Hormonal, Metabolik ve Elektriksel Düzenleme Çalışmaları için Hedeflenen Hipotalamik Nöronların İzolasyonu

NOT: Deneysel prosedürün genel bir görünümü Şekil 1A’da grafiksel olarak gösterilmiştir. Bu çalışmada farelerle yapılan tüm deneyler kurumumuzun Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bir veterinerin bakımı altında, Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) onaylı vivaryumda barındırılan 3 aylık C57BL6 / J farelerini kullandık. Fareler, 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsü ile büyük kafeslerde yaşadılar ve ad libitum ile beslendiler. 1. Gebe kalma ve hamilelik doğrulaması Üreme için herhangi bir geçmişe ve ilgilenilen genotipe sahip fareleri yerleştirin. Gebe kalmadan önce dişinin tarihini ve ağırlığını kaydedin. 6 saat sonra, dişiyi problu bir plak için inceleyin. Plak varsa, dişiyi erkekten ayırın. Plak yoksa, dişiyi ertesi güne kadar kafeste tutun, ardından fareleri ayırın. Gebe kaldıktan sonraki 7, 10 ve 14. günlerde, hamileliği doğrulamak için kadını tartın. 2. Ortam, 24 oyuklu plaka ve malzeme hazırlama Hücre izolasyonu gününde, kullanıma hazır, poli-D-lizin kaplı cam lameller (Malzeme Tablosuna bakınız) 24 oyuklu bir plakaya aşağıdaki gibi yerleştirin:Biyolojik bir kaputun altında, 15 lamel içeren tek bir paketi etanol ile sterilize edin ve kurumaya bırakın. Paketi açın ve lamelleri 60 mm’lik bir plakaya yerleştirin. Lamelleri ayırmak için plakayı yatay olarak sallayın. Ardından, 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirilecek tek lamel almak için plakayı ters çevirin. Lamelleri bir kez 1.0 mL steril Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) ile 5 dakika yıkayın. Bu arada, 20.0 mL kaplama ortamını aşağıdaki gibi hazırlayın: 1.0 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 18.31 mL BME’ye (Bazal Orta Kartal, + Earle Tuzları), 200 μL sodyum piruvat (100x stoktan), 200 μL glutamin (200 nM stoktan) ve 100 μL penisilin / streptomisin (200x stoktan). Kuyucuklardaki HBSS’yi 1.0 mL kaplama ortamıyla değiştirin ve plakayı 37 °C’de inkübatöre yerleştirin. Bir Bunsen brülörü kullanarak, üç Pasteur pipetini azalan çaplarda ateşle parlatın. Pipeti bir elinizle tutarak, ucu aleve sokun ve hızlıca çıkarın. Uç düzleşene ve çap istenen çapa (gözle değerlendirilen) düşene kadar işlemi tekrarlayın. 3. Nöral Dissosiyasyon kitinin talimatlarını izleyerek Nöral Doku Dissosiyasyonu için reaktif hazırlama Sindirim Tamponu 1’i oda sıcaklığında ısıttıktan sonra, 50 μL Enzim 1’i 1.91 mL Tampon 1 ile karıştırarak Enzim Karışımı 1’i ve 15 μL Enzim 2’yi 30 μL Sindirim Tamponu 2 ile karıştırarak Enzim Karışımı 2’yi hazırlayın. Karışımlar tüm embriyoların beyin dokusu için kullanılmak üzere yeterlidir. HBSS’de% 0.5 Sığır Serum Albümini (BSA) hazırlayın, örneğin, 50.0 mL HBSS’de 0.25 g. 4. Embriyo ekstraksiyonu İki düz ince forseps, bir kavisli nokta forseps ve bir çift ince cerrahi makası otoklavlayın ve kullanmadan önce etanol ile sterilize edin. Ardından, Petri kaplarını HBSS ile doldurun. CO2 odasında bir E14-E16 hamile barajına ötenazi yapın ve servikal çıkık yapın.NOT: Steril koşullar altında kaputun altında aşağıdaki adımlar gerçekleştirilmelidir: Karnı% 70 etanol ile sterilize edin. Karın boşluğunu kasık simfizinden göğüs kafesinin ksifoid sürecine cerrahi makas ve forseps ile kesin. Rahim boynuzunu çıkarın ve buz gibi HBSS ile doldurulmuş 100 mm’lik bir tabağa koyun ve iyice yıkayın. Tüm embriyoları uterustan ince forseps ile çıkarın ve ayırın. İnce cerrahi makas ve/veya forseps ile embriyoların başını hızla dekapite edin. Kafaları HBSS ile doldurulmuş 60 mm’lik Petri kabına yerleştirin. 