عزل الخلايا العصبية تحت المهاد المستهدفة لدراسات التنظيم الهرموني والأيضي والكهربائي
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لزراعة أنواع فرعية محددة من الخلايا تحت المهاد في الثقافة. يمكن اختيار الخلايا بناء على علامات الغشاء المناسبة / الفريدة واستخدامها في العديد من التطبيقات ، بما في ذلك المقايسات المناعية والفيزيولوجية الكهربية والكيميائية الحيوية.
Abstract
ينظم ما تحت المهاد عمليات التمثيل الغذائي الأساسية من خلال التحكم في وظائف متنوعة مثل تناول الطعام ودرجة حرارة الجسم وإطلاق الهرمونات. نظرا لأن وظائف منطقة ما تحت المهاد يتم التحكم فيها بواسطة مجموعات فرعية محددة من المجموعات العصبية ، فإن القدرة على عزلها توفر أداة رئيسية لدراسة آليات التمثيل الغذائي. في هذا الصدد ، يشكل التعقيد العصبي لما تحت المهاد تحديات استثنائية.
لهذه الأسباب ، تم استكشاف تقنيات جديدة ، مثل فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS). تصف هذه الورقة تطبيقا جديدا لفرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) باستخدام تقنية الميكروبيدات لعزل مجموعة الخلايا العصبية المستهدفة عن أدمغة الفئران قبل الولادة. هذه التقنية بسيطة وتضمن ثقافة الخلايا العصبية تحت المهاد الأولية النقية للغاية والقابلة للحياة مع قابلية عالية للاستنساخ. يتم فصل منطقة ما تحت المهاد بلطف ، ويتم عزل الخلايا العصبية بشكل انتقائي وفصلها عن الخلايا الدبقية ، وأخيرا ، باستخدام جسم مضاد محدد لعلامة سطح الخلية ، يتم اختيار السكان المعنيين.
بمجرد عزلها ، يمكن استخدام الخلايا العصبية المستهدفة للتحقق من خصائصها المورفولوجية والكهربائية والغدد الصماء واستجاباتها في الظروف الطبيعية أو المرضية. علاوة على ذلك ، نظرا للأدوار المتنوعة لما تحت المهاد في تنظيم التغذية والتمثيل الغذائي والإجهاد والنوم والتحفيز ، فإن إلقاء نظرة فاحصة على الخلايا العصبية المستهدفة والخاصة بالمنطقة قد يوفر نظرة ثاقبة لمهامها في هذه البيئة المعقدة.
Introduction
منطقة ما تحت المهاد هي منطقة متعددة الجوانب في الدماغ تتوسط وظائف الغدد الصماء واللاإرادية والحشوية والسلوكية ، بما في ذلك التغذية والتمثيل الغذائي والنوم ودرجة حرارة الجسم والسلوك الاجتماعي والدافع الجنسي 1،2،3،4،5. يتم تحقيق عدم التجانس الوظيفي من خلال مزيج تآزري من الآليات الكيميائية الحيوية والكهربائية: تطلق الخلايا العصبية تحت المهاد إمكانات العمل وتفرز وتطلق الهرمونات والببتيدات العصبية لتعديل مناطق الدماغ وأعضاء الجسم. أخيرا ، تترجم الخلايا العصبية تحت المهاد رسائل الاستتباب من الجسم ، وتستجيب بردود فعل طويلة الأجل وقصيرة الأجل ولوائح التغذيةالأمامية 6.
تشمل البيئة العصبية المعقدة لما تحت المهاد الخلايا العصبية الغدد الصماء المغنطيسية ، وإطلاق الأوكسيتوسين والفاسوبريسين. الخلايا العصبية ذات الخلايا الصغيرة ، التي تشارك في المقام الأول في التنظيم الهرموني الجهازي ، والإفراج على سبيل المثال ، هرمون إطلاق هرمون الثيروتروبين (TRH) ، وهرمون إفراز الكورتيكوتروبين (CRH) إلى الغدة النخامية ؛ الخلايا العصبية الإسقاط الببتيدرجي الكبيرة ، والإفراج عن orexin وهرمون تركيز الميلانين (MCH) ؛ والخلايا العصبية الببتيدرجية الصغيرة من النواة المقوسة (ARC) التي تطلق POMC (proopiomelanocortin) و AgRP (بروتين مرتبط ب agouti) ، المسمى ARCPOMC و ARCAgRP ، على التوالي. جنبا إلى جنب مع الخلايا الإفرازية ، تشارك الخلايا العصبية المثيرة والمثبطة الأخرى ، بما في ذلك الخلايا العصبية الدوبامينية ، والجلوتامينرجيك ، و GABAergic 7 ، في تشكيل دوائر داخل المهاد وخارج المهاد ، وبالتالي إنشاء شبكات منسقة واسعة النطاق من عدم التجانس الخلوي الكبير8.
