Nous présentons ici un protocole permettant de mesurer avec précision et fiabilité les métabolites dans les types de cellules rares. Des améliorations techniques, y compris un fluide de gaine modifié pour le tri cellulaire et la génération d’échantillons à blanc pertinents, permettent une quantification complète des métabolites avec une entrée de seulement 5000 cellules par échantillon.
La fonction cellulaire dépend de manière critique du métabolisme, et la fonction des réseaux métaboliques sous-jacents peut être étudiée en mesurant les intermédiaires de petites molécules. Cependant, l’obtention de mesures précises et fiables du métabolisme cellulaire, en particulier dans les types de cellules rares comme les cellules souches hématopoïétiques, a traditionnellement nécessité la mise en commun de cellules provenant de plusieurs animaux. Un protocole permet désormais aux chercheurs de mesurer les métabolites dans des types de cellules rares en utilisant une seule souris par échantillon tout en générant plusieurs répétitions pour des types de cellules plus abondants. Cela réduit le nombre d’animaux nécessaires pour un projet donné. Le protocole présenté ici comporte plusieurs différences clés par rapport aux protocoles métabolomiques traditionnels, telles que l’utilisation de 5 g/L de NaCl comme fluide de gaine, le tri directement dans l’acétonitrile et l’utilisation d’une quantification ciblée avec une utilisation rigoureuse d’étalons internes, permettant des mesures plus précises et plus complètes du métabolisme cellulaire. Malgré le temps nécessaire à l’isolement des cellules individuelles, à la coloration fluorescente et au tri, le protocole permet de préserver dans une large mesure les différences entre les types de cellules et les traitements médicamenteux.
Le métabolisme est un processus biologique essentiel qui se produit dans toutes les cellules vivantes. Les processus métaboliques impliquent un vaste réseau de réactions biochimiques étroitement régulées et interconnectées, permettant aux cellules de produire de l’énergie et de synthétiser des biomolécules essentielles1. Pour comprendre la fonction des réseaux métaboliques, les chercheurs mesurent les niveaux de petites molécules intermédiaires dans les cellules. Ces intermédiaires servent d’indicateurs importants de l’activité métabolique et peuvent révéler des informations essentielles sur la fonction cellulaire.
La spectrométrie de masse (MS) est le choix le plus populaire pour la détection spécifique des métabolites dans des échantillons complexes 1,2. La résonance magnétique nucléaire (RMN) présente des avantages dans la quantification absolue des composés et l’élucidation de la structure, mais la spectrométrie de masse peut souvent résoudre davantage de composants dans des mélanges complexes tels que des biofluides ou des extraits cellulaires. Le plus souvent, la MS est associée à une séparation préalable du composé par électrophorèse capillaire (EC), chromatographie en phase gazeuse (GC) ou chromatographie liquide (LC)3. Le choix de la plate-forme de séparation est principalement motivé par la gamme de métabolites cibles et le type d’échantillon et, dans un contexte réel, par la disponibilité des machines et de l’expertise. Les trois plates-formes de séparation ont une gamme large et chevauchante de métabolites appropriés, mais des limites différentes. En bref, l’EC ne peut séparer que des molécules chargées et nécessite beaucoup d’expertise pour mettre en œuvre une analyse robuste d’un grand nombre d’échantillons4. La GC est limitée aux molécules suffisamment petites et apolaires pour s’évaporer avant de se décomposer3. Si l’on considère toutes les colonnes LC disponibles dans le commerce, deux métabolites quelconques peuvent être séparés par cette technologie5. Cependant, de nombreuses méthodes LC présentent un pouvoir de résolution inférieur à celui des méthodes CE ou GC de longueur similaire.
