.ampgece boyunca 4 ° C’de inkübasyon sırasında. Bir primer antikorun konsantrasyonu, tek tabakalı veya 3D organoid boyama için önerilen konsantrasyondan 2-5 kat daha yüksek olmalıdır (Ek Şekil S1). Adım 2.4-2.11’de açıklandığı gibi hem üst hem de alt mikrokanallara 100 μL PBS enjekte ederek hücreleri durulayın. % 2 BSA içinde seyreltilmiş 20 μL ikincil antikor çözeltisi enjekte edin ve 1 saat boyunca RT’ye yerleştirin.NOT: Tüm boruların cl olduğundan emin olun.amp inkübasyon sırasında. Bu adımdan başlayarak, foto ağartmayı önlemek için cihaz kurulumunu alüminyum folyo ile korumak gerekir. Adım 2.4-2.11’de açıklandığı gibi hem üst hem de alt mikrokanallara 100 μL PBS enjekte ederek hücreleri durulayın. F-aktin ve DAPI (diamidino-2-fenilindol) karşı boyama için kombine bir çözelti hazırlayın. 20-2.4-2.11 adımlarında açıklandığı gibi hem üst hem de alt mikro kanallara 20 μL kombine çözelti enjekte edin. Adım 2.4-2.11’de açıklandığı gibi hem üst hem de alt mikro kanallara 100 μL PBS enjekte ederek hücreleri durulayın.Bir floresan mikroskobu veya konfokal mikroskop kullanarak 3D epitel hücrelerinin mimarisinin floresan görüntülemesini gerçekleştirin. 7. Epitelyal bariyer fonksiyonu Şırınga pompasını kullanarak ortamı hafifçe akıtarak Gut-on-a-Chip’teki hava kabarcıklarını giderin. Ölçüm sırasında tüm boruların açık olduğundan emin olun. Gut-on-a-Chip’i şırınga pompasından çıkarın ve en az 10 dakika RT’ye yerleştirin. Ag / AgCl elektrotlarını% 70 EtOH çözeltisinden çıkarın. Bir multimetre kullanarak epitel tabakasının direncini ölçmek için sırasıyla üst girişe ve alt çıkışa iki Ag / AgCl elektrotu yerleştirin. Sırasıyla alt girişe ve üst çıkışa iki Ag/AgCl elektrodu yerleştirin. Bu iki değerin ortalamasını Gut-on-a-Chip için bir direnç değeri olarak bildirin.NOT: Boş TEER, epitel olmadan yalnızca ECM kaplamalı bir Çip üzerinde Gut-on-a-Chip üzerinde ölçülmelidir. Transepitelyal elektrik direncinin hesaplanması (TEER) değeri (kΩ ×cm2) denklem (1) kullanılarak hesaplanabilir.TEER = (Ωt – Ωboş) × A (1)Ωt , deneyin başlangıcından bu yana belirli bir zaman noktasında ölçülen bir direnç değeridir, Ωboşluk , epitel olmadan ölçülen bir direnç değeridir ve A, bir hücre tabakası tarafından kaplanan yüzeyin alanıdır (bu Gut-on-a-Chip tasarımı için yaklaşık 0.11cm2 29).Denklem (2)’yi kullanarak normalleştirilmiş TEER’i hesaplayın.TEER = (2)BuradaΩ 0 , daha önce30 bildirildiği gibi deneyin ilk okuma zaman noktasında bir direnç değeridir (Şekil 4C).