Summary

מטבולומיקה ממוקדת על תאים ראשוניים נדירים

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידה מדויקת ואמינה של מטבוליטים בסוגי תאים נדירים. שיפורים טכניים, כולל נוזל מעטפת שונה למיון תאים ויצירת דגימות ריקות רלוונטיות, מאפשרים כימות מקיף של מטבוליטים עם קלט של 5000 תאים בלבד לדגימה.

Abstract

תפקוד התאים תלוי באופן קריטי בחילוף החומרים, וניתן לחקור את תפקוד הרשתות המטבוליות הבסיסיות על ידי מדידת מתווכים של מולקולות קטנות. עם זאת, השגת מדידות מדויקות ואמינות של חילוף החומרים בתאים, במיוחד בסוגי תאים נדירים כמו תאי גזע המטופויטיים, דרשה באופן מסורתי איגום תאים מבעלי חיים מרובים. פרוטוקול מאפשר כעת לחוקרים למדוד מטבוליטים בסוגי תאים נדירים באמצעות עכבר אחד בלבד בכל דגימה, תוך יצירת מספר עותקים משוכפלים עבור סוגי תאים נפוצים יותר. זה מקטין את מספר בעלי החיים הדרושים לפרויקט נתון. הפרוטוקול המוצג כאן כולל מספר הבדלים מרכזיים על פני פרוטוקולים מטאבולומיים מסורתיים, כגון שימוש ב- NaCl 5 גרם / L כנוזל מעטפת, מיון ישירות לאצטוניטריל, ושימוש בכימות ממוקד תוך שימוש קפדני בתקנים פנימיים, המאפשרים מדידות מדויקות ומקיפות יותר של חילוף החומרים התאי. למרות הזמן הנדרש לבידוד תאים בודדים, צביעה פלואורסצנטית ומיון, הפרוטוקול יכול לשמר במידה רבה הבדלים בין סוגי תאים וטיפולים תרופתיים.

Introduction

חילוף חומרים הוא תהליך ביולוגי חיוני המתרחש בכל התאים החיים. תהליכים מטבוליים כוללים רשת עצומה של תגובות ביוכימיות המווסתות ומחוברות זו לזו, ומאפשרות לתאים לייצר אנרגיה ולסנתז ביומולקולות חיוניות1. כדי להבין את תפקודן של רשתות מטבוליות, חוקרים מודדים את רמות המתווכים של מולקולות קטנות בתוך התאים. מתווכים אלה משמשים אינדיקטורים חשובים לפעילות מטבולית ויכולים לחשוף תובנות קריטיות לגבי תפקוד התאים.

ספקטרומטריית מסה (MS) היא הבחירה הפופולרית ביותר לזיהוי ספציפי של מטבוליטים בדגימות מורכבות 1,2. לתהודה מגנטית גרעינית (NMR) יש יתרונות בכימות מוחלט של תרכובות והבהרת מבנה, אך טרשת נפוצה יכולה לעתים קרובות לפתור רכיבים נוספים בתערובות מורכבות כגון נוזלים ביולוגיים או תמציות תאים. לעתים קרובות יותר, טרשת נפוצה משולבת עם הפרדה קודמת של התרכובת על ידי אלקטרופורזה נימית (CE), כרומטוגרפיית גז (GC), או כרומטוגרפיה נוזלית (LC)3. הבחירה בפלטפורמת ההפרדה מונעת בעיקר על ידי מגוון המטבוליטים של המטרה וסוג הדגימה, ובסביבה בעולם האמיתי, על ידי זמינות המכונות והמומחיות. לכל שלוש פלטפורמות ההפרדה יש טווח רחב וחופף של מטבוליטים מתאימים אך מגבלות שונות. בקצרה, CE יכול רק להפריד מולקולות טעונות ודורש מומחיות רבה כדי ליישם ניתוח חזק של מספר רב של דגימות4. GC מוגבל למולקולות קטנות ואפולריות מספיק כדי להתאדות לפני פירוק3. בהתחשב בכל עמודות LC זמין מסחרית, כל שני מטבוליטים ניתן להפריד על ידי טכנולוגיה זו5. עם זאת, שיטות LC רבות מציגות פחות כוח פתרון מאשר שיטות CE או GC באורך דומה.

הכמות האופיינית של חומר מוצא למדידות מטבולומיות היא בדרך כלל בטווח של 5 x 105 עד 5 x 107 תאים לדגימה, 5-50 מ”ג של רקמה רטובה, או 5-50 מיקרוליטר של נוזל גוף6. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר להשיג כמויות כאלה של חומר מוצא כאשר עובדים עם תאים ראשוניים של סוגי תאים נדירים, כגון למשל תאי גזע hematopoietic (HSC) או תאים סרטניים במחזור. תאים אלה נמצאים לעתים קרובות במספרים נמוכים מאוד ולא ניתן לטפח אותם מבלי לפגוע בתכונות תאיות קריטיות.