كان التنوع تحت المهاد تحديا يحاول الباحثون التغلب عليه على مدار ال 50 عاما الماضية. لدراسة هذا عدم التجانس في مرحلة ما تحت المهاد النامية والناضجة والشيخوخة ، استخدم الباحثون ، من ناحية ، تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لاستكشاف تنظيم الخلايا العصبية ، بالإضافة إلى التوقيعات الجزيئية والنسخية. قدم هذا الجهد نظرة ثاقبة على الأدوار المتنوعة للخلايا العصبية تحت المهاد وتناول الروابط بين الهوية الخلوية ودورها المحتمل في النظام الفسيولوجي8،9،10. من ناحية أخرى ، تم التحقيق في الوظائف العصبية من خلال التلاعب البصري الوراثي والنهج السلوكية للقياس الضوئي للألياف ، مما يوفر نظرة فاحصة على بنية الدوائر. في العقدين الماضيين ، سمحت تقنية Cre-recombinase للباحثين بتحفيز أو تثبيط مجموعة مستهدفة من الخلايا العصبية وراثيا مع ملاحظة التغيرات في السلوكيات واستجابات الجسم6،11،12.
ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب تدرس وظائف ما تحت المهاد من منظور عام دون الغوص بشكل أعمق في الآليات الخلوية المحددة أو الأساس البيولوجي لدورها في بيئة ما تحت المهاد المعقدة. لمعالجة هذا الأمر ، ركز عدد قليل جدا من الدراسات على التحقيق في الخصائص الجزيئية والكيميائية الحيوية والكهربائية باستخدام الثقافات الأولية غير المتجانسة. سعت هذه الدراسات إلى تشريح عمليات عصبية محددة في بيئة معقدة وولدت نماذج تكاملية للآليات الفسيولوجية13،14،15. ومع ذلك، فإن الثقافات غير المحددة تشكل تحديات كبيرة. على سبيل المثال ، يتم تعطيل الاتصال الفسيولوجي للخلايا العصبية والتوزيع التشريحي عن طريق طلاء الخلايا العصبية من مناطق ما تحت المهاد المختلفة التي لا تتفاعل عادة ، مما يخلق تأثيرات مربكة. بالإضافة إلى ذلك ، لكل منطقة أدوار مختلفة ومجموعات عصبية متنوعة ، مما يجعل من الصعب دراسة العمليات البيولوجية البسيطة.
لمواجهة هذه التحديات ، في العقد الماضي ، تم تنفيذ مناهج جديدة لعزل الخلايا العصبية ذات الأهمية ، مثل الفرز المناعي ، وفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت (FACS) ، وفرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS). Immunopanning هي استراتيجية تستخدم لتنقية الخلايا المستهدفة باستخدام أطباق مغلفة بالأجسام المضادة لسلسلة من التحديدات غير العصبية (السلبية) والعصبية (الإيجابية). في حين أن هذه التقنية يمكن ، من حيث المبدأ ، أن تولد ثقافات خلايا نقية عالية الغلة ، إلا أنها تستخدم في الغالب في الغالب للخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن لأن هذه الخلايا يمكنها مقاومة ساعات من التلاعب16,17. تعد تقنية FACS أداة قوية لفرز الخلايا بناء على علامات الفلورسنت والخصائص الخلوية باستخدام قياس التدفق الخلوي18،19،20. ومع ذلك ، استخدم عدد قليل جدا من الدراسات هذه الطريقة لعزل الخلايا لزراعة الخلايا. هذه التقنية مكلفة وتتطلب موظفين ذوي مهارات عالية لاستخدامها وصيانتها ؛ بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب الحفاظ على خلايا قابلة للحياة ومعقمة في نهاية إجراء الفرز21. بشكل عام ، يبدو أن MACS تقنية بسيطة وغير مكلفة للحصول على ثقافات نقية للغاية وقابلة للحياة من الخلايا العصبية الأولية تحت المهاد. تستخدم الطريقة حبات مغناطيسية مرتبطة بالخلايا عبر جسم مضاد. هذا يسمح بعزل الخلايا باستخدام المجال المغناطيسي للعمود.