5. Hipotalamus ekstraksiyonu, toplanması ve doku ayrışması Beyni tutmak için göz boşluğuna ince bir forseps yerleştirin. Diğer ince forsepsleri kullanarak, beyin görünene kadar soyarak cildi ve kafatasını çıkarın. Beyni beyaz görünümüne göre diğer dokulardan ayırt edin. Deri ve kafatası pembe renktedir ve damar sistemi bakımından zengindir. Kavisli nokta forsepslerini kullanarak beyni kafatasından çıkarın ve beyni koku ampullerinden çıkararak baş aşağı çevirin. Şimdi korteks ventraldir ve hipotalamus üst yüzeyde dorsal olarak görülebilir (Şekil 1B). Kavisli forseps ile, beyin beyaz ve berrak görünene kadar meninks ve kan damarları tabakasını çıkarın. Kavisli forseps ile hipotalamik alanı beynin geri kalanından ayırın. Hipotalamusu 3-4 küçük parçaya bölün ve bir pipet ile parçaları 15 mL’lik bir tüpe aktarın. Tüp buz üzerindeyken diğer embriyolar için adımları tekrarlayın. Tüpü 6.0 mL HBSS ile doldurun ve dokunun yerleşmesine izin verin, süpernatanı çıkarın ve Enzim Karışımı 1’i ekleyin. Dokuyu önlemek için tüpü hafifçe karıştırın ve çalkalayın. Tüpü 37 ° C’lik bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin ve dokuyu yeniden süspanse etmek için her 5 dakikada bir çalkalayın. 15 dakika sonra 30 μL Enzim karışımı 2 ekleyin. En büyük çapa (<1 mm) sahip pipet Pasteur'ü kullanarak beyin dokusunu ayrıştırın. Kabarcık oluşturmadan 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyin. Su banyosunda 37 °C’de 10 dakika inkübe edin. Dokuyu her 5 dakikada bir yeniden süspanse etmek için tüpü hafifçe çalkalayın. 10 dakika sonra, kalan 15 μL Enzim karışımı 2’yi ekleyin. Dokuyu 10x, çapı azalan diğer iki ateşle parlatılmış pipetle, kabarcıklar oluşturmadan yukarı ve aşağı ayırın. Ayrışmış dokuya sahip tüpe hemen 10.0 mL HBSS-% 0.5 BSA ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 × g’da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 1.0 mL HBS-% 0.5 BSA içinde yeniden süspanse edin. 6. Hücre sayımı HBSS-0.5% BSA kullanarak hücre süspansiyonunu 1:5 oranında seyreltin. 10 μL seyreltilmiş hücre süspansiyonunu bir Neubauer sayım odasına yerleştirin. Parlak alan mikroskobu altında, yalnızca dört odanın köşe karelerinde bulunan hücreleri sayın. Ortalamayı hesaplayın ve 5 × 104 ile çarpın.NOT: Hücre izolasyonuna devam etmek için >106 hücre olduğundan emin olun; En uygun hücre sayısı 107’dir. 7. Negatif seçim NOT: Negatif seçim, kullanıcıların nöronal ve nöronal olmayan hücreleri ayırarak saf bir birincil nöron kültürü elde etmelerini sağlar. Önceden soğutulmuş çözeltiler kullanın. Hücre süspansiyonunu 3 dakika boyunca 300 × g’da santrifüjleyin (santrifüj 10 dakikaya kadar uzatılabilir). Süpernatanı nazikçe aspire edin ve peleti 80 μL HBSS-%0.5 BSA’da 107 hücre konsantrasyonuna yeniden süspanse edin. 20 μL Non-Nöronal Hücre Biotin-Antikor Kokteyli ekleyin ve 4 °C’de 5 dakika inkübe edin. Serbest antikoru çıkarmak için hücreleri 2.0 mL HBSS-% 0.5 BSA ile yıkayın ve 3 dakika boyunca 300 × g’da santrifüjleyin. Süpernatanı nazikçe aspire edin ve peleti 80 μL HBSS-%0.5 BSA içinde yeniden süspanse edin. 20 μL anti-biyotin Mikro boncuklar ekleyin, iyice karıştırın ve 4 °C’de 10 dakika inkübe edin. 10 7 hücreye kadar 0,5 mL HBSS-%0,5 BSA ekleyin ve manyetik kolon hazır olana kadar bekleyin. 