Preparazione di nuclei cerebrali e del midollo osseo di alta qualità per saggi multiomi a nucleo singolo

Le procedure sperimentali sono state condotte nel rigoroso rispetto dei protocolli approvati dal Comitato per l’Etica nella Sperimentazione Animale (CETEA). Per l’isolamento dei nuclei cerebrali sono stati utilizzati topi C57BL/6 di 3 mesi. Per l’isolamento del midollo osseo sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J di 8 settimane del peso di 18 g. 1. Purificazione dei nuclei dal cervello di topo NOTA: Indossare sempre guanti in lattice o nitrile durante la procedura. Si consiglia vivamente di avere due persone che eseguono l’esperimento, che le fasi da 1 a 3 (cioè la preparazione della sospensione dei singoli nuclei) vengano eseguite da una persona e la fase 4 (cioè la preparazione del selezionatore) eseguita in parallelo da un’altra persona. Poiché il protocollo è altamente sensibile al fattore tempo, è fondamentale ridurre al minimo i tempi di elaborazione del campione avendo il selezionatore pronto non appena viene preparata la sospensione dei singoli nuclei. Preparazione di reagenti e materialiSterilizzare accuratamente gli strumenti di dissezione in autoclave (a 121 °C per 20 min) e lavarli con etanolo al 70% poco prima dell’uso. Preparare una capsula di Petri per campione, riempita con 2-3 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) ghiacciata 1x Dulbecco. Raffreddare la microcentrifuga a 4 °C, riempire un secchio di ghiaccio e mettere l’omogeneizzatore in vetro sul ghiaccio. Preparare il tampone di lisi dei nuclei aggiungendo digitonina per una concentrazione finale dello 0,01%, 10 mL per campione. Preparare il tampone di colorazione aggiungendo inibitori della RNasi al tampone di colorazione cellulare per una concentrazione finale di 0,2 U/μL, 20 mL per campione. Preparare DPBS 0,04% BSA aggiungendo inibitori della RNasi per una concentrazione finale di 0,2 U/μL, 2 mL per campione. Preparare 1 mL di tampone nuclei diluiti secondo il protocollo Multiome25. Conservare tutti i reagenti e i campioni sul ghiaccio. Dissezione tissutaleSacrificare i topi utilizzando protocolli approvati dall’istituzione. In questo protocollo, i topi sono stati decapitati dopo un’overdose di ketamina/xilazina. Taglia la testa del topo con le forbici e rimuovi il cervello dal cranio come descritto in Meyerhoff et al.26. Trasferire immediatamente il cervello in una capsula di Petri preparata con il DPBS ghiacciato 1x sotto uno stereomicroscopio illuminato a diodo emettitore di luce (LED). Tagliare il tessuto cerebrale con un bisturi per separare le aree cerebrali di interesse (ad esempio, corteccia entorinale, ippocampo, corteccia prefrontale) e trasferire ciascuna regione in una capsula di Petri separata contenente 1x DPBS ghiacciato. Tieniti sul ghiaccio. Con un bisturi, tritare il tessuto in pezzi di <0,5 cm per facilitare l'omogeneizzazione nella fase successiva. Con una micropipetta P1000, trasferire il tessuto tritato e il DPBS 1x dalla piastra di Petri a una provetta da 1,5 mL. Assicurati di utilizzare provette in plastica a basso legame proteico. Lasciare che i pezzi di tessuto si separino per gravità. Rimuovere con cautela l’eccesso di 1x DPBS utilizzando una micropipetta P1000.NOTA: Dopo questo passaggio, è possibile congelare a scatto il tessuto macinato trasferendo le provette a basso legame proteico nel ghiaccio secco e quindi conservandole a -80 °C fino a quando non si procede con l’isolamento dei nuclei. Isolamento dei nucleiRiempire la bomba di vetro con 2 ml di tampone di lisi dei nuclei ghiacciato con lo 0,01% di digitonina. Aggiungere i pezzi di fazzoletto nella dounce.NOTA: se si lavora con tessuto fresco-congelato, aggiungere il tessuto congelato tritato direttamente al tampone di lisi dei nuclei 0,01% digitonina; Non lasciare che il tessuto si scongeli prima. Omogeneizzare con un omogeneizzatore di carta di vetro 25 volte con il pestello A e poi 25 volte con il pestello B. Trasferire l’omogenato in una provetta da 15 ml. Aggiungere altri 2 mL di tampone di lisi dei nuclei ghiacciati con lo 0,01% di digitonina e incubare su ghiaccio per 5 minuti. Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante con una micropipetta e aggiungere 4 mL di tampone di lisi dei nuclei ghiacciati con lo 0,01% di digitonina. Incubare su ghiaccio per 5 minuti e filtrare attraverso un colino cellulare da 40 μm. Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante con una micropipetta. Aggiungere 4 mL di tampone colorante per lavare i nuclei e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante con una micropipetta e risospendere il pellet in 4 mL di tampone colorante. Filtrare attraverso un colino cellulare da 40 μm e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere in 1 mL di PBS con BSA allo 0,04%. Contare i nuclei per garantire l’uniformità della preparazione dei tessuti/nuclei su campioni diversi. Ci si aspetta di ottenere conteggi di nuclei simili dalle stesse regioni cerebrali:Aggiungere 10 μL di blu tripano allo 0,4% in una provetta vuota da 0,5 mL. Aggiungere 10 μL di nuclei e miscelare 5 volte mediante pipettaggio. Conta i nuclei utilizzando un contatore di cellule automatizzato seguendo le raccomandazioni del fornitore. Tenere i nuclei sul ghiaccio. Preparare i nuclei per l’ordinamento.NOTA: I nuclei estratti incorporano 7-AAD e questa colorazione viene utilizzata per la loro purificazione mediante selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS).Trasferire 100 μL di nuclei in una provetta FACS per il controllo non colorato. Aggiungere 10 μL di 7-AAD ai nuclei rimanenti e mantenere 5 minuti a 4 °C. Ordinare un minimo di 0,5 x 106 nuclei con FACS per eliminare doppiette e detriti. Smistamento dei nuclei mediante FACSNOTA: Sebbene lo smistamento dei nuclei possa essere eseguito su un’ampia varietà di selezionatori cellulari, la procedura per l’utilizzo degli strumenti BD FACSAria Fusion o BD FACSAria III è descritta qui. Si consiglia vivamente di eseguire la calibrazione e la configurazione del selezionatore di celle sotto la supervisione o da un utente esperto dello strumento. Per ridurre i tempi di elaborazione del campione, è fondamentale avere il selezionatore pronto non appena viene preparata la sospensione dei singoli nuclei.Taratura dello strumento FACSAccendere il selezionatore di celle e il computer. Una volta collegato il software allo strumento, avviare la procedura di avvio fluidico. Selezionare Citometro > Avvio fluidico nel menu principale e seguire i quattro passaggi. Fai clic su Fine dopo averli completati. Inserire l’ugello da 70 μm, accendere il getto e lasciare stabilizzare il getto per 15 minuti. Regola l’ampiezza per ottenere la formazione della goccia e fai clic su Sweet Spot. Posizionare il filtro a densità neutra (N.D) 1.0 e aprire l’interfaccia di configurazione e tracciamento del citometro (CST). Controllo qualità giornaliero: Diluire le perle CST in un terreno FACS (vedere le raccomandazioni del fornitore) ed eseguire il controllo CST. Una volta completato, sostituire l’N.D 1.0 con l’N.D 2.0. Diluire Accudrops nel terreno FACS (vedere le raccomandazioni del fornitore) ed eseguire il ritardo di caduta come descritto nei passaggi da 6 a 10. Nel modello di esperimento, selezionare l’esperimento Accudrop Drop Delay e aprire il layout di ordinamento per la provetta. All’interno della finestra inferiore della telecamera, fare clic su Tensione e poi su Filtro ottico per abilitare l’applicazione della carica sulle piastre di deflessione e l’utilizzo di un filtro ottico specifico davanti alla telecamera. Assicurarsi che il