La quantité typique de matière première pour les mesures métabolomiques est généralement de l’ordre de 5 x 105 à 5 x 107 cellules par échantillon, 5 à 50 mg de tissu humide ou 5 à 50 μL de liquide corporel6. Cependant, il peut être difficile d’obtenir de telles quantités de matière première lorsque l’on travaille avec des cellules primaires de types cellulaires rares, comme par exemple les cellules souches hématopoïétiques (CSH) ou les cellules tumorales circulantes. Ces cellules sont souvent présentes en très faible nombre et ne peuvent pas être cultivées sans compromettre les caractéristiques cellulaires critiques.
Les CSH et les cellules progénitrices multipotentes (MPP) sont les cellules les moins différenciées du système hématopoïétique et produisent continuellement de nouvelles cellules sanguines tout au long de la vie d’un organisme. La régulation de l’hématopoïèse est d’une pertinence clinique dans des conditions telles que la leucémie et l’anémie. Malgré leur importance, les CSH et les MPP sont parmi les cellules les plus rares du système hématopoïétique. À partir d’une seule souris, en général, environ 5000 CSH peuvent être isolées 7,8,9. Comme les méthodes métabolomiques traditionnelles nécessitent plus de matériel d’entrée, la mise en commun de cellules de plusieurs souris était souvent nécessaire pour analyser des types de cellules rares10,11.
Ici, nous avons cherché à développer un protocole qui permet de mesurer les métabolites dans aussi peu que 5000 cellules par échantillon afin de permettre la génération de données métabolomiques à partir des CSH d’une seule souris12. En même temps, cette méthode permet de générer plusieurs répétitions à partir d’une seule souris pour des types de cellules plus abondants comme les lymphocytes. Cette approche permet de réduire le nombre d’animaux requis pour un projet donné, contribuant ainsi aux « 3R » (réduction, remplacement, raffinement) de l’expérimentation animale.
Les métabolites dans les cellules peuvent avoir des taux de renouvellement très élevés, souvent de l’ordre de quelques secondes13. Cependant, la préparation des échantillons pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) peut prendre des heures, et le tri FACS lui-même peut prendre de quelques minutes à quelques heures, ce qui entraîne des altérations potentielles du métabolome en raison de conditions non physiologiques. Certains des réactifs utilisés dans ce protocole (tels que le tampon de lyse de chlorure d’ammonium-potassium [ACK]) peuvent avoir des effets similaires. Ces conditions peuvent causer un stress cellulaire et avoir un impact sur les niveaux et les ratios de métabolites dans les cellules, ce qui conduit à des mesures inexactes ou biaisées du métabolisme cellulaire 14,15,16. Les changements métaboliques dus à la préparation des échantillons sont parfois appelés artefacts de tri. Les longs protocoles de digestion et les réactifs agressifs qui pourraient être nécessaires pour produire des suspensions unicellulaires à partir de tissus durs ou durs peuvent aggraver ce problème. Les changements qui peuvent se produire dépendent probablement du type de cellule et des conditions de traitement. La nature précise de ces changements reste inconnue, car l’état métabolique des cellules non perturbées dans les tissus vivants ne peut pas être mesuré.
Le protocole présenté ici comporte plusieurs différences clés par rapport aux méthodes traditionnelles, à savoir l’utilisation de 5 g/L de NaCl comme fluide de gaine, le tri directement dans le tampon d’extraction, l’injection de grands volumes d’échantillons sur la chromatographie liquide à interaction hydrophile-spectrométrie de masse (HILIC-MS), et l’utilisation d’une quantification ciblée, l’utilisation rigoureuse d’étalons internes et de contrôles de fond (Figure 1). Ce protocole a le potentiel de préserver les différences entre les types de cellules et entre le traitement médicamenteux et le contrôle des véhicules dans une large mesure12. Même pour les cellules en culture, elle se compare favorablement à d’autres approches, telles que la centrifugation plus établie et l’élimination manuelle du surnageant. Cependant, comme des artefacts de tri peuvent encore se produire, les données doivent être interprétées avec prudence. Malgré cette limitation, le protocole représente une amélioration significative dans le domaine du profilage métabolique, permettant des mesures plus précises et plus complètes du métabolisme cellulaire dans les cellules primaires rares12.
