炎症性腸疾患患者由来の腸管オルガノイドを用いたイヌ腸チップの3次元形態形成

この研究は、ワシントン州立大学の動物管理および使用委員会(ASAF#6993)に従って承認され、実施されました。このプロトコルでは、社内で製造されたPDMS製の定評あるGut-on-a-Chipマイクロ流体デバイスを利用しました2(図1D)。Gut-on-a-Chipマイクロデバイスの製造の詳細な方法は、以前のレポート2,24に記載されています。このプロトコルは、腸管オルガノイドとマイクロ流体システムのユニークな統合を示しています(図2)。 1. PDMS製Gut-on-a-Chipの表面活性化 50 mLのコニカルチューブ内の蒸留(DI)水49 mLに50%PEI溶液1 mLを加えて、1%ポリエチレンイミン(PEI)溶液を調製します。チューブを2〜3回ひっくり返して溶液をよく混合し、0.2μmのシリンジフィルターで溶液をろ過します。注意: 4°Cで保管してください。 50 mLのコニカルチューブ内の49.9 mLのDIに100 μLの50%GA溶液を加えて、0.1%グルタルアルデヒド(GA)溶液を調製します。チューブを2〜3回ひっくり返して溶液をよく混合し、0.2μmのシリンジフィルターで溶液をろ過します。注意: 4°Cで保管し、直射日光にさらさないように保護してください。 Gut-on-a-Chipデバイスを60°Cに設定したドライオーブンに入れ、30分以上インキュベートして水分を取り除きます。 UV/オゾン発生器を使用して、Gut-on-a-ChipデバイスをUVおよびオゾン処理に60分間さらします。注意: 処理中にPDMS表面を最適に活性化するために、UVランプとデバイスの間に約3cm以下の距離を維持してください。効率的な表面活性化を実現するために、発電機内のデバイスの過密を避けてください。 上部マイクロチャンネルの入口、バイパス、および出口チューブをバインダークリップを使用してクランプして固定します。また、下部マイクロ流路のインレットチューブをクランプします。 下部マイクロチャンネルのアウトレットチューブを外します。下部マイクロチャネルのバイパスチューブが開いたままであることを確認します。 P100マイクロピペットを使用して、下部マイクロチャンネルの出口穴から100 μLの1% PEI溶液を導入します。注意: このプロセスは、デバイスがUV /オゾン曝露からまだ暖かくなっている間に実行することをお勧めします。PEI溶液がマイクロ流路を流れ、PEI溶液が滴下して下部マイクロ流路のバイパスチューブから出てくるのを観察します。 下部マイクロチャンネルのアウトレットチューブを再接続します。 下部マイクロチャネルの入口、バイパス、および出口チューブをバインダークリップを使用してクランプして固定します。また、上部マイクロ流路のインレットチューブをクランプします。 上部マイクロチャンネルのアウトレットチューブを外します。上部マイクロチャネルのバイパスチューブが開いたままであることを確認します。 P100マイクロピペットを使用して、100 μLの1% PEI溶液を上部マイクロチャンネルの出口穴から導入します。メモ:PEI溶液がマイクロチャネルを流れ、PEI溶液が滴下して上部マイクロチャネルのバイパスチューブから出てくるのを観察します。 上部マイクロ流路の出口チューブを再度取り付けます。 上部と下部の両方のマイクロチャネルを 1% PEI 溶液で満たしたら、デバイスを室温(RT)で 10 分間インキュベートします。 手順1.5〜1.12を0.1%GA溶液で実行します。 上部と下部の両方のマイクロチャネルを0.1%GA溶液で満たしたら、デバイスを室温で20分間インキュベートします。 脱イオン水で手順1.5〜1.12を実行し、余分な表面活性化溶液を取り除きます。 チップを60°Cの乾燥オーブンに入れ、一晩乾燥させます。注意: チューブの衝突を避けるために、すべてのチューブからバインダークリップを必ず取り外してください。この乾燥プロセスは、Gut-on-a-Chip12内のマイクロチャネルの表面活性化に不可欠です。 