quadrante sul lato destro indichi 100. Se necessario, regolare la vite del laser rosso per ottimizzare l’impatto del laser. Regolare la portata per raggiungere la velocità da 1.000 a 3.000 eventi al secondo. Fare clic su Ordina e annulla. Assicurarsi che il quadrante sinistro sia uguale a 100 e che il quadrante destro sia 0. Se il quadrante sinistro è inferiore a 95, eseguire Ritardo automatico. Fare clic su Tensione, quindi su Ordinamento test. Controllare la qualità del deposito dei flussi laterali nelle provette di raccolta. Se necessario, regolare la posizione dei flussi laterali spostando i cursori. Messa a punto dello strumento FACS per lo smistamento dei nuclei.Avviare l’acquisizione dei nuclei non colorati. Questi vengono utilizzati per definire le dispersioni dirette e laterali e la tensione del rivelatore per il parametro 7-ADD. Impostare i parametri in modo che il segnale 7-AAD del campione non colorato rientri nella prima decade della scala logaritmica sul grafico a punti. Iniziare ad acquisire la provetta di nuclei colorati con 7-AAD e definire le popolazioni di nuclei utilizzando una strategia di gating basata su (1) FSC-A/SCC-A e poi FSC-H/SSC-H per dimensioni e granularità, (2) FSC-H/FSC-A per la discriminazione dei doppietti e (3) SSC-A/7-AAD per nuclei positivi con 7-AAD (vedere Figura 2A). Assicurarsi che il flusso e la deflessione siano stabili. Nella telecamera a flusso laterale, accendere l’ordinamento del test, la tensione ON e confermare l’accurato smistamento delle gocce in una provetta da 1,5 mL montata sul lato sinistro. Nella finestra Layout di ordinamento , selezionare la popolazione di interesse, come definito nel passaggio 2 (sopra). In Eventi target, selezionare la soglia in Continuo per ottenere un minimo di 0,5 x 106 nuclei per campione. In Precisione (Precision), selezionate Purezza a 4 vie. Una volta pronto, fare clic su Ordina e OK per iniziare con l’ordinamento dei nuclei. Controllo qualità e conteggio dei nuclei purificatiNOTA: Questo passaggio deve essere eseguito solo durante l’esperimento pilota per l’ottimizzazione delle fasi di preparazione del campione, con l’obiettivo di testare la purezza dei nuclei ordinati che devono essere caricati sul chip di cromo 10X. Una volta che il protocollo è completamente ottimizzato, non è consigliabile eseguire questa fase di controllo di qualità negli esperimenti di follow-up per evitare inutili sprechi di nuclei raccolti che potrebbero essere disponibili in numero ridotto.Controllo della purezza mediante citometria a flussoTrasferire 10 μL dei nuclei selezionati in una nuova provetta FACS contenente 90 μL di DPBS con il 2% di siero fetale bovino inattivato dal calore (HI-FBS). Acquisire e registrare i dati post-smistamento per verificare la purezza e la fattibilità dello smistamento. Assicurarsi che almeno il 98% dei nuclei appaia nella porta di interesse, come definito al punto 4.2 (vedere la Figura 2B). Conteggio dei nuclei purificatiCentrifugare i nuclei selezionati per 5 minuti a 500 x g e a 4 °C e rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una micropipetta. Risospendere in 100 μL di tampone nuclei diluiti. Aggiungere 10 μL di blu tripano allo 0,4% in una provetta vuota da 0,5 mL. Aggiungere 10 μL dei nuclei selezionati e miscelare 5 volte mediante pipettaggio. Conta i nuclei utilizzando un contatore di cellule automatizzato seguendo le raccomandazioni del fornitore. Regolare la concentrazione di nuclei a 3,5 x 106/mL, ovvero 16.000 nuclei per 5 μL. Controllo di qualità dei nuclei purificati mediante microscopiaNOTA: Questo passaggio deve essere eseguito solo durante l’esperimento pilota per l’ottimizzazione delle fasi di preparazione del campione per testare la qualità dei nuclei che devono essere caricati sul chip di cromo 10X. Una volta che il protocollo