نصف هنا طريقة تعتمد على تقنية MACS ، والتي تستخدم عادة مع الخلايا العصبية القشرية. يسمح هذا البروتوكول بعزل الخلايا العصبية تحت المهاد القابلة للحياة والنقاء للغاية من حيث المبدأ. في هذه الدراسة ، نقوم بإعداد الثقافات الأولية للخلايا العصبية التي تعبر عن مستقبلات اللبتين (LepR) ، مثل الخلايا العصبية ARCPOMC و ARCAgRP ، الموجودة فقط في نواة المقوس. تستجيب هذه الخلايا العصبية لليبتين ، وهو هرمون فقدان الشهية الذي تفرزه الأنسجة الدهنية ، بطرق كيميائية حيوية وكهربائية. لذلك ، فإن عزل هذه المجموعة من الخلايا العصبية في الثقافة يسمح بدراسة خصائصها الهرمونية والأيضية والكهربائية في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد التحقيق في الخصائص الكيميائية الحيوية والكهربائية للخلايا العصبية تحت المهاد أمرا أساسيا لفهم الأساس الجزيئي لعملية التمثيل الغذائي ، والتنظيم الحراري ، وإدارة الحالة المزاجية ، وسلوك التغذية ، والمزيد. ومع ذلك ، فإن عدم التجانس العصبي في منطقة ما تحت المهاد يجعل هذا الجهد صعبا ، وهناك حاجة إلى طرق لعزل ودراسة مجموعات فرعية محددة تحت المهاد.
تستخدم التقنيات في الجسم الحي CRE-recombinase ، وعلم البصريات ، والقياس الضوئي للألياف ، وتصوير الكالسيوم. تسمح هذه الأساليب في المقام الأول بدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية تحت المهاد ، وهناك عدد قليل جدا من الطرق المتاحة حاليا للتحقيق في سماتها غير الكهربائية. يمكن أن توفر تقنية MACS التي تم تطويرها في هذه الدراسة تقنية قابلة لعزل مجموعات فرعية محددة من الخلايا العصبية تحت المهاد في المختبر ، وبالتالي توفير العلاجات والتحليلات المستهدفة. الثقافات العصبية أسهل في الإدارة مقارنة بالثقافات المشتركة لمجموعات عصبية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، تتجنب الثقافات النقية الآثار المربكة الناجمة عن وجود الخلايا الدبقية والخلايا الدبقية الصغيرة. وبالتالي ، يمكن دراسة الخلايا العصبية من نفس المنطقة والنوع تحت المهاد استجابة لمدخلات التمثيل الغذائي والهرمونية المحددة.
في هذا البروتوكول ، اخترنا الخلايا العصبية تحت المهاد التي تعبر عن LepR. تم استزراع خلايا LepR + المعزولة للتحقيق في خصائصها الخلوية والمورفولوجية والجزيئية التي يصعب دراستها في الجسم الحي. كان نقاء الثقافات 99 ٪ ، مما يدعم دقة الطريقة. بالإضافة إلى ذلك ، كانت خلايا LepR + صحية وقابلة للحياة في DIV7 حتى DIV21.
هذه التقنية ، ومع ذلك ، لديها بعض القيود. E18 أو أقدم الثقافات العصبية النقية يصعب الحفاظ عليها. لذلك ، تقتصر نافذة الاستخراج على E14-E16. هذا يعني أن التغييرات الخلوية التي تحدث بعد E16 مفقودة. على سبيل المثال ، يزداد التعبير عن مستقبلات اللبتين في الخلايا العصبية ARC خلال فترة ما بعد الولادة المبكرة22. يجب إجراء إجراء العزل في أسرع وقت ممكن لتقليل الإجهاد الخلوي والموت وتحسين الغلة. يمكن أن يستغرق الإجراء ما يصل إلى 5 ساعات ؛ وبالتالي ، من الضروري الحفاظ على الظروف المعقمة وتقليل التلاعب إلى الحد الأدنى الضروري. يمكن أن يؤدي الاختيار الإيجابي إلى انخفاض الغلة بسبب انخفاض كميات الأنسجة المتاحة ، مما يحد من عدد التجارب التي يمكن إجراؤها باستخدام إعداد واحد. لوحظ ارتفاع موت الخلايا العصبية ، ربما بسبب انخفاض كثافة الخلايا وانخفاض الاتصال العصبي والدعم داخل الخلايا العصبية.
