Summary

Modelagem Inicial de Nicho Neurovascular Organoide Cerebral Humano Não Guiado na Membrana Corioalantóide Permissiva do Embrião de Pinto

Published: February 16, 2024
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para enxertar organoides cerebrais humanos em múltiplos estágios de maturação na membrana corioalantóide (CAM) de pintinhos. Os organoides cerebrais foram cultivados seguindo protocolos padronizados não guiados.

Abstract

A enxertia de organoides em tecidos vascularizados em animais modelo, como a membrana corioalantóide (CAM) imunodeficiente de camundongos ou embriões de pintinhos, tem se mostrado eficiente para a modelagem da neovascularização. A CAM é uma membrana extraembrionária ricamente vascularizada, que apresenta imunorreatividade limitada, tornando-se um excelente modelo hospedeiro para transplantes de células de origem humana.

Este trabalho descreve a estratégia para enxertar organoides cerebrais humanos diferenciados em múltiplos estágios de maturação no MAC. A composição celular dos organoides cerebrais muda com o tempo, refletindo os marcos do desenvolvimento do cérebro humano. Nós enxertamos organoides cerebrais em estágios de maturação relevantes: expansão neuroepitelial (18 DIV), neurogênese precoce (60 DIV) e gliogênese precoce (180 DIV) na CAM de embriões embrionários dia (E)7 de galinha. Organoides cerebrais enxertados foram colhidos 5 dias depois e suas características histológicas foram analisadas.

Não foram detectados sinais histológicos de neovascularização nos organoides enxertados ou vasos sanguíneos anormais adjacentes aos enxertos. Além disso, mudanças marcantes foram observadas na composição celular dos organoides enxertados, a saber, um aumento no número de astrócitos gliais fibrilares ácidos-positivos-reativos. Entretanto, as alterações citoarquiteturais foram dependentes do estágio de maturação dos organoides. Em conjunto, esses resultados sugerem que organoides cerebrais podem crescer no MAC e mostram diferenças na citoarquitetura dependendo do estágio de maturação na enxertia.

Introduction

Os organoides cerebrais humanos são uma técnica emergente que nos permite recapitular in vitro o desenvolvimento inicial do cérebro humano 1,2,3. No entanto, uma das principais limitações desse modelo é a falta de vascularização, que desempenha papéis indispensáveis não só na homeostase cerebral, mas também no desenvolvimentocerebral4. Além da oferta de oxigênio e nutrientes, evidências acumuladas sugerem que o sistema vascular cerebral regula a diferenciação neural, migração e sinaptogênese durante o desenvolvimento 5,6. Portanto, há uma necessidade urgente de estabelecer modelos confiáveis que possam fornecer a sinalização e a estrutura vascular ausente aos organoides cerebrais, aumentando a complexidade da geração de organoides cerebrais humanos7.

Dentre os métodos de vascularização propostos, duas principais linhas de atuação podem ser consideradas: enxertia organoide em organismo vivo e tecnologias puramente in vitro co-cultivando células endoteliais e neurais8,9,10,11,12. O transplante intracerebral em camundongos é caro e demorado, tornando outras tecnologias relevantes para modelos mais simples. O ensaio de membrana corioalantóide (CAM) em pintinhos tem sido amplamente utilizado para estudar a angiogênese 13,14,15. Na última década, vários grupos enxertaram com sucesso diferentes tipos de organoides, incluindo organoidesrenais16,17, cardíacos18 e tumorais19,20, em CAMs. No entanto, pouco se sabe sobre a eficácia, toxicidade/rejeição, efeito fisiológico e métodos para enxertar organoides cerebrais humanos no CAM. Outro aspecto interessante e ainda inexplorado é a formação de uma barreira hematoencefálica quimérica (BHE) entre as MAC e a interface astrocitária organoide. Trabalhos pioneiros anteriores sugeriram a viabilidade putativa de gerar uma BBB na CAM por meio do transplante de astrócitos e meio condicionado por astrócitos 21,22,23. No entanto, astrócitos maduros parecem ser incapazes de atingir esseobjetivo 24,25. Assim, a formação induzida por astrócitos do BBB permanece discutível, e o transplante de organoides cerebrais humanos nos permitiria lançar luz sobre essa controvérsia.

Este artigo em vídeo descreve um protocolo para um transplante in ovo de organoides cerebrais humanos em CAM que promove crescimento, melhora e vascularização, resultando em organoides que englobam elementos BBB histologicamente compatíveis. Aqui, apresentamos um protocolo garantindo a sobrevivência do embrião de galinha e relatamos a permissividade da CAM para sustentar o crescimento organoide cerebral.

Protocol

Os embriões de galinha-de-leghorn (Gallus gallus) foram tratados seguindo o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals do Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, EUA, e os experimentos foram aprovados pelo Council for Care and Use of Experimental Animals da Universidade de Barcelona. 1. Preparação organoide cerebral não guiada Manter as células estaminais embrionárias humanas H9 (hESCs) e…

Representative Results

Seleção do cronograma de maturação do embrião para o transplanteO experimento inicia-se em D0, quando os ovos fertilizados são incubados a 38 °C e 60% de umidade relativa. A membrana corioalantóide (MAC) é uma membrana extraembrionária altamente vascularizada que se desenvolve após a incubação dos ovos. É formado pela fusão do alantois e córion. Em D1, após 24 h de incubação, a câmara de ar é puncionada para impedir que a CAM se fixe à membrana interna do invólucro. A punção …

Discussion

Neste estudo, descrevemos um protocolo detalhado com inúmeras etapas fundamentais que proporcionam crescimento e desenvolvimento favoráveis de organoides cerebrais humanos após a enxertia sem perturbar a sobrevivência dos embriões de galinha. Recomendamos o uso de agulhas estéreis para puncionar a câmara de ar do ovo após 24 h de incubação (dia 1). Além disso, também tentamos fazer a punção no 4º dia (após verificar a casca do ovo com luz para testar o desenvolvimento da vasculatura para ter certeza de qu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Alcántara e ao Dr. Ortega do UB e ao resto dos membros do laboratório do Dr. Acosta pelas discussões perspicazes. S.A. é professor assistente da Generalitat de Catalunya da Universitat de Barcelona.

Materials

Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse  BioLegend 801201 1:1,000
Anti-GFAP, rabbit GeneTex GTX108711 1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. Invitrogen A-21206 1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat Jackson ImmunoResearch 715-585-150 1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI Invitrogen D1306 1:10,000
DPX Sigma 100579 xylene-based mounting medium 
Gentle Dissociation Solution CreativeBiolabs ITS-0622-YT187 cell dissociation solution
Matrigel BD Biosciences 356234
Mowiol 4-88 mounting media Merk 81381
Paper towel, lab-grade Sigma-Aldrich Z188956
ROCK inhibitor Y27632 Millipore SCM075 10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors VWR 470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides Epredia J1800AMNZ

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Fiore, L., Arderiu, J., Martí-Sarrias, A., Turpín, I., Pareja, R. I., Navarro, A., Holubiec, M., Bianchelli, J., Falzone, T., Spelzini, G., Scicolone, G., Acosta, S. Early Unguided Human Brain Organoid Neurovascular Niche Modeling into the Permissive Chick Embryo Chorioallantoic Membrane. J. Vis. Exp. (204), e65710, doi:10.3791/65710 (2024).

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