ホルモン、代謝、および電気的制御の研究のための標的視床下部ニューロンの分離

注:実験手順の全体図を 図1Aに図示しています。この研究で実施されたマウスを用いたすべての実験は、私たちの施設の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。3ヶ月齢のC57BL6/Jマウスを使用し、国際実験動物管理協会(AAALAC)承認のビバリウムに獣医師の世話をして飼育しました。マウスは、12時間の明暗サイクルで大きなケージに住み、 自由摂食されました。 1.受胎と妊娠の確認 繁殖のために関心のある任意の背景および遺伝子型のマウスを配置する。受胎前の女性の日付と体重を記録します。 6時間後、プローブで女性のプラークを検査します。プラークが存在する場合は、女性を男性から分離します。プラークが存在しない場合は、翌日までメスをケージに入れたままにしてから、マウスを分離します。 受胎後7、10、および14日目に、妊娠を確認するために女性の体重を量ります。 2. 培地、24ウェルプレート、材料調製 細胞単離の日に、すぐに使用できるポリ-D-リジンコーティングされたガラスカバースリップ( 材料表を参照)を次のように24ウェルプレートに入れます。生物学的フードの下で、15枚のカバーガラスを含む単一のパッケージを70%エタノールで滅菌し、乾燥させます。パッケージを開き、カバーガラスを60mmプレートに入れます。プレートを水平に振ってカバーガラスを分離します。次に、プレートを反転させて、24ウェルプレートのウェルに配置する単一のカバーガラスをピックアップします。 カバーガラスを1.0 mLの滅菌ハンクスバランス塩溶液(HBSS)で5分間1回洗浄します。 それまでの間、20.0 mLのプレーティングメディアを次のように調製します:18.31 mLのBME(基礎培地イーグル、+アールの塩)、1.0 mLの熱不活化ウシ胎児血清(FBS)を添加し、200 μLのピルビン酸ナトリウム(100倍ストックから)、200 μLのグルタミン(200 nMストックから)、および100 μLのペニシリン/ストレプトマイシン(200xストックから)。 ウェル内のHBSSを1.0 mLのメッキ培地に交換し、プレートを37°Cのインキュベーターに入れます。 ブンゼンバーナーを使用して、直径の小さい3つのパスツールピペットをファイアポリッシュします。片手でピペットを持ち、先端を炎に挿入し、すばやく取り除きます。先端が滑らかになり、直径が目的の直径に縮小されるまで、このプロセスを繰り返します(目で評価)。 3.神経解離キットの指示に従って、神経組織解離のための試薬調製 消化バッファー1を室温で温めた後、50 μLの酵素1と1.91 mLのバッファー1を混合して酵素ミックス1を調製し、酵素215 μLと消化バッファー230 μLを混合して酵素ミックス2を調製します。ミックスは、すべての胚の脳組織に使用するのに十分です。 HBSS中の0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、例えば、50.0mLのHBSS中の0.25gを調製する。 4.胚抽出 2つのまっすぐな細かい鉗子、1つの湾曲したポイント鉗子、および1組の細かい手術用はさみをオートクレーブし、使用前に70%エタノールで滅菌します。次に、ペトリ皿にHBSSを入れます。 CO2 チャンバー内の1つのE14-E16妊娠中のダムを安楽死させ、頸部脱臼を行います。注意: 次の手順は、無菌条件下でボンネット内で実行する必要があります。 腹部を70%エタノールで滅菌します。恥骨結合から胸郭の剣状突起まで腹腔を外科用ハサミと鉗子で切り開きます。 子宮角を取り出し、氷冷HBSSで満たされた100mmプレートに入れ、よく洗います。 細かい鉗子で子宮からすべての胚を抽出して分離します。細かい外科用ハサミや鉗子で胚をすばやく斬首します。HBSSで満たされた60mmのペトリ皿にヘッドを置きます。 5.視床下部の抽出、収集、および組織解離 脳を保持するために眼腔に1つの細かい鉗子を置きます。他の細かい鉗子を使用して、脳が見えるまで剥がして皮膚と頭蓋骨を取り除きます。その白い外観に基づいて他の組織と脳を区別します。皮膚と頭蓋骨はピンク色で血管系が豊富です。 湾曲した先端鉗子を使用して頭蓋骨から脳を取り除き、嗅球から脳をすくい取り、逆さまにします。 現在、皮質は腹側にあり、視床下部は上面に背側に見えます(図1B)。湾曲した鉗子で、脳が白く透明になるまで髄膜と血管の層を取り除きます。 湾曲した鉗子で、視床下部領域を脳の他の部分から分離します。 視床下部を3〜4個の小片に切り、ピペットで15 mLチューブに移します。 