علاوة على ذلك ، يجب أن يرتبط الجسم المضاد الذي يستهدف المستضد محل الاهتمام بسطح الخلية لضمان الفصل الصحيح ؛ عادة ما تكون الأجسام المضادة المستخدمة في قياس التدفق الخلوي مناسبة لتقنية MACS. إذا لم يتم استخدام الجسم المضاد من قبل في طرق فصل الخلايا ، فستكون هناك حاجة إلى تجارب التحقق والمعايرة لتحديد الاستخدام والتركيز المثاليين. يتطلب استخراج الخلايا المستهدفة علامة سطح الخلية. هنا استخدمنا جسما مضادا بيوتينيلاتي ولكن من حيث المبدأ ، يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة المترافقة مع جزيئات أخرى ، مثل FITC (فلوريسئين إيزوثيوسيانات) و PE (مضاد فيكويريثرين المنقى). يمكن أيضا تطبيق تقنية MACS على الخلايا العصبية التي تعبر عن الفلوروفور ، مثل GFP أو بروتين Tag آخر ، مما قد يزيد من الخصوصية والعائد. إذا لم يتم استخدام الفلوروفور ، فسيكون البديل هو تأكيد التعبير عن الجزيء محل الاهتمام عن طريق التألق المناعي قبل إجراء تجارب الخلايا الحية. ستختبر الدراسات المستقبلية صحة هذه البدائل.
أحد الجوانب المهمة التي لم تعالجها هذه الدراسة يتعلق ب “إخلاص” المجموعات العصبية الفرعية. تأكدنا من أن الخلايا العصبية LepR + المستزرعة عبرت عن POMC ، وهو توقيع للخلايا العصبية الأصليةARC POMC . ومع ذلك ، سيكون من الضروري إجراء المزيد من الاختبارات لاستنتاج أن الثقافات العصبية LepR + تلخص نظيراتها الأصلية في الجسم الحي . بشكل عام ، قد يوفر بروتوكول عزل الخلايا العصبية MACS المقدم هنا طريقة صالحة وفعالة لدراسة آليات المهاد في المختبر والتي سيكون من الصعب التحقيق فيها في الجسم الحي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إنشاء الأشكال الرسومية مع BioRender.com. تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIA (R01AG060919) ومنحة NSF (2030348) إلى FS.
Materials
| Embryo extraction | |||
| 1 curved point forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | Dumont |
| 1 fine surgical scissor | Fine Science Tools | 14058-11 | Dumont |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 2 straight fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont |
| 60 mm Petri dish | Corning | 430196 | |
| 70% ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2801 | Ethanol 190 Proof |
| Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| Bench pads | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Cell Culture | |||
| Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Enzyme A | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Enzyme P | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| GG-12-1.5, 12 mm dia.#1.5 thick 100 pc cell culture tested German coverglasses | Neuvitro Corporation | GG-12-15 | |
| Gibco B-27 Supplement 10 mL | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Gibco Basal Medium Eagle (BME) 500 mL | ThermoFisher | 21010046 | (+) Earle's Salts, (-) L-Glutamine |
| Gibco HBBS (1x) Hanks' Balanced Salt Solution 500 mL | ThermoFisher | 14025092 | Calcium, Magnesium, No phenol red |
| Gibco HI FBS 100 mL | ThermoFisher | 16140-063 | |
| Gibco L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030-081 | |
| Gibco Penicilline/Streptomicine | ThermoFisher | 15140-122 | 10,000 U/mL |
| Gibco Sodium Pyruvate (100 mM) 100 mL | ThermoFisher | 11360070 | |
| MiniMACS Separator and Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 0.25 μg/106 cells |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neaubeaur-Improved Brightline 100 µm Chamber | Hausser Scientific | 3120 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Neuronal Culture Medium 500 mL | ThermoFisher | 88283 | |
| Non-Neuronal Cell Biotin-Antibody Cocktail mouse 1 mL | Miltenyi Biotec | 130-115-389 | |
| Olympus SZ61 Zoom Stereomicroscope | Olympus Life Science | SZ61/SZ51 | |
| Pierce Primary Neuron Isolation Kit | ThermoFisher | 88280Y | |
| Staining | |||
| Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32766 | 1 : 500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32790 | 1 : 500 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma Aldrich | MFCD00131855 | |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647 | ThemoFisher | A32933 | 1 : 500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A11037 | 1 : 200 |
| Invitrogen Leptin Receptor Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (JA73-01) | ThermoFisher | MA5-32685 | 1 : 500 |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 1 : 500 |
| POMC Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D3R1U | 1 : 500 |
| PSD95 (D74D3) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D74D3#3409 | 1 : 500 |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher | S11227 | 1 : 500 |
| Synapsin 1 Monoclonal Antibody (7H10G6) | ThermoFisher | MA5-31919 | 1 : 500 |
| Vectashield Plus Antifade Mountina Medium with DAPI 10 mL | Vector Laboratories | H-2000 |
References
- Cone, R. D. Anatomy and regulation of the central melanocortin system. Nature Neuroscience. 8 (5), 571-578 (2005).