è completamente ottimizzato, non è consigliabile eseguire questa fase di controllo di qualità negli esperimenti di follow-up per evitare inutili sprechi di nuclei raccolti che potrebbero essere disponibili in numero ridotto.Assicurarsi che i vetrini per microscopio e i vetrini coprioggetto siano puliti e privi di polvere. Se necessario, lavare e risciacquare i vetrini coprioggetti con etanolo assoluto e asciugarli con salviette prive di lanugine. Distribuire 25 μL di poli-l-lisina nei pozzetti dei vetrini che verranno utilizzati e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (RT), al riparo dalla polvere. Rimuovere la poli-l-lisina in eccesso e aggiungere 10 μL della sospensione di nuclei purificati. Incubare per 5 minuti a RT, al riparo dalla polvere. Aggiungere una goccia di terreno di montaggio a ciascun pozzetto, evitando la formazione di bolle. Posiziona un vetrino coprioggetti sopra i pozzetti seminati. Coprire con salviette di carta e premere con decisione il vetrino coprioggetto per rimuovere il mezzo di montaggio in eccesso. Fare attenzione a non spostare il vetrino coprioggetti e non pulire il mezzo di montaggio in eccesso. Scatta diverse immagini con un microscopio invertito con luce in campo chiaro e un ingrandimento minimo di 40x. Eseguire il test del multioma.Passare immediatamente alla Guida per l’utente di Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression (CG000338 – Rev F)25. 2. Purificazione di nuclei da cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo di topo (HSPCs) NOTA Questo protocollo descrive la purificazione dei nuclei di tre sottogruppi delle HSPC del midollo osseo: lignaggio-c-Kit+Sca-1+ cellule staminali ematopoietiche (HSC), lignaggio-c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR- progenitori mieloidi comuni (CMP) e lignaggio- c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR+ progenitori granulociti-monociti (GMP). Indossare sempre guanti in lattice o nitrile durante la procedura. Questo protocollo è un adattamento del 10X Genomics Demonstration Protocol – Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 – Rev C)27. Sono state introdotte modifiche al protocollo originale per massimizzare il recupero dei nuclei. Si consiglia vivamente di avere due persone che eseguono l’esperimento, per avere i passaggi 1. fino a 3. (cioè la preparazione della soluzione unicellulare) eseguita da una persona e la fase 4 (cioè la preparazione del selezionatore) eseguita in parallelo da un’altra persona. Poiché il protocollo è altamente sensibile al fattore tempo, è fondamentale ridurre al minimo il tempo di elaborazione del campione tenendo il selezionatore pronto non appena viene preparata la sospensione a cellula singola. Preparazione di reagenti e materialiRiempi un secchio di ghiaccio. Preparare il tampone FACS: DPBS con soluzione HI-FBS al 2% (circa 500 mL per 6 campioni) e filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm. Preparare il terreno di raccolta: DPBS con soluzione HI-FBS al 10% (500 μL per campione) e filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm. Isolamento di cellule del midollo osseoSacrificare i topi utilizzando protocolli approvati dall’istituzione. In questo esperimento, i topi sono stati sacrificati per lussazione cervicale dopo un’overdose di ketamina/xilazina. Spruzzare l’addome e le zampe posteriori dei topi con etanolo al 70%. Utilizzare una pinza sterile e delle forbici per praticare una piccola incisione al centro del basso addome e aprire il peritoneo dalla base delle zampe posteriori al diaframma (Figura supplementare 1). Fai un taglio aggiuntivo per ciascuna zampa posteriore perpendicolare al peritoneo aperto, quindi afferra entrambi i lati di uno di questi tagli aggiuntivi e separalo per staccare la pelle da entrambe le zampe posteriori oltre