2. Gut-on-a-Chip培養のための細胞外マトリックス(ECM)コーティングおよび培地の調製 コラーゲンIおよびマトリゲルの最終濃度がそれぞれ60 μg/mLおよび2 %(vol/vol)となるように、オルガノイド基礎培地とECM混合物を調製します。注:腸チップごとに 50 μL の ECM 混合物を調製します(つまり、上下のマイクロチャンネルごとに 20 μL の ECM 混合物と 10 μL のエクストラ)。使用当日にこれを調製し、この溶液を4°Cで保存するか、使用する準備ができるまで氷上に置いてください。 UV /オゾン、PEI、およびGAで処理されたGut-on-a-Chipをドライオーブンから取り出します。注意: 位相差顕微鏡で検査して、水分が残っていないか確認してください。 Gut-on-a-Chipをバイオセーフティキャビネット内で10分間冷却します。 上部マイクロチャンネルの入口、バイパス、および出口チューブをバインダークリップを使用してクランプして固定します。また、下部マイクロ流路のインレットチューブをクランプします。 下部マイクロチャンネルのアウトレットチューブを外します。 P100マイクロピペットを使用して、20 μLのECM混合物を下部マイクロチャンネルの出口穴から導入します。注:気泡が閉じ込められることなくマイクロチャネルを流れるECM混合物を観察します。気泡が存在する場合は、気泡がなくなるまで、追加のECM混合物を下部マイクロチャネルに導入します。 下部マイクロチャネルのアウトレットチューブを再度取り付けます。 下部マイクロチャネルの入口、バイパス、および出口チューブをバインダークリップを使用してクランプして固定します。また、上部マイクロ流路のインレットチューブをクランプします。 上部マイクロチャンネルのアウトレットチューブを外します。 P100マイクロピペットを使用して、上部マイクロチャンネルの出口穴から20 μLのECM混合物を導入します。 上部マイクロ流路のアウトレットチューブを再度取り付けます。 チップを加湿したCO2インキュベーターに5%CO2を含ませ、37°Cで1時間、PEIおよびGAで処理したPDMSメンブレン上にECM層を形成します(図3A)。注:インキュベーション中は、すべてのチューブがクランプされていることを確認してください。 ECMコーティングのインキュベーション中に、A8301を欠くが、10 μM Y-27632および2.5 μMのCHIR99021を含むオルガノイド培養培地である冷播種培地を含む2つの1 mLシリンジを調製します。注:A8301 は培地から除去し、以前に報告されたように、コーティングされた ECM への細胞の接着を強化しました2。Gut-on-a-Chip培養の 0 日目には、上部マイクロチャネルフローのみが必要です。したがって、上部チャネルにはフルシリンジを、下部チャネルには最低0.2 mLを準備します。 ECMコーティングが完了したら、チップをインキュベーターから取り出し、下部マイクロチャネルに接続されたバイパスチューブへのクランプを外します。 播種培地を充填した1 mLシリンジを、Gut-on-a-Chipの下部マイクロチャネルに連結された平滑端ニードルに接続します。播種培地(~50 μL)をバイパスチューブに慎重に導入します。導入した培地をチューブに充填したら、下部のマイクロチャンネルに接続されたバイパスチューブをバインダークリップで固定します。 下部マイクロチャンネルに接続されているアウトレットチューブのクランプを解除します。播種培地を下部マイクロ流路に慎重に導入し、システム内をスムーズに流れるようにします。灌流後、下部マイクロチャネルに接続されたアウトレットチューブをバインダークリップで固定します。 次に、上部マイクロ流路に接続されているバイパスチューブを開きます。 播種培地を充填した1 mLシリンジを、Gut-on-a-Chipの上部マイクロチャンネルに連結された平滑末端ニードルに接続します。播種培地(~50 μL)をバイパスチューブに慎重に導入します。導入した培地をチューブに充填したら、上部マイクロチャンネルに接続されたバイパスチューブをバインダークリップで固定します。 下部マイクロチャネルに接続されているアウトレットチューブを外します。播種培地を上部マイクロ流路に慎重に導入し、システム内をスムーズに流れるようにします。