Summary

罕见原代细胞的靶向代谢组学

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

在这里,我们提出了一种准确可靠地测量稀有细胞类型中代谢物的方案。技术改进,包括用于细胞分选的改良鞘液和相关空白样品的生成,能够对代谢物进行全面定量,每个样品的起始量仅为 5000 个细胞。

Abstract

细胞功能主要取决于新陈代谢,可以通过测量小分子中间体来研究潜在代谢网络的功能。然而,获得准确可靠的细胞代谢测量,特别是在造血干细胞等稀有细胞类型中,传统上需要混合来自多种动物的细胞。现在,一种方案使研究人员能够使用每个样本仅使用一只小鼠来测量稀有细胞类型中的代谢物,同时为更丰富的细胞类型生成多个重复。这减少了给定项目所需的动物数量。这里介绍的方案与传统的代谢组学方案相比有几个关键的区别,例如使用5 g / L NaCl作为鞘液,直接分类到乙腈中,以及利用靶向定量和严格使用内标,允许更准确和全面地测量细胞代谢。尽管分离单细胞、荧光染色和分选需要时间,但该方案可以在很大程度上保留细胞类型和药物处理之间的差异。

Introduction

新陈代谢是发生在所有活细胞中的基本生物过程。代谢过程涉及一个庞大的生化反应网络,这些反应受到严格调节和相互连接,使细胞能够产生能量并合成必需的生物分子1。为了了解代谢网络的功能,研究人员测量了细胞内小分子中间体的水平。这些中间体是代谢活动的重要指标,可以揭示对细胞功能的关键见解。

质谱 (MS) 是特异性检测复杂样品中代谢物的最常用选择 1,2。核磁共振(NMR)在化合物的绝对定量和结构解析方面具有优势,但MS通常可以分离复杂混合物(如生物流体或细胞提取物)中的更多组分。通常情况下,MS与通过毛细管电泳(CE)、气相色谱(GC)或液相色谱(LC)3对化合物的先前分离相结合。分离平台的选择主要取决于目标代谢物的范围和样品类型,在实际环境中,还取决于机器和专业知识的可用性。这三种分离平台都具有广泛且重叠的合适代谢物范围,但局限性不同。简而言之,CE 只能分离带电分子,需要大量的专业知识才能对大量样品进行稳健分析4.GC 仅限于小且无极性的分子,足以在分解前蒸发3.考虑到所有市售的液相色谱柱,该技术可以分离任何两种代谢物5。然而,许多液相色谱方法的分辨能力低于类似长度的 CE 或 GC 方法。

代谢组学测量的典型起始材料量通常为每个样品 5 x 105 至 5 x 107 个细胞、5-50 mg 湿组织或 5-50 μL 体液6。然而,在处理稀有细胞类型的原代细胞(例如造血干细胞 (HSC) 或循环肿瘤细胞)时,获得如此数量的起始材料可能具有挑战性。这些细胞通常以非常低的数量存在,并且不能在不损害关键细胞特征的情况下进行培养。

造血干细胞和多能祖细胞 (MPP) 是造血系统中分化程度最低的细胞,在生物体的整个生命周期中不断产生新的血细胞。造血的调节在白血病和贫血等疾病中具有临床意义。尽管它们很重要,但 HSC 和 MPP 是造血系统中最稀有的细胞之一。通常,从单只小鼠中可以分离出大约 5000 个 HSC 7,8,9。由于传统的代谢组学方法需要更多的输入材料,因此通常需要混合来自多只小鼠的细胞来分析稀有细胞类型10,11

在这里,我们旨在开发一种方案,能够测量每个样品中低至 5000 个细胞中的代谢物,以便能够从单只小鼠12 的 HSC 生成代谢组学数据。同时,这种方法允许从单个小鼠生成多个重复,以获得更丰富的细胞类型,如淋巴细胞。这种方法减少了给定项目所需的动物数量,从而有助于动物实验的“3R”(减少、替换、改进)。

细胞中的代谢物可以具有非常高的周转率,通常在秒级13.然而,制备用于荧光激活细胞分选 (FACS) 的样品可能需要数小时,而 FACS 分选本身可能需要几分钟到几小时,导致非生理条件导致代谢组的潜在改变。该方案中使用的一些试剂(如氯化铵钾[ACK]裂解缓冲液)可以具有类似的效果。这些条件会导致细胞应激并影响细胞内代谢物的水平和比率,导致细胞代谢测量不准确或有偏差 14,15,16。由于样品制备引起的代谢变化有时被称为分选伪影。从坚硬或坚韧的组织中生产单细胞悬浮液可能需要的长消化方案和刺激性试剂会加剧这个问题。可能发生的变化可能取决于细胞类型和处理条件。这些变化的确切性质仍然未知,因为无法测量活组织中未受干扰细胞的代谢状态。

