単一核マルチオームアッセイのための高品質脳および骨髄核調製(英語)

実験手順は、動物実験倫理委員会(CETEA)によって承認されたプロトコルの厳格な規制遵守の下で実施されました。脳核の単離には、3ヶ月齢のC57BL/6マウスを用いた。骨髄の単離には、体重18gの8週齢の雌のC57BL/6Jマウスを用いた。 1. マウス脳の核の精製 注意: 処置中は常にラテックスまたはニトリル手袋を着用してください。実験は2人で行い、ステップ1から3(単核懸濁液の調製)は1人で行い、ステップ4(ソーターの調製)はもう1人で並行して行うことを強くお勧めします。このプロトコルは時間的制約が大きいため、単核懸濁液が調製されたらすぐにソーターを準備して、サンプル処理時間を最小限に抑えることが重要です。 試薬・材料の調製解剖器具はオートクレーブ(121°Cで20分間)で慎重に滅菌し、使用直前に70%のエタノールで洗浄してください。サンプルごとに1つのペトリ皿を準備し、2〜3 mLの氷冷1x Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で満たします。 微量遠心分離機を 4 °C に冷却し、バケツに氷を入れ、ガラス製ダウンスホモジナイザーを氷の上に置きます。 ジギトニンを添加して核溶解バッファーを調製し、最終濃度が0.01%、サンプルあたり10 mLになります。 RNase阻害剤を細胞染色バッファーに添加して、最終濃度が0.2 U/μL、サンプルあたり20 mLになるように染色バッファーを調製します。 RNase阻害剤を添加してDPBS 0.04% BSAを調製し、最終濃度が0.2 U/μL、サンプルあたり2 mLになるようにします。 Multiome プロトコル25 に従って 1 mL の希釈核バッファーを調製します。 すべての試薬とサンプルを氷上に保管してください。 組織解剖施設が承認したプロトコルを使用してマウスを生贄に捧げます。このプロトコルでは、ケタミン/キシラジンの過剰摂取後にマウスを斬首しました。 マウスの頭をハサミで切り取り、頭蓋骨から脳を取り出します(Meyerhoff et al.26)。発光ダイオード(LED)照射実体顕微鏡の下で、氷のように冷やした1x DPBSで調製したペトリ皿に脳を直ちに移します。 メスで脳組織を切断して、関心のある脳領域(例:嗅内皮質、海馬、前頭前野)を分離し、各領域を氷冷の1x DPBSを含む別々のペトリ皿に移します。氷の上に置いてください。 メスで組織を<0.5cmの小片に細かく刻み、次のステップでの均質化を容易にします。 P1000マイクロピペットを使用して、ミンチ組織と1x DPBSをペトリ皿から1.5 mLチューブに移します。タンパク質の低吸着性プラスチック製のチューブを必ず使用してください。組織片を重力で分離させます。P1000マイクロピペットを使用して、余分な1x DPBSを慎重に除去します。注:このステップの後、タンパク質低結合チューブをドライアイスに移し、核単離に進むまで-80°Cで保存することにより、ミンチ組織を急速凍結することができます。 核の単離0.01%ジギトニンを含む氷冷した核溶解バッファー2 mLをガラスダンプに充填します。ティッシュ片をダンスに追加します。注:新鮮凍結組織を扱う場合は、みじん切りにした凍結組織を核溶解バッファー0.01%ジギトニンに直接添加します。前にティッシュを解凍させないでください。 ガラス製の組織ホモジナイザーを使用して、乳棒Aで25回、次に乳棒Bで25回ホモジネートをホモジネートし、ホモジネートを15 mLチューブに移します。 さらに2 mLの氷冷核溶解バッファーと0.01%ジギトニンを加え、氷上で5分間インキュベートします。核を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 マイクロピペットで上清を除去し、0.01%ジギトニンを含む氷冷核溶解バッファー4 mLを加えます。氷上で5分間インキュベートし、40 μmのセルストレーナーでろ過します。 核を500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、マイクロピペットで上清を除去します。 