HSCs ותאי אב רב-פוטנטיים (MPPs) הם התאים הכי פחות ממוינים של המערכת ההמטופויטית ומייצרים ברציפות תאי דם חדשים לאורך חיי האורגניזם. הרגולציה של hematopoiesis הוא בעל רלוונטיות קלינית בתנאים כגון לוקמיה ואנמיה. למרות חשיבותם, HSCs ו-MPPs הם בין התאים הנדירים ביותר במערכת ההמטופויטית. מעכבר יחיד, בדרך כלל, ניתן לבודד כ- 5000 HSCs 7,8,9. מכיוון ששיטות מטבולומיות מסורתיות דורשות יותר חומר קלט, איגום תאים מעכברים מרובים היה נחוץ לעתים קרובות כדי לנתח סוגי תאים נדירים10,11.

כאן שאפנו לפתח פרוטוקול המאפשר מדידה של מטבוליטים ב-5,000 תאים בלבד לדגימה, כדי לאפשר הפקת נתונים מטאבולומיים מ-HSCs של עכבר בודד12. יחד עם זאת, שיטה זו מאפשרת ליצור שכפולים מרובים מעכבר יחיד עבור סוגי תאים שופעים יותר כמו לימפוציטים. גישה זו מפחיתה את מספר בעלי החיים הדרושים לפרויקט נתון, ובכך תורמת ל”3R” (הפחתה, החלפה, עידון) של ניסויים בבעלי חיים.

מטבוליטים בתאים יכולים להיות בעלי שיעורי תחלופה גבוהים מאוד, לעתים קרובות בסדר גודל של שניות13. עם זאת, הכנת דגימות למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) יכולה להימשך שעות, ומיון FACS עצמו יכול להימשך דקות עד שעות, מה שמוביל לשינויים פוטנציאליים במטבוליזם עקב תנאים לא פיזיולוגיים. לחלק מהריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה (כגון חיץ ליזה של אמוניום-כלוריד-אשלגן [ACK]) יכולות להיות השפעות דומות. תנאים אלה יכולים לגרום לעקה תאית ולהשפיע על רמות ויחסים של מטבוליטים בתוך התאים, מה שמוביל למדידות לא מדויקות או מוטות של חילוף החומרים התאי 14,15,16. השינויים המטבוליים עקב הכנת הדגימה מכונים לעיתים ממצאי מיון. פרוטוקולי עיכול ארוכים וריאגנטים קשים שעשויים להידרש כדי לייצר תרחיפים חד-תאיים מרקמות קשות או קשות עלולים להחמיר בעיה זו. השינויים שיכולים להתרחש תלויים ככל הנראה בסוג התא ובמצב העיבוד. טבעם המדויק של השינויים נותר לא ידוע, שכן לא ניתן למדוד את המצב המטבולי של התאים הבלתי מופרעים ברקמה החיה.

הפרוטוקול המוצג כאן כולל מספר הבדלים מרכזיים בהשוואה לשיטות מסורתיות, כלומר השימוש ב-NaCl 5 גרם/ליטר כנוזל נדן, מיון ישירות למאגר מיצוי, הזרקת נפחי דגימה גדולים על ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית של אינטראקציה הידרופילית (HILIC-MS), ושימוש בכימות ממוקד, שימוש קפדני בתקנים פנימיים ובבקרות רקע (איור 1). לפרוטוקול זה יש פוטנציאל לשמר הבדלים בין סוגי תאים ובין טיפול תרופתי לבקרת רכב במידה רבה12. אפילו עבור תאים בתרבית, הוא משתווה לטובה לגישות חלופיות, כגון צנטריפוגה מבוססת יותר והסרה ידנית של סופרנטנט. עם זאת, מכיוון שמיון ממצאים עדיין עשוי להתרחש, יש לפרש את הנתונים בזהירות. למרות מגבלה זו, הפרוטוקול מייצג שיפור משמעותי בתחום האפיון המטבולי, ומאפשר מדידות מדויקות ומקיפות יותר של חילוף החומרים התאי בתאים ראשוניים נדירים12.