La capacité de mesurer de manière robuste de larges profils métaboliques dans des cellules primaires rares ouvre la porte à de nouvelles expériences de recherche biomédicale impliquant ces cellules. Par exemple, il a été démontré que la régulation à médiation métabolique dans les CSH a un impact sur la capacité d’auto-renouvellement de la dormance, avec des implications pour l’anémie et la leucémie11,17. Dans les cellules tumorales circulantes dérivées de patients, des différences dans l’expression des gènes métaboliques entre la tumeur et les cellules adjacentes ont été démontrées18,19. Ce protocole permet aujourd’hui aux chercheurs d’étudier systématiquement ces différences au niveau métabolique, généralement considéré comme plus proche du phénotype cellulaire que de l’expression des gènes.
Les étapes les plus critiques pour une mise en œuvre réussie de la métabolomique ciblée à l’aide de ce protocole sont 1) une stratégie robuste de coloration et de déclenchement qui permettra d’obtenir des populations cellulaires propres 2) une manipulation précise des volumes liquides, 3) un calendrier reproductible de toutes les étapes expérimentales, en particulier toutes les étapes précédant l’extraction des métabolites. Idéalement, tous les échantillons appartenant à une expérience devraient …
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier l’animalerie de l’Institut Max Planck d’immunobiologie et d’épigénétique pour avoir fourni les animaux utilisés dans cette étude.
13C yeast extract | Isotopic Solutions | ISO-1 | |
40 µm cell strainer | Corning | 352340 | |
Acetonitrile, LC-MS grade | VWR | 83640.32 | |
ACK lysis buffer | Gibco | 104921 | Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E |
Adenosine diphosphate (ADP) | Sigma Aldrich | A2754 | |
Adenosine monophosphate (AMP) | Sigma Aldrich | A1752 | |
Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma Aldrich | A2383 | |
Ammonium Carbonate, HPLC grade | Fisher Scientific | A/3686/50 | |
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) | Waters | 186009982 | |
B220-A647 | Invitrogen | 103226 | |
B220-PE/Cy7 | BioLegend | 103222 | RRID:AB_313005 |
CD11b-PE/Cy7 | BioLegend | 101216 | RRID:AB_312799 |
CD150-BV605 | BioLegend | 115927 | RRID:AB_11204248 |
CD3-PE | Invitrogen | 12-0031-83 | |
CD48-BV421 | BioLegend | 103428 | RRID:AB_2650894 |
CD4-PE/Cy7 | BioLegend | 100422 | RRID:AB_2660860 |
CD8a-PE/Cy7 | BioLegend | 100722 | RRID:AB_312761 |
cKit-PE | BioLegend | 105808 | RRID:AB_313217 |
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit | Invitrogen | 11415D | |
FACSAria III | BD | ||
Gr1-PE/Cy7 | BioLegend | 108416 | RRID:AB_313381 |
Heat sealing foil | Neolab | Jul-18 | |
Isoleucine | Sigma Aldrich | 58880 | |
JetStream ESI Source | Agilent | G1958B | |
Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
Medronic acid | Sigma Aldrich | M9508-1G | |
Methanol, LC-MS grade | Carl Roth | HN41.2 | |
NaCl | Fluka | 31434-1KG | |
PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
Sca1-APC/Cy7 | BioLegend | 108126 | RRID:AB_10645327 |
TER119-PE/Cy7 | BioLegend | 116221 | RRID:AB_2137789 |
Triple Quadrupole Mass Spectrometer | Agilent | 6495B | |
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted | Eppendorf | 30129512 | |
UHPLC Autosampler | Agilent | G7157B | |
UHPLC Column Thermostat | Agilent | G7116B | |
UHPLC Pump | Agilent | G7120A | |
UHPLC Sample Thermostat | Agilent | G4761A |