チューブが氷上にある間に他の胚についても手順を繰り返します。 チューブに6.0 mLのHBSSを満たし、組織を沈降させ、上清を取り除き、酵素ミックス1を追加します。組織を防ぐためにチューブを静かに混合して攪拌します。 チューブを37°Cの水浴中で15分間インキュベートし、5分ごとに組織を攪拌して組織を再懸濁します。 15分後、30 μLの酵素ミックス2を加えます。最大の直径(<1 mm)のピペットパスツールを使用して脳組織を解離します。泡を形成せずに10倍上下にピペットします。 水浴中で37°Cで10分間インキュベートします。チューブを静かに攪拌して、5分ごとに組織を再懸濁します。 10分後、残りの15 μLの酵素ミックス2を追加します。気泡を形成することなく、直径が減少する他の2つのファイアポリッシュピペットと組織を上下に10倍解離します。 解離した組織のチューブに、直ちに10.0 mLのHBSS-0.5% BSAを加え、300 × g で室温で10分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞ペレットを1.0 mLのHBS-0.5% BSAに再懸濁します。 6.細胞カウント HBSS-0.5% BSAを用いて細胞懸濁液を1:5に希釈します。 希釈した細胞懸濁液10 μLをノイバウアー計数チャンバーに入れます。 明視野顕微鏡下で、4つのチャンバーの角の正方形にある細胞のみを数えます。平均を計算し、5 × 104を掛けます。注:細胞単離に進むには、>10個の6 個のセルがあることを確認してください。最適なセル数は107です。 7.ネガティブセレクション 注:ネガティブセレクションにより、ユーザーはニューロン細胞と非ニューロン細胞を分離することにより、純粋な初代ニューロン培養を得ることができます。予冷溶液を使用してください。 細胞懸濁液を300 × g で3分間遠心分離します(遠心分離は最大10分まで延長できます)。上清を穏やかに吸引し、ペレットを80 μLのHBSS-0.5% BSAに107 細胞の濃度に再懸濁します。 20 μLの非神経細胞ビオチン抗体カクテルを加え、4°Cで5分間インキュベートします。 細胞を洗浄して遊離抗体を除去し、2.0 mLのHBSS-0.5% BSAで300 × g で3分間遠心分離します。 上清を穏やかに吸引し、ペレットを80 μLのHBSS-0.5% BSAに再懸濁します。20 μLの抗ビオチンマイクロビーズを添加し、十分に混合し、4°Cで10分間インキュベートします。 0.5 mLのHBSS-0.5% BSAを最大10個の7 セルに加え、磁気カラムの準備が整うまで待ちます。 8.磁気分離、ネガティブセレクション 注:磁気分離は、ニューロン細胞から非ニューロン細胞を分離することを可能にする重要なステップです。神経細胞と非神経細胞を含むサンプルを磁場に通し、ビオチン-抗体-磁気ビーズ複合体に結合した非神経細胞をカラムに捕捉します(図1C)。遊離ニューロン細胞はカラムを通して溶出され、15 mLチューブに集められます。 図1Cに示すように、セパレーターとMSカラムを備えたスタンド(キットに含まれています)を準備します。 カラムを開き、セルを分離する準備ができたときにのみスタンドをセットアップします。 0.5 mLのHBSS-0.5% BSAでカラムをリンスします。溶液の滴下が止まるまで待ちます。 神経細胞を回収するには、15 mLチューブをカラムの下に置き、0.5 mLの細胞懸濁液をカラムに通します。滴下が止まるまで溶出液をチューブに集めます。残留神経細胞を捕捉するには、HBSS-0.5% BSAのカラム3 x 0.5 mLを洗浄します。 非神経細胞を採取するには、カラムを磁石から取り外し、新しい15 mlチューブに入れます。1.0 mLのHBSS–0.5% BSAをカラムに加え、プランジャーを使用して磁気標識された非神経細胞を回収します。 神経細胞および非神経細胞を300 × g で3分間遠心分離します。上清を穏やかに吸引し、細胞を1.0 mLのHBSS-0.5% BSAに再懸濁します。セクション 6 で前述したようにセルをカウントします。 必要に応じて、非神経細胞を24ウェルプレートにプレートします。それ以外の場合は破棄します。 9.ポジティブセレクション 注:純粋な神経細胞懸濁液が得られると、標的細胞を単離するためにポジティブ選択が行われます。細胞は、表面抗原に対する特異的なビオチン結合抗体を用いて単離することができる。抗体は抗ビオチン磁気ビーズによって認識されます。細胞懸濁液をカラムに流すことによって、目的の細胞のみが磁場に捕捉される。 純粋な神経細胞懸濁液を300 × g で3分間遠心分離します。