与传统方法相比,这里介绍的方案涉及几个关键差异,即使用 5 g/L NaCl 作为鞘液,直接分选到提取缓冲液中,在亲水作用液相色谱-质谱 (HILIC-MS) 上进样大量样品,并利用靶向定量、严格使用内标和背景控制(图 1).该方案有可能在很大程度上保留细胞类型之间以及药物治疗和载体控制之间的差异12。即使对于培养的细胞,它也优于其他方法,例如更成熟的离心和手动去除上清液。但是,由于仍可能出现排序伪影,因此必须谨慎解释数据。尽管存在这种局限性,但该协议代表了代谢分析领域的重大改进,允许更准确和全面地测量稀有原代细胞的细胞代谢12

在罕见的原代细胞中稳健地测量广泛代谢谱的能力为涉及这些细胞的生物医学研究的新实验打开了大门。例如,造血干细胞中代谢介导的调节已被证明会影响休眠自我更新能力,对贫血和白血病有影响11,17。在患者来源的循环肿瘤细胞中,肿瘤和邻近细胞之间代谢基因表达的差异已显示18,19。该协议现在允许研究人员在代谢水平上系统地研究这些差异,这通常被认为比基因表达更接近细胞表型。

Protocol

根据地方当局(Regierungspräsidium Freiburg)的规定,用于该协议的所有小鼠的育种和饲养在马克斯·普朗克免疫生物学和表观遗传学研究所(MPI-IE)的常规动物设施中进行。FELASA B 训练有素的人员按照 MPI-IE 动物福利委员会和地方当局批准的指南和法规,用 CO2 和宫颈脱位对小鼠实施安乐死。没有进行动物实验,小鼠没有健康负担。 注:高灵敏度的分析方法,如本协议中?…

Representative Results

FACS分选能够从同一细胞悬液中分离出不同细胞类型的干净细胞群(图2 和 图3)。该方法的特异性依赖于使用特定表面标记物(例如,来自脾脏的 B 细胞和 T 细胞)或表面标记物的特定组合(例如 HSC 和 MPP)对不同细胞类型进行染色。细胞内标志物的染色通常需要细胞膜的透化。这可能导致代谢物的泄漏,因此这种类型的染色不适合用于该方案。 <p …

Discussion

使用该协议成功实施靶向代谢组学的最关键步骤是 1) 强大的染色和门控策略,将产生干净的细胞群 2) 精确处理液体体积,3) 所有实验步骤的可重复时间,特别是代谢物提取之前的所有步骤。理想情况下,属于一个实验的所有样品都应在一个批次中进行处理和测量,以尽量减少批次效应22。对于较大的实验,我们建议在-80°C下收集细胞提取物,然后在一个批次中测量所有提取…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者要感谢马克斯·普朗克免疫生物学和表观遗传学研究所的动物设施提供本研究中使用的动物。

Materials

13C yeast extract Isotopic Solutions ISO-1
40 µm cell strainer Corning 352340
Acetonitrile, LC-MS grade VWR 83640.32
ACK lysis buffer Gibco 104921 Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP) Sigma Aldrich A2754
Adenosine monophosphate (AMP) Sigma Aldrich A1752
Adenosine triphosphate (ATP) Sigma Aldrich A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade Fisher Scientific A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) Waters 186009982
B220-A647 Invitrogen 103226
B220-PE/Cy7 BioLegend 103222 RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7 BioLegend 101216 RRID:AB_312799
CD150-BV605 BioLegend 115927 RRID:AB_11204248
CD3-PE Invitrogen 12-0031-83
CD48-BV421 BioLegend 103428 RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7 BioLegend 100422 RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7 BioLegend 100722 RRID:AB_312761
cKit-PE BioLegend 105808 RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit  Invitrogen 11415D
FACSAria III BD
Gr1-PE/Cy7 BioLegend 108416 RRID:AB_313381
Heat sealing foil Neolab Jul-18
Isoleucine Sigma Aldrich 58880
JetStream ESI Source Agilent G1958B
Leucine Sigma Aldrich L8000
Medronic acid Sigma Aldrich M9508-1G
Methanol, LC-MS grade Carl Roth HN41.2
NaCl Fluka 31434-1KG
PBS Sigma Aldrich D8537
Sca1-APC/Cy7 BioLegend 108126 RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7 BioLegend 116221 RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer Agilent 6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted Eppendorf 30129512
UHPLC Autosampler Agilent G7157B
UHPLC Column Thermostat Agilent G7116B
UHPLC Pump Agilent G7120A
UHPLC Sample Thermostat Agilent G4761A

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Glaser, K. M., Egg, M., Hobitz, S., Mitterer, M., Schain-Zota, D., Schönberger, K., Schuldes, K., Cabezas-Wallscheid, N., Lämmermann, T., Rambold, A., Buescher, J. M. Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells. J. Vis. Exp. (204), e65690, doi:10.3791/65690 (2024).

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