4 mLの染色バッファーを加えて核を洗浄し、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 マイクロピペットで上清を除去し、ペレットを4 mLの染色バッファーに再懸濁します。 40 μmのセルストレーナーでろ過し、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 0.04% BSAを含むPBS1 mLに再懸濁します。 異なるサンプル間で組織/核調製の一貫性を確保するために、核をカウントします。同じ脳領域から同様の核数を得ることが期待されています。空の0.5 mLチューブに0.4%トリパンブルー10 μLを加えます。核10 μLを加え、ピペッティングで5回混合します。 サプライヤーの推奨事項に従って、自動セルカウンターを使用して核をカウントします。原子核を氷上に保管します。 選別用の核を準備します。注:抽出された核には7-AADが組み込まれており、この染色は蛍光活性化セルソーター(FACS)による精製に使用されます。100 μLの核をFACSチューブに移し、未染色コントロールを行います。残りの核に7-AADを10 μL添加し、4°Cで5分間保持します。 最低 0.5 x 106 個の原子核を FACS で選別し、ダブレットやデブリを除去します。 FACSを用いた原子核選別注:核選別はさまざまなセルソーターで実行できますが、BD FACSAria FusionまたはBD FACSAria III装置の使用手順をここで説明します。セルソーターの校正とセットアップは、監督下または装置の経験豊富なユーザーが行うことを強くお勧めします。サンプル処理時間を短縮するには、単一核懸濁液が調製されたらすぐにソーターを準備することが重要です。FACS機器の校正セルソーターとコンピューターの電源を入れます。ソフトウェアを装置に接続したら、流体系スタートアップ手順を開始します。メインメニューでCytometer>Fluidic startup-upを選択し、4つのステップに従います。それぞれを完了したら、[ 完了 ]をクリックします。 70μmのノズルを挿入し、ストリームをオンにし、ストリームを15分間安定させます。振幅を調整してドロップを形成し、 スイートスポットをクリックします。 NDフィルター1.0を装着し、サイトメーターのセットアップとトラッキング(CST)インターフェースを開きます。 日常の品質管理:CSTビーズをFACS培地で希釈し(サプライヤーの推奨を参照)、CST管理を実施します。完了したら、N.D 1.0 を N.D 2.0 に交換します。 AccudropsをFACS培地で希釈し(サプライヤーの推奨事項を参照)、ステップ6〜10の説明に従って滴下遅延を実行します。 実験テンプレートで、 Accudrop Drop Delay 実験を選択し、チューブの [並べ替えレイアウト ] を開きます。 下部のカメラウィンドウ内で、[ 電圧 ]、[ 光学フィルター ]の順にクリックして、偏向板に電荷を印加し、カメラの前で特定の光学フィルターを使用できるようにします。右側の象限が 100 を示していることを確認します。必要に応じて、赤いレーザーネジを調整して、レーザーの衝撃を最適化します。 毎秒1,000〜3,000イベントの速度に達するように流量を調整します。 [ 並べ替え て キャンセル]をクリックします。左の象限が 100 で、右の象限が 0 であることを確認します。左象限が 95 未満の場合は、 自動遅延を実行します。 [Voltage]をクリックし、[Test Sort]をクリックします。コレクションチューブ内の副流堆積物の品質を制御します。必要に応じて、スライダーを動かしてサイドストリームの位置を調整します。 原子核選別のためのFACS装置のセットアップ。未染色の核の取得を開始します。これらは、前方散乱と側方散乱、および7-ADDパラメータの検出器電圧を定義するために使用されます。未染色サンプルの 7-AAD シグナルがドットプロットの対数スケールの最初の 10 年以内に収まるようにパラメーターを設定します。 (1)FSC-A/SCC-A と FSC-H/SSC-H でサイズと粒度、(2) FSC-H/FSC-A でダブレット識別、(3) SSC-A/7-AAD で 7-AAD 陽性核をベースとしたゲーティング戦略を使用して、7-AAD 染色核のチューブの取得を開始し、核集団を定義します( 図 2A を参照)。 流れとたわみが安定していることを確認してください。 サイドストリームカメラで、テストソートをオンにし、電圧 をオンにして、左側に取り付けた1.5 mLチューブで正確な液滴ソーティングを確認します。 [ 並べ替えレイアウト ] ウィンドウで、手順 2 (上記) で定義した対象の母集団を選択します。 [Target Events] で、[ Continuous ] のしきい値を選択して、サンプルあたり最小 0.5 x 106 個の核を取得します。 精度(Precision)で、 4 ウェイ純度(4-Way Purity)を選択します。 準備ができたら、[ 並べ替え ]と [OK ]をクリックして、原子核の並べ替えを開始します。 精製された核の品質管理と計数注:このステップは、10Xクロムチップにロードされるソートされた核の純度をテストすることを目的として、サンプル調製ステップを最適化するためのパイロット実験中にのみ実行されます。プロトコルが完全に最適化されたら、追跡実験でこの品質管理ステップを実行して、収集された核が少数で不必要に無駄になるのを避けることはお勧めしません。フローサイトメトリーによる純度制御選別した核10 μLを、2%熱不活化ウシ胎児血清(HI-FBS)を含む90 μLのDPBSを含む新しいFACSチューブに移します。 選別後のデータを取得して記録し、選別純度と実行可能性を検証します。4.2で定義されているように、少なくとも98%の核が目的のゲートに現れるようにします( 図2Bを参照)。 精製された核を数える選別した核を500 x g および4°Cで5分間遠心分離し、マイクロピペットを使用して上清を慎重に完全に除去します。希釈した核バッファー100 μLに再懸濁します。 空の0.5 mLチューブに0.4%トリパンブルー10 μLを加えます。選別した核を10 μL添加し、ピペッティングで5回混合します。 サプライヤーの推奨事項に従って、自動セルカウンターを使用して核をカウントします。核濃度を 3.5 x 106/mL、つまり 5 μL あたり 16,000 核に調整します。 顕微鏡による精製核の品質管理注:このステップは、10Xクロムチップにロードされる原子核の品質をテストするためのサンプル調製ステップを最適化するためのパイロット実験中にのみ実行する必要があります。プロトコルが完全に最適化されたら、追跡実験でこの品質管理ステップを実行して、収集された核が少数で不必要に無駄になるのを避けることはお勧めしません。顕微鏡のスライドとカバースリップが清潔でほこりがないことを確認してください。必要に応じて、カバーガラスを無水エタノールで洗ってすすぎ、糸くずの出ないワイプで乾かします。 使用するスライドウェルに25 μLのポリ-l-リジンを分配し、埃から保護して室温(RT)で10分間インキュベートします。 余分なポリ-l-リジンを除去し、精製した核懸濁液10 μLを加えます。埃から保護した室温で5分間インキュベートします。 気泡を避けながら、各ウェルに封入剤を一滴加えます。 種をまいた井戸の上にカバーガラスを置きます。紙ワイプで覆い、カバーガラスをしっかりと押して余分な封入剤を取り除きます。カバーガラスを動かさないように注意し、余分な封入剤を清掃しないでください。 明視野光と最小倍率40倍の倒立顕微鏡でいくつかの画像を撮影します。 マルチオームアッセイを実施します。ただちに Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide (CG000338 – Rev F)25 に進んでください。 