Modelado de nicho neurovascular de organoides cerebrales humanos tempranos no guiados en la membrana corioalantoidea permisiva del embrión de pollo
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para injertar organoides cerebrales humanos en múltiples etapas de maduración en la membrana corioalantoidea (CAM) del pollo. Los organoides cerebrales se cultivaron siguiendo protocolos estandarizados no guiados.
Abstract
El injerto de organoides en tejidos vascularizados en animales modelo, como la membrana corioalantoidea (CAM) inmunodeficiente de ratones o embriones de pollo, ha demostrado ser eficaz para el modelado de la neovascularización. La MCA es una membrana extraembrionaria ricamente vascularizada, que muestra una inmunorreactividad limitada, convirtiéndose así en un excelente modelo de hospedaje para trasplantes de células de origen humano.
En este trabajo se describe la estrategia para injertar organoides cerebrales humanos diferenciados en múltiples etapas de maduración en la CAM. La composición celular de los organoides cerebrales cambia con el tiempo, reflejando los hitos del desarrollo del cerebro humano. Injertamos organoides cerebrales en etapas de maduración relevantes: expansión neuroepitelial (18 DIV), neurogénesis temprana (60 DIV) y gliogénesis temprana (180 DIV) en la MCA de embriones embrionarios de pollo del día (E)7. Los organoides cerebrales injertados se recolectaron 5 días después y se analizaron sus características histológicas.
No se detectaron signos histológicos de neovascularización en los organoides injertados ni vasos sanguíneos anormales adyacentes a los injertos. Además, se observaron cambios notables en la composición celular de los organoides injertados, a saber, un aumento en el número de astrocitos gliales fibrilares ácidos positivos reactivos a proteínas. Sin embargo, los cambios citoarquitectónicos dependieron de la etapa de maduración de los organoides. En conjunto, estos resultados sugieren que los organoides cerebrales pueden crecer en la MCA y muestran diferencias en la citoarquitectura dependiendo de su etapa de maduración en el momento del injerto.
Introduction
Los organoides cerebrales humanos son una técnica emergente que permite recapitular in vitro el desarrollo temprano del cerebro humano 1,2,3. Sin embargo, una de las principales limitaciones de este modelo es la falta de vascularización, que desempeña un papel indispensable no solo en la homeostasis cerebral, sino también en el desarrollo cerebral4. Además del suministro de oxígeno y nutrientes, la evidencia acumulada sugiere que el sistema vascular del cerebro regula la diferenciación neuronal, la migración y la sinaptogénesis durante el desarrollo 5,6. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de establecer modelos confiables que puedan proporcionar la señalización vascular y la estructura faltantes a los organoides cerebrales, lo que aumenta la complejidad de la generación de organoides cerebrales humanos7.
Entre los métodos propuestos para la vascularización, se pueden considerar dos líneas principales: el injerto de organoides en un organismo vivo y las tecnologías puramente in vitro que cocultivan células endoteliales y células neurales 8,9,10,11,12. El trasplante intracerebral en ratones es costoso y requiere mucho tiempo, lo que hace que otras tecnologías sean relevantes para modelos más simples. El ensayo de membrana corioalantoidea de pollitos (CAM) se ha utilizado ampliamente para estudiar la angiogénesis 13,14,15. En la última década, varios grupos han injertado con éxito diferentes tipos de organoides, incluidos el riñón16,17, el cardíaco18 y los organoides tumorales19,20, en CAM. Sin embargo, se sabe poco sobre la eficacia, la toxicidad/rechazo, el efecto fisiológico y los métodos para injertar organoides cerebrales humanos en la MCA. Otro aspecto interesante y aún inexplorado es la formación de una barrera hematoencefálica quimérica (BHE) entre la MCA y la interfase astrocítica organoide. Trabajos pioneros previos sugirieron la viabilidad putativa de generar una BHE en la MCA mediante el trasplante de astrocitos y medio condicionado por astrocitos 21,22,23. Sin embargo, los astrocitos maduros parecen ser incapaces de lograrlo24,25. Por lo tanto, la formación de la BHE inducida por astrocitos sigue siendo discutible, y el trasplante de organoides cerebrales humanos nos permitiría arrojar luz sobre esta controversia.
Este artículo de video describe un protocolo para un trasplante in ovo de organoides cerebrales humanos en MCA que promueve el crecimiento, la mejora y la vascularización, lo que da como resultado organoides que abarcan elementos de BHE histológicamente compatibles. Aquí, presentamos un protocolo que garantiza la supervivencia del embrión de pollo e informamos sobre la permisividad de la MCA para mantener el crecimiento de organoides cerebrales.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, describimos un protocolo detallado con numerosos pasos clave que proporcionan un crecimiento y desarrollo favorable de los organoides del cerebro humano tras el injerto sin perturbar la supervivencia de los embriones de pollo. Se recomendó el uso de agujas estériles para perforar la cámara de aire del huevo después de 24 h de incubación (día 1). Además, también intentamos hacer la punción en el día 4 (después de revisar la cáscara del huevo con luz para probar el desarrollo de la vasculatura …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Alcántara y al Dr. Ortega de la UB y al resto de los miembros del laboratorio del Dr. Acosta por las esclarecedoras discusiones. S.A. es profesor ayudante doctor de la Generalitat de Catalunya en la Universitat de Barcelona.
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
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