上部マイクロチャンネルに接続されたアウトレットチューブは、灌流後にバインダークリップで固定します。 3. 播種用イヌ腸オルガノイド細胞調製 注:Gut-on-a-Chipモデルを生成するために、IBD患者犬に由来する犬の結腸オルガノイド(コロノイドと呼ばれる)をこのプロトコルで利用しました。これらのコロノイドは、以前に報告された方法に従って、生検された結腸組織の3〜5個の小さな断片に由来しました15,18。最適な結果を得るには、in vitroアプリケーションに適した安定したオルガノイドを確立するために、少なくとも3回の培養継代を経た犬用コロノイドを使用することが重要です。オルガノイド内の多系統細胞の適切な分化を促進し、機能的成熟度とGut-on-a-Chipモデルでのその後の実験への適合性を確保するために、少なくとも3〜4日間犬コロノイドを培養することをお勧めします。この研究の継代の上限は、20の連続した継代を通して変化していない表現型と核型を実証した以前の研究によって示されているように、20未満です25。これらのドナーのシグナルは、補足表S1に示されている。 以前に報告された培地15,26,27から改変した材料表に記載されているオルガノイド培養培地を用いて、30μLのマトリゲル15,18に埋め込まれた24ウェルプレートでイヌコロノイドを培養します。馴化培地は、Noggin28を分泌するように操作されたRspo1細胞およびHEK293細胞を培養することによって得られた。 オルガノイド培養培地を真空吸引して廃棄し、氷冷温度で500 μLの細胞回収溶液を各ウェルに導入します。4°Cで30分間インキュベートします。注:典型的には、成熟したイヌ腸オルガノイドの24ウェルプレートのうち3ウェルは、10倍の倍率で40-50オルガノイド/1視野を持つ単一のGut-on-a-Chipデバイスを播種するのに十分な量の解離細胞を提供します。 P1000マイクロピペットを使用して、マトリゲル・ドームを機械的に5秒間破壊します。続いて、オルガノイド懸濁液を15 mLのコニカルチューブに集めます。 コニカルチューブを200 × g 、4°Cで5分間遠心分離し、続いて上清を除去します。 1 mLのトリプシン様プロテアーゼを室温で導入し、10 μM Y-27632を添加し、P1000マイクロピペットを使用してピペッティングして細胞ペレットを再懸濁します。 細胞懸濁液を37°Cにセットしたウォーターバスに入れ、混合物を定期的に振とうしながら10分間インキュベートします。 5 mLの温かいオルガノイド基礎培地を導入し、P1000マイクロピペットを使用して細胞懸濁液が濁り、目に見える細胞塊がなくなるまで激しくピペット操作します。 細胞懸濁液を70 μmカットオフのセルストレーナーに通し、マトリゲルの破片や大きな細胞クラスターを除去します。 コニカルチューブを200 × g 、4°Cで5分間遠心分離し、続いてペレットを播種培地に再懸濁します。1台のイヌGut-on-a-Chipデバイスの播種では、20 μLの播種培地を使用して細胞ペレットを再懸濁します(すなわち、1つのGut-on-a-Chipデバイスを播種する場合は20 μLの播種培地を使用します)。 以前に報告されたように、播種培地で生細胞の濃度を1×107細胞/mLに変更します2。10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルーを組み合わせて血球計算盤を用いて生存率を評価し、顕微鏡で細胞を観察します。注:細胞濃度を適切に調整して、最適な細胞接着とチップ膜上に均一な単層を形成することが重要です。初期の細胞数が不十分な場合、コンフルエント単分子膜の確立が遅れたり、失敗したりする可能性があります。逆に、細胞数が多すぎると、非接着細胞がチャネル内で凝集して凝集し、望ましくない濃縮効果につながる可能性があります。 4. 2次元細胞単分子膜の播種と形成 上部マイクロチャンネルのアウトレットチューブを外します。上部マイクロチャネルのバイパスチューブが開いたままであることを確認します。下部マイクロチャネルの入口と出口の両方をバインダークリップで固定して固定します。 