2. マウス骨髄造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)からの核の精製 注 このプロトコルは骨髄HSPCsの3つのサブセットからの核の浄化を記述する: 血統cキット+Sca1+のhematopoietic幹細胞(HSC)、血統cキット+Sca-1-CD34+FcγR-共通の骨髄性前駆細胞(CMP)、および血統cキット+Sca-1-CD34+FcγR+顆粒球 – 単球前駆細胞(GMP)。施術中は常にラテックスまたはニトリル手袋を着用してください。このプロトコルは10Xゲノミクスの適応である – 単一セルMultiome ATAC + GEXの配列(CG000365 – Rev C)27のための核の分離を実証した。元のプロトコルでは、核の回収率を最大化するための修正が導入されています。ステップ1の実験は2人で行うことを強くお勧めします。を 3 に。(すなわち、単一細胞溶液の調製)を1人によって行い、ステップ4(すなわち、ソーターの調製)を別の人によって並行して行う。このプロトコルは時間的制約が大きいため、シングルセル懸濁液が調製されたらすぐにソーターを準備して、サンプル処理時間を最小限に抑えることが重要です。 試薬・材料の調製バケツに氷を入れます。 FACSバッファーを調製します:DPBSと2%HI-FBS溶液(6サンプルで約500 mL)と0.2 μmフィルターでろ過します。 10% HI-FBS溶液(サンプルあたり500 μL)を含むDPBSを採取し、0.2 μmフィルターでろ過します。 骨髄細胞の単離施設が承認したプロトコルを使用してマウスを生贄に捧げます。この実験では、ケタミン/キシラジンの過剰摂取後の子宮頸部脱臼によってマウスが犠牲になりました。 マウスの腹部と後ろ足に70%エタノールをスプレーします。 滅菌鉗子とハサミを使用して下腹部の真ん中を小さく切開し、後肢の付け根から横隔膜まで腹膜を開きます(補足図1)。 開いた腹膜に垂直な各後ろ脚に追加の切り込みを入れ、これらの追加の切り込みの1つの両側をつかんで引き離し、足首関節を過ぎて両後ろ足の皮膚を剥がし、両方の後ろ足の筋肉を露出させます(補足図1A)。 片方の後ろ足の股関節の脊椎に沿ってハサミを並べて、大腿骨を切らずに脚を切り取ります(補足図1B、C)。もう一方の脚についても同じことを繰り返します。 大腿骨を分離するには、筋肉組織の大部分を切り取り、大腿骨と脛骨を両手で指先で関節に保持します(補足図1D、E)。脛骨を大腿骨から脱臼させるために自然な曲がりに対して脚を静かに折りたたんでから(補足図1E)、結合組織をハサミで慎重に切断して大腿骨と脛骨を分離します。 軽くひねる動作でハサミを使用して、大腿骨の上端から背骨のビットを脱臼させます(補足図1E)。 孤立した大腿骨をティッシュペーパーで洗浄し、残りの筋肉と結合組織を取り除きます。 2 mLのDMEM(1x)+ GlutaMAX-Iで十分に満たされた12ウェルプレートで氷上で冷やしてください。 すべての大腿骨が採取されたら、筋肉と線維組織が骨から完全に取り除かれていることを確認します。(a)骨髄を無菌状態に保ち、(b)井戸内の細胞を失わないようにするために、骨を切開しないでください。Haag and Murthy28から適応した1匹のマウスの2つの大腿骨から細胞を洗い流すには、次の手順を使用します。 1.5mLと0.5mLのチューブを1本ずつ用意します。1.5 mL チューブに 150 μL の FACS バッファーを添加し、18 G のニードルを使用して 0.5 mL チューブの底に穴を開け、0.5 mL のチューブを 1.5 mL のチューブに取り付けます。 マウスの外科用ハサミを使用して各大腿骨の遠位部を開きます(補足図1F):ブレードの間に遠位骨端を固定し、ハサミをひっくり返しながら穏やかな圧力をかけて、骨を激しく切り開くことなく遠位骨端をスムーズに剥離します。成功すると、露出した物理末端に4つの突起が見えるはずです(補足図1G)。 2つの大腿骨を、開放端を下向きにして、FACS緩衝液を含む1.5 mLチューブ内に配置した準備した0.5 mLチューブに取り付けます(補足図1H)。 70 μmのセルストレーナーを50 mLのチューブにセットし、2 mLのFACSバッファーでストレーナーを事前に湿らせます。 