上清を穏やかに吸引し、ペレットを80 μLのHBSS-0.5% BSAに再懸濁します。製造元の指示に従って特異的抗体を添加し、4°Cで10分間インキュベートします。注:LepRを発現する細胞を探す場合は、0.50 μg/106細胞の濃度のマウスレプチンRビオチン化抗体(材料の表を参照)をお勧めします。 余分な抗体を2.0 mLのHBSS-0.5% BSAで洗い流し、300 × g で3分間遠心分離します。 上清を除去し、ペレットを80 μLのHBSS-0.5% BSAに再懸濁し、20 μLの抗ビオチンマイクロビーズを加えます。4°Cで10分間インキュベートします。 107 細胞ごとに、0.5 mLのHBSS-0.5% BSAを添加し、磁気カラムの準備が整うまで待ちます。 10.磁気分離、正の選択 セパレーターとMSカラムを備えたスタンドを準備します。MS カラムを 0.5 mL の HBSS-0.5% BSA で洗い流します。滴りが止まるまで待ちます。 15 mLチューブをカラムの下に置き、0.5 mLの細胞懸濁液をカラムに通し、非特異的神経細胞を含む溶出液を回収します。残存非特異的神経細胞のカラムを洗浄するには、3 x 0.5 mLのHBSS-0.5% BSAで洗浄します。 カラムを磁石から取り出し、新しい15 mLチューブに入れ、1.0 mLのHBSS-0.5% BSAを加えます。プランジャーを使用して、ターゲット細胞を洗い流します。 両方のチューブを300 × g で3分間遠心分離します。上清を静かに除去し、0.5 mLのプレーティング培地に再懸濁します。 セクション 6 で前述したようにセルをカウントします。 ポジティブコントロールとしての標的細胞とネガティブコントロールとしての非特異的細胞の両方を、セクション2に記載したように予め調製した24ウェルプレートに120,000〜200,000細胞/mm3の密度でプレートし、5%CO2、9%O2、および95%湿度中で37°Cで12時間インキュベートする。 11. 細胞培養の維持 19.2 mLの神経細胞培養培地、400 μLのB27サプリメント(50倍ストックから)、200 μLのグルタミン(200 μMストックから)、および100 μLのペニシリン/ストレプトマイシン(200倍ストックから)を含む20 mLの培養培地を準備します。 ニューロン細胞または非ニューロン細胞を含む24ウェルプレートのプレーティング培地を交換します。 2 x 1.0 mLのHBSSで洗浄します。 1.0 mLの培地を加えます。 0.5 mLの古い培地を0.5 mLの新しい培地と交換して、2/3日ごとに培地を更新します。注:細胞は培養中に維持することができ、 in vitro で最大21日間使用できます(DIV21)。 12. ニューロン免疫蛍光染色 染色の12時間前に、50/50メタノールとアセトンからなる溶液を調製し、-20°Cで一晩冷却します。 24 ウェルプレート内のニューロンを 2 x 1.0 mL の 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 5 分間洗浄します。 PBS溶液を1.0 mLの50/50溶液に置き換え、氷中で20分間インキュベートします。 1x PBSで3 x 5分間洗浄します。 ニューロンを1x PBS中の3%BSAで室温で1時間ブロックします。 製造元の指示に従って記載されている抗体濃度を使用して、1x PBS中の3%BSA中の一次抗体溶液を調製します。使用した抗体および濃度は、 材料表に記載されています。 ブロッキング溶液を一次抗体溶液に交換し、4°Cで一晩インキュベートします。 細胞を1x PBSで3 x 10分間洗浄します。 製造元の指示に従って抗体の濃度を使用して、1x PBS中の3%BSAを含む二次抗体溶液を調製します。使用した二次抗体は 材料表に記載されています。 細胞を二次抗体溶液とともに室温で1時間インキュベートします。 細胞を1x PBSで3 x 10分間洗浄します。 取り付け手順中にニューロンを1x PBSに残します。少量の封入剤(核同定用の4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールの有無にかかわらず)を顕微鏡スライドに置きます。ニューロンを含むガラス製のカバーガラスを鉗子で1枚取り出し、紙ティッシュのカバーガラスの側面を軽くたたいて余分なPBSを乾かします。封入剤のカバーガラスを裏返し、ニューロンが顕微鏡スライドに面していることを確認します。ティッシュペーパーで余分な封入メディアをそっと押して取り外します。 顕微鏡スライドは、明視野顕微鏡または共焦点顕微鏡で分析する準備ができています。