l’articolazione della caviglia per esporre i muscoli di entrambe le zampe posteriori (Figura supplementare 1A). Allineare le forbici lungo la colonna vertebrale in corrispondenza dell’articolazione dell’anca di una zampa posteriore per tagliare la gamba senza tagliare il femore (Figura supplementare 1B, C). Ripeti lo stesso per l’altra gamba. Per isolare il femore, tagliare la maggior parte del tessuto muscolare, quindi tenere il femore e la tibia in ciascuna mano con la punta delle dita all’articolazione (Figura supplementare 1D, E). Piegare delicatamente la gamba contro la piega naturale per dislocare la tibia dal femore (Figura supplementare 1E) e poi tagliare con cura il tessuto connettivo con le forbici per separare il femore e la tibia. Utilizzare le forbici con leggeri movimenti di torsione per dislocare la punta della spina dorsale dall’estremità superiore del femore (Figura supplementare 1E). Pulire il femore isolato con carta velina per rimuovere il muscolo e il tessuto connettivo rimanenti. Conservare freddo su ghiaccio in una piastra da 12 pozzetti ben riempita con 2 ml di DMEM (1x) + GlutaMAX-I. Una volta raccolti tutti i femori, assicurarsi che i tessuti muscolari e fibrosi siano completamente rimossi dall’osso. Non tagliare l’osso per (a) mantenere sterile il midollo all’interno e (b) evitare di perdere cellule nel pozzetto. Utilizzare i seguenti passaggi per risciacquare le cellule da due femori di un topo, adattati da Haag e Murthy28. Preparare una provetta da 1,5 mL e una da 0,5 mL. Aggiungere 150 μL del tampone FACS alla provetta da 1,5 mL, quindi praticare un foro sul fondo della provetta da 0,5 mL utilizzando un ago da 18 G e inserire la provetta da 0,5 mL nella provetta da 1,5 mL. Aprire la parte distale di ciascun femore utilizzando le forbici chirurgiche di topo (Figura supplementare 1F): bloccare l’epifisi distale tra le lame e applicare una leggera pressione mentre si girano le forbici per staccare dolcemente l’epifisi distale senza tagliare bruscamente l’osso. In caso di esito positivo, dovrebbero essere visibili 4 sporgenze all’estremità della fisi ora esposta (Figura supplementare 1G). Inserire i due femori con l’estremità aperta rivolta verso il basso nella provetta preparata da 0,5 mL posta all’interno di una provetta da 1,5 mL contenente tampone FACS (Figura supplementare 1H). Posizionare un colino cellulare da 70 μm su una provetta da 50 mL e pre-bagnare il filtro con 2 mL di tampone FACS. Per lavare il midollo osseo, centrifugare le provette (tappi aperti) a 12.000 x g fino a quando la centrifuga raggiunge il valore di 12.000 x g , quindi arrestare immediatamente la centrifuga. Verificare che le cellule del midollo osseo siano pellettate nella provetta da 1,5 mL e che i femori siano bianchi (prima del lavaggio cellulare, sono rossi) (Figura supplementare 1I). Scartare le provette da 0,5 mL con i 2 femori. Eliminare il surnatante da 150 μL utilizzando una pipetta. Risospendere il pellet con una micropipetta in 1 mL di tampone lisante ammonio-cloruro-potassio (ACK) per 1-2 minuti a RT per lisare i globuli rossi. Evitare tempi di incubazione più lunghi in quanto potrebbero comportare una ridotta vitalità delle cellule nucleate. Trasferire nella provetta da 50 mL attraverso il filtro per celle da 70 μm pre-bagnato. Aggiungere 10 mL di tampone FACS per diluire il tampone lisante ACK e quindi interrompere la lisi. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere in 10 mL di tampone FACS risospendendo prima in 1 mL e poi rabboccando con 9 mL. Preparare le celle per il conteggio come descritto al punto 1.3.8. Conta le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato seguendo le raccomandazioni del fornitore. Si prevede che raccoglierà circa 40 milioni di cellule da 2 femori. Colorazione del midollo osseo HSPCCentrifugare le cellule a 400 x g per 5 minuti a 4 °C e risospendere il pellet con una micropipetta in tampone FACS fino a una concentrazione finale di 1 x 107 cellule/mL. Con una micropipetta P1000, trasferire la sospensione in una provetta FACS, filtrando attraverso un tappo di filtro cellulare da 35 μm. Preparare campioni in provetta a colorante singolo per ciascun anticorpo elencato nella Tabella 1 per impostare i compensatori di fluorocromi sul selezionatore cellulare:Preparare una provetta FACS per anticorpo e riempire le provette con 200 μL di PBS. Aggiungere 15 μL di microsfere di compensazione del fluorocromo in ciascuna provetta FACS di anticorpo coniugato con fluorocromo. Nelle provette FACS per le cellule non colorate e per le singole cellule colorate vive/morte, aggiungere 500.000 cellule invece delle perline. Aggiungere 1 μL di ciascun anticorpo coniugato con fluorocromo (vedere Tabella 1) nella provetta FACS corrispondente. Aggiungere 0,5 μL di colorante vivo/morto nella provetta FACS di colorante singolo vivo/morto. Tenere sul ghiaccio per 15 minuti al riparo dalla luce. Preparare le Miscele 1 e 2 come indicato nella Tabella 2.NOTA: I volumi di anticorpi indicati nella Tabella 2 sono validi per gli anticorpi a cui si fa riferimento nella Tabella dei materiali. Devono essere ottimizzati per qualsiasi nuovo riferimento di anticorpi o per un lotto diverso dello stesso riferimento di anticorpi. Aggiungere 300 μL di Mix 1 nella provetta, risospendere e conservare per 15 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce. Aggiungere 300 μL di Mix 2 nella provetta del campione, risospendere e conservare per 20 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce. Aggiungere 3 mL di tampone FACS alle provette monocolorate e alle provette colorate con miscela. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4°C. Scartare con cautela il surnatante utilizzando una micropipetta e risospendere il pellet in 500 μL del tampone FACS. Preparare una provetta da 1,5 mL preriempita con 500 μL di terreno di raccolta.NOTA: La miscela 1 è preparata in DPBS poiché contiene la macchia Live/Dead significativamente influenzata da HI-FBS. Una volta che le cellule sono state colorate da Vivo/Morto, viene aggiunta la Miscela 2, che contiene gli anticorpi coniugati al fluorocromo risospesi in tampone FACS contenente HI-FBS. L’unica eccezione è l’anticorpo anti-CD16/32 che è incluso in Antibody Mix 1 per fungere da bloccante del recettore Fc che impedisce il legame non specifico degli altri anticorpi aggiunti nel passaggio successivo. Smistamento delle cellule con un FACSNOTA: Sebbene il selezionatore cellulare possa essere eseguito su un’ampia varietà di selezionatori cellulari, qui viene descritta la procedura per l’utilizzo degli strumenti BD FACSAria Fusion o BD FACSAria III. Si consiglia vivamente di eseguire la calibrazione e la configurazione del selezionatore di celle sotto supervisione o da un utente esperto dello strumento.Calibrazione dello strumento FACS: Fare riferimento al passaggio 4.1 del Protocollo 1. Messa a punto dello strumento FACS per la selezione delle cellule:Avviare l’acquisizione delle cellule non colorate. Questi vengono utilizzati per definire le dispersioni dirette e laterali e la tensione del rivelatore per ciascun fluoroforo. Impostare i parametri in modo che il segnale fluorescente di ciascun fluoroforo rientri nella prima decade della scala logaritmica sul grafico a punti. Acquisisci controlli a colore singolo per impostare le compensazioni manualmente (la mediana delle popolazioni positive e negative deve essere allineata) o utilizza il software di calcolo automatico (misurazioni della pendenza). Assicurarsi che i controlli di compensazione corrispondano alle impostazioni sperimentali dei fluorocromi e del rivelatore. Registra 