骨髄を洗い流すには、遠心分離機が12,000 x gの値に達するまで12,000 x gでチューブを遠心分離し(キャップを開けて)、すぐに遠心分離を停止します。 骨髄細胞が1.5 mLチューブでペレット化され、大腿骨が白色(細胞洗浄前は赤色)であることを確認します(補足図1I)。2つの大腿骨と一緒に0.5 mLチューブを廃棄します。 150 μLの上清をピペットで廃棄します。 ペレットをマイクロピペットで1 mLのアンモニウム-塩化物-カリウム(ACK)溶解バッファーに室温で1〜2分間再懸濁し、赤血球を溶解します。インキュベーション時間が長くなると、有核細胞の生存率が低下する可能性があるため、避けてください。 あらかじめ湿潤させた70 μmのセルストレーナーを通して50 mLチューブに移します。 10 mLのFACSバッファーを添加してACK溶解バッファーを希釈し、溶解を停止します。 400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 最初に1 mLで再懸濁し、次に9 mLを補充して、10 mLのFACSバッファーに再懸濁します。 1.3.8の説明に従って、カウント用のセルを準備します。 サプライヤーの推奨事項に従って、自動セルカウンターを使用してセルをカウントします。2つの大腿骨から約4,000万個の細胞を採取することが期待されています。 骨髄HSPCの染色細胞を400 x gで4°Cで5分間遠心分離し、マイクロピペットでFACSバッファーにペレットを再懸濁し、最終濃度が1 x 107 cells/mLになるようにします。 P1000マイクロピペットを使用して、懸濁液をFACSチューブに移し、35 μmのセルストレーナーキャップでろ過します。 表1にリストされている各抗体について、単一の染色試験管サンプルを調製し、セルソーターでの蛍光色素の補正を設定します。抗体1本につきFACSチューブを1本用意し、チューブに200μLのPBSを充填します。 蛍光色素標識抗体の各FACSチューブに15 μLの蛍光色素補正ビーズを加えます。FACSチューブの未染色および生/死単染色細胞には、ビーズの代わりに500,000個の細胞を添加します。 各蛍光色素標識抗体( 表1参照)1 μLを対応するFACSチューブに加えます。0.5 μLの生/死染色を生/死単染色FACSチューブに加えます。 光から保護して15分間氷の上に保管してください。 表2に示すように、ミックス1と2を準備します。注: 表2 に示されている抗体容量は、 材料表で参照されている抗体に対して有効です。これらは、新しい抗体リファレンスまたは同じ抗体リファレンスの異なるロットに対して最適化する必要があります。 300 μL の Mix 1 をサンプルチューブに添加し、再懸濁し、光から保護された氷上で 15 分間保持します。 300 μL の Mix 2 をサンプルチューブに添加し、再懸濁し、光から保護された氷上で 20 分間保持します。 3 mL の FACS バッファーをシングル染色チューブおよびミックス染色サンプルチューブに加えます。4°C、400 x g で5分間スピンダウンします。 マイクロピペットを使用して上清を慎重に廃棄し、ペレットを500 μLのFACSバッファーに再懸濁します。 500 μL の収集培地をプレフィルドした 1.5 mL チューブを調製します。注:ミックス1は、HI-FBSの影響を大きく受ける生染色/死染色を含むため、DPBSで調製されています。細胞がLive/Deadで染色されたら、HI-FBSを含むFACSバッファーに再懸濁した蛍光色素標識抗体を含むMix 2を添加します。唯一の例外は、抗体ミックス1に含まれる抗CD16/32抗体で、次のステップで添加される他の抗体の非特異的結合を防ぐFc受容体遮断薬として機能します。 FACSを用いた細胞選別注:セルソーティングはさまざまなセルソーターで実行できますが、ここではBD FACSAria FusionまたはBD FACSAria III装置の使用手順について説明します。セルソーターのキャリブレーションとセットアップは、監督下または機器の経験豊富なユーザーが行うことを強くお勧めします。