היכולת למדוד באופן יציב פרופילים מטבוליים רחבים בתאים ראשוניים נדירים פותחת את הדלת לניסויים חדשים במחקר ביו-רפואי המערבים תאים אלה. לדוגמה, רגולציה מתווכת מטבולית ב- HSCs הוכחה כמשפיעה על יכולת התחדשות עצמית רדומה, עם השלכות על אנמיה ולוקמיה11,17. בתאי גידול שמקורם בחולה, הבדלים בביטוי גנים מטבוליים בין הגידול לתאים סמוכים הוכחו18,19. פרוטוקול זה מאפשר כעת לחוקרים לחקור הבדלים אלה באופן שיטתי ברמה המטבולית, הנחשבת בדרך כלל קרובה יותר לפנוטיפ התאי מאשר ביטוי גנים.

Protocol

גידול וגידול של כל העכברים המשמשים לפרוטוקול זה נערכו במתקן קונבנציונלי לבעלי חיים במכון מקס פלנק לאימונוביולוגיה ואפיגנטיקה (MPI-IE) על פי תקנות הרשויות המקומיות (Regierungspräsidium Freiburg). עכברים הומתו באמצעותCO2 ונקע צוואר הרחם על ידי צוות שהוכשר על ידי FELASA B בעקבות הנחיות ותקנות שאושרו על יד?…

Representative Results

מיון FACS מאפשר בידוד של אוכלוסיות נקיות מסוגי תאים שונים מאותו תרחיף תאים (איור 2 ואיור 3). הספציפיות של שיטה זו מסתמכת על צביעה של סוגי תאים שונים עם סמני משטח ספציפיים (לדוגמה, תאי B ותאי T מהטחול) או שילובים ספציפיים של סמני פני שטח (לדוגמה, HSCs ו- MPPs). צביעה של סמ…

Discussion

הצעדים הקריטיים ביותר ליישום מוצלח של מטבולומיקה ממוקדת באמצעות פרוטוקול זה הם: 1) אסטרטגיית צביעה וגטינג חזקה שתניב אוכלוסיות תאים נקיות 2) טיפול מדויק בנפחי נוזלים, 3) תזמון ניתן לשחזור של כל שלבי הניסוי, במיוחד כל השלבים לפני מיצוי מטבוליטים. באופן אידיאלי, כל הדגימות השייכות לניסוי אחד צ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות למתקן בעלי החיים של מכון מקס פלנק לאימונוביולוגיה ואפיגנטיקה על אספקת בעלי החיים ששימשו במחקר זה.

Materials

13C yeast extract Isotopic Solutions ISO-1
40 µm cell strainer Corning 352340
Acetonitrile, LC-MS grade VWR 83640.32
ACK lysis buffer Gibco 104921 Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP) Sigma Aldrich A2754
Adenosine monophosphate (AMP) Sigma Aldrich A1752
Adenosine triphosphate (ATP) Sigma Aldrich A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade Fisher Scientific A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) Waters 186009982
B220-A647 Invitrogen 103226
B220-PE/Cy7 BioLegend 103222 RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7 BioLegend 101216 RRID:AB_312799
CD150-BV605 BioLegend 115927 RRID:AB_11204248
CD3-PE Invitrogen 12-0031-83
CD48-BV421 BioLegend 103428 RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7 BioLegend 100422 RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7 BioLegend 100722 RRID:AB_312761
cKit-PE BioLegend 105808 RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit  Invitrogen 11415D
FACSAria III BD
Gr1-PE/Cy7 BioLegend 108416 RRID:AB_313381
Heat sealing foil Neolab Jul-18
Isoleucine Sigma Aldrich 58880
JetStream ESI Source Agilent G1958B
Leucine Sigma Aldrich L8000
Medronic acid Sigma Aldrich M9508-1G
Methanol, LC-MS grade Carl Roth HN41.2
NaCl Fluka 31434-1KG
PBS Sigma Aldrich D8537
Sca1-APC/Cy7 BioLegend 108126 RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7 BioLegend 116221 RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer Agilent 6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted Eppendorf 30129512
UHPLC Autosampler Agilent G7157B
UHPLC Column Thermostat Agilent G7116B
UHPLC Pump Agilent G7120A
UHPLC Sample Thermostat Agilent G4761A

References

  1. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  2. Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  3. Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
  4. Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
  5. Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
  6. Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023)
  7. Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -. Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
  8. Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
  9. Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
  10. Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
  11. Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
  12. Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
  13. Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
  14. Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
  15. Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
  16. Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
  17. Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
  18. Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
  19. Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
  20. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  21. Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
  22. Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
  23. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  24. Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
  25. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
  26. Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).

Play Video

Cite This Article
Glaser, K. M., Egg, M., Hobitz, S., Mitterer, M., Schain-Zota, D., Schönberger, K., Schuldes, K., Cabezas-Wallscheid, N., Lämmermann, T., Rambold, A., Buescher, J. M. Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells. J. Vis. Exp. (204), e65690, doi:10.3791/65690 (2024).

View Video