P100 または P20 マイクロピペットを使用して、プロトコル 3 の細胞懸濁液 20 μL を上部マイクロチャンネルの出口ホールに導入します(図 3B 播種)。 上部マイクロチャネルのバイパスチューブとインレットチューブをバインダークリップで固定して固定します。次に、出口チューブを上部マイクロ流路の出口穴に再度取り付け、上部マイクロ流路に圧力がかからないように、プロセス全体を通してチューブが開いたままになるようにします。このステップの後、バインダークリップを使用して上部チャネルのアウトレットチューブをゆっくりと固定し、クランプします。 顕微鏡を使用して、細胞が上部マイクロチャネル全体に均等に分布していることを確認します。注:チューブをクランプしてチャネル内の培地の動きを停止し、望ましい細胞接着が完了するまで安定した静的状態を可能にすることが重要です。 チップを加湿したCO2 インキュベーター(37°C)に入れます。注:犬の腸管オルガノイド細胞がECMコーティングに付着するまでに約3時間かかります(図3B の付着)。 Gut-on-a-Chipの上部マイクロチャネルに取り付けられたシリンジを、CO2 インキュベーター内に配置されたシリンジポンプに接続します。注:シリンジポンプのノブを使用して培地をマイクロチャンネルに慎重に洗い流し、結合していない細胞を取り除きます。チップを顕微鏡で観察し、付着していない細胞が効果的に洗い流されていることを確認します。 播種培地で30μL/hの培養培地の流れを開始します。この連続フローは、Gut-on-a-Chip上に2D単層が確立されるまで、最初は上部マイクロチャネルのみを対象としています。下部のマイクロチャネルについては、マイクロチャネルをクランプし、媒体をフラッシュしないままにします。 細胞を播種した翌日から、培養液を播種培地からA8301を含み、10μMのY-27632と2.5μMのCHIR99021を欠いたオルガノイド培養液に変更します。 単分子膜が確立されたら、下部マイクロチャネルへの連続培地フローも開始します。イヌの腸管オルガノイド上皮細胞が上皮単層を確立するまでには通常2〜3日かかります(図3C)。 5. イヌGut-on-a-Chipにおける3次元形態形成の確立 注:Gut-on-a-Chipでコンフルエント単分子膜を形成した後、 図2に示すように、上流路と下流路の両方の培地フローと細胞株を導入して、2D単分子膜への3D形態形成を開始しました。 オルガノイド培養培地を上部と下部の両方のマイクロチャネルに導入して、Gut-on-a-Chipシステムで3D形態形成の発達を開始します。既存の Gut-on-a-Chip 設計 (高さ 500 μm のマイクロチャネル) で 0.02 dyne/cm2 のせん断応力を達成するには、流速を 50 μL/h に増やします29。 in vitroで培養した細胞に周期的なひずみを適用するコンピューター制御のバイオリアクターを使用して、2の前に推奨されているように、細胞株の10%と周波数の0.15Hzを開始します。このプロセスでは、Gut-on-a-Chipデバイスに真空吸引が適用されます。 これらの培養条件を最低2〜3日間維持します。イヌ腸単層の3D形態形成は、通常、硬膜チャネルの流れと真空吸引が開始されてから2〜3日後に発生します(図3C)。 6. イヌGut-on-a-Chipの特性評価 ライブセルイメージングシリンジポンプを使用して培地を静かに流し、Gut-on-a-Chip内の気泡を取り除きます。 Gut-on-a-Chipデバイスをシリンジポンプから外します。注意: Gut-on-a-Chip内で圧力をかける可能性のある操作は避けてください。 デバイスを顕微鏡上に配置して、確立された3D上皮の画像を撮影します。位相差を使用して3D上皮層の構造を可視化するには、10倍および20倍の対物レンズを使用します(図3C)。 免疫蛍光染色1 g の BSA を 50 mL のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解して 2% BSA を調製し、ブロッキング溶液を調製します。溶液を0.2μmのシリンジフィルターに通してろ過します。この溶液を4°Cで保存してください。 