FACS機器の校正:プロトコル1のステップ4.1を参照してください。 細胞選別のためのFACS装置のセットアップ:未染色細胞の取得を開始します。これらは、各蛍光色素の前方散乱と側方散乱、および検出器電圧を定義するために使用されます。各蛍光色素の蛍光シグナルがドットプロットの対数スケールの最初の 10 年以内に収まるようにパラメーターを設定します。 単色のコントロールを取得して補正を手動で設定するか (正と負の母集団の中央値を揃える必要があります)、自動計算ソフトウェア (傾斜角の計測値) を使用します。補正コントロールが実験用蛍光色素および検出器の設定と一致していることを確認します。セルで 10,000 イベント、ビーズで 5,000 イベントを記録します。 サンプルチューブ(すなわち、マルチ染色細胞)を使用して、 図3Aに示すゲーティング戦略を用いて目的の細胞集団を定義します。手順 4 から 6 (下記) に従います。 目的の3つの骨髄HSPC(HSC、CMP、およびGMP)を特定するには、サイズ(FSC-A)と粒度(SSC-A)を使用して白血球にゲートし、次にFSC-H/FSC-Aを使用してダブレットを識別してゲーティングを開始します。 SSC-A/死細胞マーカーに基づいて、生細胞をゲートします。Lineage/c-Kitを使用して、リネージ陰性で、中程度から高レベルのc-Kitを発現する細胞を選択します。c-Kit/Sca-1を介して、3つの対象集団の1つである系統-c-Kit+ Sca-1+ (LKS+)造血幹細胞のゲート。 骨髄前駆細胞(系統-c-Kit+Sca-1-)のうち、FcγR/CD34を使用してCD34-FcγR-巨核球および赤血球前駆細胞(MEP)を除外し、CD34+ FcγR-CMP、およびCD34+FcγR+ GMPを選別する細胞集団に含めます。 流れとたわみが安定していることを確認してください。 サイドストリームカメラで、テストソートをオンにし、電圧をオンにし、左側に取り付けた1.5 mLチューブで正確な液滴ソーティングを確認します。 Sorting Layoutウィンドウで、目的の母集団(例では「LKS+」および「CD34+骨髄前駆細胞」)を選択します。[デバイス] で [2 チューブ] を選択します。精度(Precision)で純度(Purity)を選択します。[Target Events] で [Continuous] を選択して、160,000 から 200,000 の LKS+ および CD34+ 骨髄前駆細胞の間で並べ替えます。 500 μL の FACS バッファーを細胞懸濁液に加え、1 mL のサンプルを新しい 35 μm セルストレーナーキャップ付き FACS チューブにろ過して移し、取り込み直前にすべての細胞が 1 つの懸濁液に含まれるようにします。これにより、装置を詰まらせる可能性のある細胞の凝集がなくなります。 準備ができたら、[ 並べ替え ] と [OK ] をクリックして並べ替えを開始します。 流量 を調整して、速度を毎秒 10,000 イベント未満に維持します。注:定常状態の成体(8-12週齢)C57BL / 6J雌マウスのLKS+ とCD34+ 骨髄前駆細胞の予想される比率は1:3です。通常、ソート後30分以内にターゲットソートされた細胞数に到達します。 選別された細胞の品質管理とカウント注:このステップは、核単離に使用される選別済み細胞の純度をテストすることを目的として、サンプル調製ステップを最適化するためのパイロット実験中にのみ実行する必要があります。プロトコルが完全に最適化されたら、核単離に利用できる出発物質が不必要に無駄になるのを避けるために、フォローアップ実験でこの品質管理ステップを実行することはお勧めしません。フローサイトメトリーによる純度制御選別した細胞10 μLを、90 μLのFACSバッファーを含む新しいFACSチューブに移します。 選別後のデータを取得して記録し、選別純度と実行可能性を検証します。セルの少なくとも95%が、3〜6で定義され、 図3Bに示されているように、目的のゲートに現れることを確認します。 