8. Manyetik ayırma, negatif seçim NOT: Manyetik ayırma, nöronal olmayan hücrelerin nöronal hücrelerden ayrılmasını sağlayan çok önemli bir adımdır. Nöronal ve nöronal olmayan hücreleri içeren örnek manyetik alandan geçirilir ve bir biyotin-antikor-manyetik boncuk kompleksine bağlı olan nöronal olmayan hücreler kolonda tutulur (Şekil 1C). Serbest nöronal hücreler kolondan ayrıştırılır ve 15 mL’lik bir tüpte toplanır. Standı (kite dahildir) ayırıcı ve MS sütunu ile Şekil 1C’de gösterildiği gibi hazırlayın. Sütunu açın ve standı yalnızca hücreler ayrılmaya hazır olduğunda kurun. Kolonu 0,5 mL HBSS-% 0,5 BSA ile durulayın. Çözelti damlaması durana kadar bekleyin. Nöronal hücreleri toplamak için, kolonun altına 15 mL’lik bir tüp yerleştirin ve 0.5 mL hücre süspansiyonunu kolondan geçirin. Elüatı damlamayı durdurana kadar tüpte toplayın. Artık nöronal hücreleri yakalamak için, 3 x 0.5 mL HBSS-0.5% BSA sütununu yıkayın. Nöronal olmayan hücreleri toplamak için, sütunu mıknatıstan çıkarın ve 15 ml’lik yeni bir tüpün içine yerleştirin. Kolona 1.0 mL HBSS -% 0.5 BSA ekleyin ve manyetik olarak etiketlenmiş nöronal olmayan hücreleri toplamak için pistonu kullanın. Nöronal ve nöronal olmayan hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g’da santrifüjleyin. Süpernatanı nazikçe aspire edin ve hücreleri 1.0 mL HBSS-% 0.5 BSA’da yeniden süspanse edin. Hücreleri daha önce bölüm 6’da açıklandığı gibi sayın. Gerekirse, nöronal olmayan hücreleri 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin; aksi takdirde onları atın. 9. Pozitif seçim NOT: Saf bir nöronal hücre süspansiyonu elde edildikten sonra, hedeflenen hücreleri izole etmek için pozitif seçim gerçekleştirilir. Hücreler, bir yüzey antijeni için spesifik bir biyotin konjuge antikor kullanılarak izole edilebilir. Antikor, anti-biyotin manyetik boncuklar tarafından tanınır. Hücre süspansiyonunu kolondan akıtarak, manyetik alanda sadece ilgilenilen hücreler tutulur. Saf nöronal hücre süspansiyonunu 300 × g’da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı nazikçe aspire edin ve peleti 80 μL HBSS-%0.5 BSA içinde yeniden süspanse edin. Üreticinin talimatlarını izleyerek spesifik antikoru ekleyin ve 4 °C’de 10 dakika inkübe edin.NOT: LepR’yi eksprese eden hücreler aranırsa, 0.50 μg/106 hücre konsantrasyonunda bir Fare Leptin R Biyotinillenmiş Antikoru (Malzeme Tablosuna bakınız) öneririz. Fazla antikoru 2.0 mL HBSS-% 0.5 BSA ile yıkayın ve 300 × g’da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, peleti 80 μL HBSS-%0.5 BSA içinde yeniden süspanse edin ve 20 μL anti-biyotin mikro boncukları ekleyin. 4 °C’de 10 dakika inkübe edin. Her 107 hücre için 0,5 mL HBSS-%0,5 BSA ekleyin ve manyetik kolon hazır olana kadar bekleyin. 