150 μL の Triton X-100 と 50 mL のブロッキング溶液を混合して透過処理溶液を調製し、最終濃度が 0.3% Triton X-100 になるようにします。溶液を0.2μmのシリンジフィルターに通してろ過します。この溶液を4°Cで保存してください。 ステップ 2.4-2.11 で説明したように、100 μL の 4% PFA を上部と下部の両方のマイクロチャンネルに注入して、細胞を固定します。 ステップ 2.4-2.11 で説明したように、100 μL の PBS を上部と下部の両方のマイクロチャネルに注入して、細胞をすすぎます。 ステップ2.4-2.11で説明したように、100μLの0.3%トリトンを上部および下部の両方のマイクロチャネルに注入して、細胞の透過処理を行います。デバイスを室温に30分間置きます。 ステップ 2.4-2.11 で説明したように、100 μL の PBS を上部と下部の両方のマイクロチャネルに注入して、細胞をすすぎます。 ステップ2.4〜2.11で説明したように、100 μLの2% BSAを上部および下部の両方のマイクロチャネルに注入して、非特異的結合を防ぐために細胞のブロッキングを行います。デバイスを室温に1時間置きます。 2% BSAで希釈した一次抗体溶液20 μLを注入し、室温で3時間置いた後、4°Cで一晩インキュベートします。注:4°Cで一晩インキュベーションしている間、すべてのチューブがクランプされていることを確認してください。一次抗体の濃度は、単層または3Dオルガノイド染色の推奨濃度の2〜5倍にする必要があります(補足図S1)。 ステップ2.4-2.11で説明したように、100 μLのPBSを上下両方のマイクロチャンネルに注入して細胞をすすぎます。 2% BSAで希釈した二次抗体溶液20 μLを注入し、室温で1時間置きます。注:インキュベーション中は、すべてのチューブがクランプされていることを確認してください。このステップから始めて、光退色を防ぐためにデバイスのセットアップをアルミホイルでシールドする必要があります。 ステップ2.4-2.11で説明したように、100 μLのPBSを上下両方のマイクロチャンネルに注入して細胞をすすぎます。 F-アクチンとDAPI(ジアミジノ-2-フェニルインドール)の対比染色用の複合溶液を調製します。ステップ 2.4-2.11 の説明に従って、20 μL の混合溶液を上部と下部の両方のマイクロチャネルに注入します。 ステップ 2.4-2.11 で説明したように、100 μL の PBS を上部と下部の両方のマイクロチャネルに注入して、細胞をすすぎます。蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、3D上皮細胞の構造の蛍光イメージングを行います。 7.上皮バリア機能 シリンジポンプを使用して培地を静かに流し、Gut-on-a-Chip内の気泡を取り除きます。測定中は、すべてのチューブが開いていることを確認してください。 シリンジポンプからGut-on-a-Chipを取り出し、室温に少なくとも10分間置きます。 70% EtOH溶液からAg/AgCl電極を除去します。 上部入口と下部出口にそれぞれ2つのAg/AgCl電極を配置し、マルチメーターを使用して上皮層の抵抗を測定します。 2つのAg/AgCl電極をそれぞれ下部入口と上部出口に配置します。これら 2 つの値の平均を Gut-on-a-Chip の抵抗値として報告します。注:ブランクTEERは、上皮のないECMコーティングのみを施したGut-on-a-Chipで測定する必要があります。 経上皮電気抵抗(TEER)値(kΩ×cm2)の計算は、式(1)を用いて算出することができる。TEER = (Ωt – Ωブランク) × A (1)ここで、Ωtは実験開始以降の特定の時点で測定された抵抗値であり、Ωブランクは上皮のない時点で測定された抵抗値であり、Aは細胞層で覆われた表面の面積である(このGut-on-a-Chip設計では約0.11cm22)。式 (2) を使用して正規化された TEER を計算します。ティール = (2)ここで、Ω0 は、以前に報告された実験の最初の読み取り時点における抵抗値です30 (図4C)。