النمذجة المبكرة غير الموجهة للدماغ البشري العضوي الوعائي العصبي في الغشاء المشيمي الجنيني المتساهل
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لإدخال عضويات الدماغ البشري في مراحل نضج متعددة في غشاء المشيمية المشيمية (CAM). نمت عضويات الدماغ باتباع بروتوكولات موحدة غير موجهة.
Abstract
أثبت إدخال المواد العضوية في الأنسجة الوعائية في النموذجية ، مثل غشاء الفأر أو جنين الفرخ المشيمي (CAM) ، فعاليته في نمذجة الأوعية الدموية الجديدة. الطب التكميلي والبديل هو غشاء خارج الجنين غني بالأوعية الدموية ، والذي يظهر تفاعلا مناعيا محدودا ، وبالتالي يصبح نموذجا ممتازا لاستضافة عمليات زرع الخلايا ذات الأصل البشري.
تصف هذه الورقة استراتيجية غرس عضويات الدماغ البشري المتمايزة في مراحل النضج المتعددة في CAM. يتغير التركيب الخلوي لعضويات الدماغ مع مرور الوقت ، مما يعكس معالم نمو الدماغ البشري. قمنا بتطعيم عضويات الدماغ في مراحل النضج ذات الصلة: التوسع العصبي الظهاري (18 DIV) ، وتكوين الخلايا العصبية المبكر (60 DIV) ، والتكون الدبقي المبكر (180 DIV) في الطب التكميلي والبديل لأجنة الدجاج الجنينية (E) 7. تم حصاد عضويات الدماغ المطعمة بعد 5 أيام وتم تحليل خصائصها النسيجية.
لم يتم الكشف عن أي علامات نسيجية للأوعية الدموية الجديدة في المواد العضوية المطعمة أو الأوعية الدموية غير الطبيعية المجاورة للطعوم. علاوة على ذلك ، لوحظت تغييرات ملحوظة في التركيب الخلوي للعضويات المطعمة ، أي زيادة في عدد الخلايا النجمية الحمضية الحمضية الليفية الدبقية. ومع ذلك ، كانت التغيرات المعمارية الخلوية تعتمد على مرحلة النضج العضوي. إجمالا ، تشير هذه النتائج إلى أن عضويات الدماغ يمكن أن تنمو في الطب التكميلي والبديل ، وتظهر اختلافات في البنية الخلوية اعتمادا على مرحلة نضجها عند التطعيم.
Introduction
عضويات الدماغ البشري هي تقنية ناشئة تسمح لنا بتلخيص التطور المبكر للدماغ البشري في المختبر1،2،3. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية لهذا النموذج هو نقص الأوعية الدموية ، والتي تلعب أدوارا لا غنى عنها ليس فقط في توازن الدماغ ولكن أيضا في نمو الدماغ4. بالإضافة إلى توصيل الأكسجين والمواد المغذية ، تشير الأدلة المتراكمة إلى أن نظام الأوعية الدموية في الدماغ ينظم التمايز العصبي والهجرة وتكوين المشابك أثناء التطور 5,6. لذلك ، هناك حاجة ملحة لإنشاء نماذج موثوقة يمكنها توفير إشارات الأوعية الدموية المفقودة وهيكلها لعضويات الدماغ ، مما يعزز تعقيد توليد الأعضاءفي الدماغ البشري 7.
من بين الطرق المقترحة للأوعية الدموية ، يمكن النظر في خطين رئيسيين: النقش العضوي في كائن حي والتقنيات المختبرية البحتة التي تشارك في زراعة الخلايا البطانية والخلايا العصبية8،9،10،11،12. يعد زرع داخل المخ في الفئران مكلفا ويستغرق وقتا طويلا ، مما يجعل التقنيات الأخرى ذات صلة بالنماذج الأبسط. تم استخدام فحص الغشاء المشيمي المشيمي (CAM) على نطاق واسع لدراسة تكوين الأوعية13،14،15. في العقد الماضي ، نجحت عدة مجموعات في دمج أنواع مختلفة من المواد العضوية ، بما في ذلك الكلى16,17 ، والقلب18 ، وعضويات الورم19,20 ، في الطب التكميلي والبديل. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن الفعالية والسمية / الرفض والتأثير الفسيولوجي وطرق إدخال عضويات الدماغ البشري في الطب التكميلي والمتنقل. جانب آخر مثير للاهتمام وغير مستكشف حتى الآن هو تشكيل حاجز دموي دماغي وهمي (BBB) بين CAM والواجهة النجمية العضوية. اقترح العمل الرائد السابق الجدوى المفترضة لتوليد BBB في الطب التكميلي والبديل عن طريق زرع الخلايا النجمية والوسط المكيف للخلايا النجمية21،22،23. ومع ذلك ، يبدو أن الخلايا النجمية الناضجة غير قادرة على تحقيق ذلك24,25. وبالتالي ، فإن التكوين الناجم عن الخلايا النجمية ل BBB لا يزال قابلا للنقاش ، وزرع عضويات الدماغ البشري سيسمح لنا بإلقاء الضوء على هذا الجدل.
تصف مقالة الفيديو هذه بروتوكولا لزرع الأعضاء في الدماغ البشري في البويضات في الطب التكميلي والبديل الذي يعزز النمو والتحسين والأوعية الدموية ، مما ينتج عنه عضويات تشمل عناصر BBB متوافقة نسيجيا. هنا ، نقدم بروتوكولا يضمن بقاء جنين الدجاج ونبلغ عن جواز الطب التكميلي والبديل للحفاظ على نمو الأعضاء في الدماغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، وصفنا بروتوكولا مفصلا يحتوي على العديد من الخطوات الرئيسية التي توفر نموا وتطورا إيجابيين لعضويات الدماغ البشري عند التطعيم دون الإخلال ببقاء أجنة الدجاج. أوصينا باستخدام الإبر المعقمة لثقب غرفة الهواء في البويضة بعد 24 ساعة من الحضانة (اليوم 1). بالإضافة إلى ذلك ، حاولنا أ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور الكانتارا والدكتور أورتيغا من UB وبقية الأعضاء في مختبر الدكتور أكوستا على المناقشات الثاقبة. SA هو أستاذ مساعد زميل سيرا هنتر من Generalitat de Catalunya في جامعة برشلونة.
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
References
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794 (2022).
- Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707 (2022).
- Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
- Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
- Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995 (2020).
- Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
- Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613 (2021).
- Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).
- Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
- Janzer, R. C. The blood-brain barrier: Cellular basis. J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).
- Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
- Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
- Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
- Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
- Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
- Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
- Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583 (2017).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).