10.000 eventi per le celle e 5.000 eventi per le perline. Utilizzare la provetta del campione (cioè le cellule multi-colorate) per definire le popolazioni cellulari di interesse utilizzando la strategia di gating mostrata nella Figura 3A. Segui i passaggi da 4 a 6 (di seguito). Per identificare le tre HSPC del midollo osseo di interesse (HSC, CMP e GMP), iniziare il gating utilizzando la dimensione (FSC-A) e la granularità (SSC-A) per il gate sui leucociti, quindi FSC-H/FSC-A per discriminare i doppietti. Basato su SSC-A/marcatore a cellule morte, cellule vive gate. Utilizzare Lineage/c-Kit per selezionare le cellule che sono negative al lignaggio ed esprimono livelli intermedi o alti di c-Kit. Attraverso c-Kit/Sca-1, gate sulle HSC di lineage-c-Kit+ Sca-1+ (LKS+), una delle tre popolazioni di interesse. Tra i progenitori mieloidi (lignaggio-c-Kit+Sca-1-), utilizzare FcγR/CD34 per escludere i progenitori megacariocitari ed eritroidi CD34-FcγR- e gli eritroidi (MEP), includendo CD34+ FcγR- CMP, così come CD34+FcγR+ GMP nelle popolazioni cellulari da selezionare. Assicurarsi che il flusso e la deflessione siano stabili. Nella telecamera sidestream, accendere il selezionatore di prova, accendere la tensione e confermare l’accurato smistamento delle gocce in una provetta da 1,5 mL montata sul lato sinistro. Nella finestra Layout di ordinamento , selezionare le popolazioni di interesse (ad esempio, “LKS+” e “Progenitori mieloidi CD34+ ” mostrati in questo esempio). In Dispositivo, seleziona 2 tubi. In Precisione selezionare Purezza. In Eventi di destinazione, selezionare Continuo per ordinare tra 160.000 e 200.000 progenitori mieloidi LKS+ e CD34+ . Aggiungere 500 μL di tampone FACS alla sospensione cellulare e trasferire 1 mL del campione filtrando in una nuova provetta FACS da 35 μm per garantire che tutte le cellule siano in un’unica sospensione appena prima dell’acquisizione. In questo modo si eliminano i grumi di cellule che potrebbero intasare lo strumento. Una volta pronto, fai clic su Ordina e OK per avviare l’ordinamento. Regolare la portata per mantenere la velocità al di sotto di 10.000 eventi al secondo.NOTA: Il rapporto atteso tra i progenitori mieloidi LKS+ e CD34+ è di 1:3 per un topo femmina adulto (8-12 settimane) C57BL/6J allo stato stazionario. I numeri di cellule ordinati mirati vengono solitamente raggiunti entro 30 minuti dall’ordinamento. Controllo qualità e conteggio delle cellule selezionateNOTA: Questa fase deve essere eseguita solo durante l’esperimento pilota per l’ottimizzazione delle fasi di preparazione del campione, con l’obiettivo di testare la purezza delle cellule selezionate che devono essere utilizzate per l’isolamento dei nuclei. Una volta che il protocollo è completamente ottimizzato, non è consigliabile eseguire questa fase di controllo di qualità negli esperimenti di follow-up per evitare inutili sprechi di materiale di partenza che potrebbe essere disponibile in piccole quantità per l’isolamento dei nuclei.Controllo della purezza mediante citometria a flussoTrasferire 10 μL delle cellule selezionate in una nuova provetta FACS contenente 90 μL di tampone FACS. Acquisire e registrare i dati post-smistamento per verificare la purezza e la fattibilità dello smistamento. Assicurarsi che almeno il 95% delle celle appaia nel gate di interesse, come definito in 3 – 6 e illustrato nella Figura 3B. Isolamento di nuclei da HSPC di midollo osseo selezionatiUtilizzare il protocollo “Low Cell Input Nuclei Isolation” dell’Appendice del 10X Genomics Demonstration Protocol – Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 – Rev C)27, con le seguenti modifiche apportate per ottimizzare il recupero dei nuclei:Tempo di lisi: eseguire un esperimento pilota per questo protocollo per identificare il miglior tempo di lisi