- Clarke, I. J. Hypothalamus as an endocrine organ. Comprehensive Physiology. 5 (1), 217-253 (2015).
- Mignot, E., Taheri, S., Nishino, S. Sleeping with the hypothalamus: emerging therapeutic targets for sleep disorders. Nature Neuroscience. 5 Suppl, 1071-1075 (2002).
- Baird, A. D., Wilson, S. J., Bladin, P. F., Saling, M. M., Reutens, D. C. Neurological control of human sexual behaviour: insights from lesion studies. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 78 (10), 1042-1049 (2007).
- Caria, A., Dall, O. G. Functional neuroimaging of human hypothalamus in socioemotional behavior: a systematic review. Brain Sciences. 12 (6), 707 (2022).
- Andermann, M. L., Lowell, B. B. Toward a wiring diagram understanding of appetite control. Neuron. 95 (4), 757-778 (2017).
- Romanov, R. A., Alpar, A., Hokfelt, T., Harkany, T. Unified classification of molecular, network, and endocrine features of hypothalamic neurons. Annual Review of Neuroscience. 42, 1-26 (2019).
- Hajdarovic, K. H., Yu, D., Webb, A. E. Understanding the aging hypothalamus, one cell at a time. Trends in Neurosciences. 45 (12), 942-954 (2022).
- Zhang, Y. H., et al. Cascade diversification directs generation of neuronal diversity in the hypothalamus. Cell Stem Cell. 28 (8), 1483-1499 (2021).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-cell RNA-seq reveals hypothalamic cell diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Ma, C., et al. Neural pathways from hypothalamic orexin neurons to the ventrolateral preoptic area mediate sleep impairments induced by conditioned fear. Frontiers in Neuroscience. 17, 1122803 (2023).
- Wang, F., et al. A parabrachial to hypothalamic pathway mediates defensive behavior. Elife. 12, e85450 (2023).
- Cowley, M. A., et al. Leptin activates anorexigenic POMC neurons through a neural network in the arcuate nucleus. Nature. 411 (6836), 480-484 (2001).
- Parekh, R. U., et al. Hypothalamic kinin B1 receptor mediates orexin system hyperactivity in neurogenic hypertension. Scientific Reports. 11 (1), 21050 (2021).
- Schmidt, C. X., Tsang, A. H., Oster, H. Generation of mouse primary hypothalamic neuronal cultures for circadian bioluminescence assays. Bio-protocol. 11 (5), e3944 (2021).
- Foo, L. C. . Purification of rat and mouse astrocytes by immunopanning. 2013 (5), 421-432 (2013).
- Emery, B., Dugas, J. C. . Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. 2013 (9), 854-868 (2013).
- Zhao, H., et al. Changes of constituents and activity to apoptosis and cell cycle during fermentation of tea. International Journal of Molecular Sciences. 12 (3), 1862-1875 (2011).
- Zhang, Z. M., et al. Down-regulation of human leukocyte antigens class I on peripheral T lymphocytes and NK cells from subjects in region of high-incidence gastrointestinal tumor. Chinese Medical Journal. 124 (12), 1813-1817 (2011).
- Drake, S. S., Zaman, A., Simas, T., Fournier, A. E. Comparing RNA-sequencing datasets from astrocytes, oligodendrocytes, and microglia in multiple sclerosis identifies novel dysregulated genes relevant to inflammation and myelination. WIREs Mechanisms of Disease. 15 (2), e1594 (2023).
- Mattanovich, D., Borth, N. Applications of cell sorting in biotechnology. Microbial Cell Factories. 5, 12 (2006).
- Cottrell, E. C., et al. Developmental changes in hypothalamic leptin receptor: relationship with the postnatal leptin surge and energy balance neuropeptides in the postnatal rat. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296 (3), R631-R639 (2009).