10. Manyetik ayırma, pozitif seçim Standı ayırıcı ve MS sütunu ile hazırlayın. MS kolonunu 0,5 mL HBSS-%0,5 BSA ile durulayın. Damlama durana kadar bekleyin. Kolonun altına 15 mL’lik bir tüp yerleştirin, 0.5 mL hücre süspansiyonunu kolondan geçirin ve spesifik olmayan nöronal hücreleri içeren elüatı toplayın. Kalıntı spesifik olmayan nöronal hücrelerin kolonunu temizlemek için 3 x 0.5 mL HBSS-% 0.5 BSA ile yıkayın. Kolonu mıknatıstan çıkarın, 15 mL’lik yeni bir tüpe yerleştirin ve 1.0 mL HBSS-%0.5 BSA ekleyin. Hedeflenen hücreleri temizlemek için pistonu kullanın. Her iki tüpü de 300 × g’da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yavaşça çıkarın ve 0,5 mL kaplama ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri daha önce bölüm 6’da açıklandığı gibi sayın. Daha önce bölüm 2’de tarif edildiği gibi hazırlanan 24 oyuklu plakada 120.000-200.000 hücre/mm3 yoğunlukta pozitif kontrol olarak hedeflenen hücreleri ve negatif kontrol olarak spesifik olmayan hücreleri plaka ve 12 saat boyunca %5 CO2, %9O2 ve nemde 37 °C’de inkübe edin. 11. Hücre kültürü bakımı 19.2 mL Nöronal Kültür Ortamı, 400 μL B27 takviyesi (50x stoktan), 200 μL glutamin (200 μM stoktan) ve 100 μL penisilin / streptomisin (200x stoktan) ile 20 mL kültür ortamı hazırlayın. Nöronal veya nöronal olmayan hücreler içeren 24 kuyulu plakadan kaplama ortamını değiştirin. 2 x 1.0 mL HBSS ile yıkayın. 1.0 mL kültür ortamı ekleyin. 0,5 mL eski ortamı 0,5 mL yeni ortamla değiştirerek ortamı her 2/3 günde bir yenileyin.NOT: Hücreler kültürde tutulabilir ve in vitro (DIV21) 21 güne kadar kullanılabilir. 12. Nöron immünofloresan boyama Boyamadan on iki saat önce 50/50 metanol ve asetondan oluşan bir çözelti hazırlayın ve gece boyunca -20 °C’de soğutun. 24 oyuklu plakadaki nöronları 2 x 1.0 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 5 dakika boyunca yıkayın. PBS çözeltisini 1.0 mL 50/50 çözeltisi ile değiştirin ve 20 dakika buzda inkübe edin. 1x PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın. Nöronları oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1x PBS’de% 3 BSA ile bloke edin. Üreticinin talimatlarında belirtilen antikor konsantrasyonunu kullanarak 1x PBS’de% 3 BSA’da birincil antikor çözeltisini hazırlayın. Kullanılan antikorlar ve konsantrasyonlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Bloke edici çözeltiyi birincil antikor çözeltisi ile değiştirin ve gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Hücreleri 1x PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın. İkincil antikor çözeltisini, üreticinin talimatlarını izleyerek antikor konsantrasyonlarını kullanarak 1x PBS’de% 3 BSA ile hazırlayın. Kullanılan ikincil antikorlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Hücreleri ikincil antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Hücreleri 1x PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın. Montaj prosedürü sırasında nöronları 1x PBS’de bırakın. Mikroskop lamına küçük bir damla montaj ortamı (nükleer tanımlama için 4′,6-diamidino-2-fenilindol ile veya olmadan) yerleştirin. Forsepsli nöronlar içeren bir cam lamel çıkarın ve fazla PBS’yi kurutmak için lamel kenarına bir kağıt mendil üzerine hafifçe vurun. Nöronların mikroskop slaytlarına baktığından emin olarak montaj ortamındaki lamel çevirin; Fazla montaj ortamını kağıt mendille hafifçe bastırın ve çıkarın. Mikroskop slaytları, parlak alan veya konfokal mikroskop ile analiz edilmeye hazırdır.