per l’isolamento dei nuclei. Assicurarsi di ottenere una lisi cellulare completa mantenendo intatti i nuclei.NOTA: La fase f del protocollo 10X Genomics27 sopra menzionato indica di “incubare [nel tampone di lisi] per 3-5 minuti sul ghiaccio”. Durante l’esperimento pilota, eseguire il test per almeno 3 minuti, 4 minuti e 5 minuti e valutare la quantità di nuclei recuperati contando e la qualità mediante citometria a flusso e imaging al microscopio per scegliere la durata ottimale della lisi (vedere la descrizione di questi controlli di qualità di seguito). Per risparmiare i reagenti, sostituire il tampone dei nuclei diluiti con PBS 0,04% BSA nell’esperimento pilota. Per le HSPC del midollo osseo, 3 minuti sono stati identificati come la durata ottimale della lisi. Centrifugazioni cellulari: Per tutte le centrifugazioni in sospensione cellulare, centrifugare a 300 x g per 7 min (invece dei 5 min in CG000365 – Rev C)27 a 4 °C. Centrifugazione dei nuclei: Eseguire tutte le centrifugazioni in sospensione di nuclei a 500 x g per 5 min come da CG000365 – Rev C27. Raccolta dei nuclei: nella fase b, dopo aver risospeso in 50 μL di PBS 0,04% BSA e trasferito in una provetta da 0,2 mL, aggiungere 50 μL di PBS 0,04% BSA alla provetta originale e alla pipetta miscelare per raccogliere eventuali cellule rimanenti. Trasferire nella provetta da 0,2 mL per raggiungere un volume totale di 100 μL. D’ora in poi, il volume totale sarà di 100 μL invece dei 50 μL del protocollo. Regolare di conseguenza le fasi a valle (ad esempio, per la fase d, rimuovere 90 μL invece di 45 μL; per la fase e, aggiungere 90 μL di tampone di lisi invece di 45 μL). Per la fase m, risospendere il pellet di nuclei in 12 μL di tampone di nuclei diluiti invece di 7 μL. Contare i nuclei isolati. In una provetta vuota da 0,5 mL, aggiungere 10 μL di blu di tripano allo 0,4% e 8 μL di PBS 0,04% BSA. Aggiungere 2 μL di nuclei alla provetta e contare i nuclei come descritto al punto 1.3.8. Utilizzare un contatore di cellule automatizzato seguendo le raccomandazioni del fornitore. Controllo della purezza mediante citometria a flussoNOTA: Questo passaggio deve essere eseguito solo durante l’esperimento pilota per l’ottimizzazione delle fasi di preparazione del campione per testare la purezza dei nuclei che devono essere caricati sul chip di cromo 10X. Una volta che il protocollo è completamente ottimizzato, non è consigliabile eseguire questa fase di controllo di qualità negli esperimenti di follow-up per evitare inutili sprechi di nuclei raccolti che potrebbero essere disponibili in numero ridotto.Dopo aver completato l’isolamento dei nuclei, trasferire 6 μL di risospensione dei nuclei in una nuova provetta FACS preriempita con 150 μL di tampone FACS. Aggiungere 3 μL di 7-AAD e incubare per 5 minuti su ghiaccio. Acquisire e registrare i dati post-smistamento per verificare la purezza e la fattibilità dello smistamento. Assicurarsi che almeno il 95% dei nuclei appaia nel gate di interesse, come definito nel passaggio 4.2 del Protocollo 1 (vedere la Figura 4). Controllo di qualità dei nuclei purificati mediante microscopia:NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito solo durante l’esperimento pilota per l’ottimizzazione delle fasi di preparazione del campione per testare la qualità dei nuclei che devono essere caricati sul chip 10X Chromium. Una volta che il protocollo è completamente ottimizzato, non è consigliabile eseguire questa fase di controllo di qualità negli esperimenti di follow-up per evitare inutili sprechi di nuclei raccolti che potrebbero essere disponibili in numero ridotto.Procedere come descritto al punto 1.5.3. Eseguire il test del multiomaPassare immediatamente alla Guida per l’utente di Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression (CG000338 – Rev F)25.