選別された骨髄HSPCからの核の単離10X Genomics Demonstration Protocol – Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 – Rev C)27 の付録の「Low Cell Input Nuclei Isolation」プロトコルを使用し、核回収を最適化するために以下の変更を加えます。溶解時間:このプロトコルのパイロット実験を実施して、核単離に最適な溶解時間を特定します。無傷の核を維持しながら、完全な細胞溶解を確実に達成してください。注:上記の10X Genomicsプロトコル27 のステップfは、「氷上で3〜5分間[溶解バッファー中で]インキュベートする」ように指示しています。パイロット実験中は、少なくとも3分、4分、5分間試験し、フローサイトメトリーと顕微鏡イメージングによるカウントと品質によって回収された核の量を評価し、最適な溶解時間を選択します(以下のこれらの品質管理チェックの説明を参照)。試薬を節約するには、パイロット実験で希釈した核バッファーをPBS 0.04% BSAと交換します。骨髄HSPCでは、3分が最適な溶解時間として同定されました。 細胞遠心分離:すべての細胞懸濁液遠心分離では、300 x g で7分間遠心分離します(CG000365 – Rev Cでは5分間ではなく)27 、4°Cで遠心分離します。 核遠心分離:CG000365 – Rev C27に従って、500 x gで5分間、すべての核懸濁液遠心分離を行います。 核の採取:ステップbで、50 μLのPBS 0.04% BSAに再懸濁し、0.2 mLのチューブに移した後、50 μLのPBS 0.04% BSAを元のチューブに加え、ピペットミックスして残った細胞を回収します。0.2 mLチューブに移し替えて、合計100 μLの容量にします。 今後、総容量はプロトコルの 50 μL ではなく 100 μL になります。下流のステップを適宜調整します(例えば、ステップdでは45 μLではなく90 μLを除去し、ステップeでは45 μLではなく90 μLの溶解バッファーを添加します)。 ステップmでは、核ペレットを7 μLではなく12 μLの希釈核バッファーに再懸濁します。 孤立した核を数えます。空の 0.5 mL チューブに、10 μL の 0.4% トリパンブルーと 8 μL の PBS 0.04% BSA を加えます。 2 μL の核をチューブに加え、1.3.8 の説明に従って核を数えます。サプライヤーの推奨事項に従って自動セルカウンターを使用してください。 フローサイトメトリーによる純度制御注:このステップは、10X Chromiumチップにロードされる核の純度をテストするためのサンプル調製ステップを最適化するためのパイロット実験中にのみ実行する必要があります。プロトコルが完全に最適化されたら、追跡実験でこの品質管理ステップを実行して、収集された核が少数で不必要に無駄になるのを避けることはお勧めしません。核単離が完了したら、150 μLのFACSバッファーをプレフィルした新しいFACSチューブに6 μLの核再懸濁液を移します。3 μL の 7-AAD を加え、氷上で 5 分間インキュベートします。 選別後のデータを取得して記録し、選別純度と実行可能性を検証します。プロトコル 1 のステップ 4.2 で定義されているように、核の少なくとも 95% が目的のゲートに現れるようにします( 図 4 を参照)。 顕微鏡検査による精製核の品質管理:注:このステップは、10X Chromiumチップにロードされる原子核の品質をテストするためのサンプル調製ステップを最適化するためのパイロット実験中にのみ実行する必要があります。プロトコルが完全に最適化されたら、追跡実験でこの品質管理ステップを実行して、収集された核が少数で不必要に無駄になるのを避けることはお勧めしません。手順1.5.3の説明に従って続行します。 マルチオームアッセイの実施ただちに Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide (CG000338 – Rev F)25 に進んでください。