Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon-Görüntüleme Kütle Spektrometrisi Analizi için Sert Palmiye Tohumlarının Hazırlanması
Summary
Bu protokol, MALDI-IMS analizi için düşük su içeriğine sahip sert tohum numune kesitlerinin hazırlanması, analitlerin orijinal dağılımının ve bolluğunun korunması ve yüksek kaliteli sinyal ve uzamsal çözünürlük sağlanması hakkında ayrıntılı rehberliği tanımlamayı amaçlamıştır.
Abstract
Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon görüntüleme kütle spektrometrisi (MALDI-IMS), bileşikleri doğal ortamlarında tanımlamak için uygulanır. Şu anda, MALDI-IMS klinik analizlerde sıklıkla kullanılmaktadır. Yine de, bitki dokularındaki kimyasal bileşiklerin fizyolojik bilgilerini anlamak için bu tekniği daha iyi uygulamak için mükemmel bir bakış açısı mevcuttur. Bununla birlikte, MALDI-IMS, uygun veri toplama ve başarılı analiz için ince dilimler (12-20 μm) gerektirdiğinden, botanik materyallerden belirli numuneler için hazırlık zor olabilir. Bu anlamda, daha önce, Euterpe oleracea (açaí palmiyesi) sert tohumlarının ince kesitlerini elde etmek için bir numune hazırlama protokolü geliştirdik ve bunların MALDI-IMS ile moleküler haritalanmasını sağladık.
Burada, geliştirilen protokolün aynı cinsten diğer tohumların hazırlanması için uygun olduğunu gösteriyoruz. Kısaca protokol, tohumların 24 saat boyunca deiyonize suya batırılmasına, numunelerin jelatin ile gömülmesine ve iklimlendirilmiş bir kriyostatta bölümlere ayrılmasına dayanıyordu. Daha sonra, matris biriktirme için, bir xy hareket platformu, 1:1 (h/h) 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) ve 30 mg/mL’de %0.1 trifloroasetik asit içeren metanol çözeltisi kullanılarak bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) iğne spreyine bağlandı. E. precatoria ve E. edulis tohum verileri, metabolit modellerini haritalamak için yazılım kullanılarak işlendi.
Heksoz oligomerleri, bu numuneler için protokolün yeterliliğini kanıtlamak için numune dilimleri içinde haritalandı, çünkü bu tohumların büyük miktarlarda mannan içerdiği bilinmektedir. Sonuç olarak, [M + K]+ (Δ = 162 Da) eklentileri ile temsil edilen heksoz oligomerlerinin zirveleri tanımlandı. Böylece, daha önce E. oleracea tohumları için özel olarak geliştirilen numune hazırlama protokolü, diğer iki sert palmiye tohumunun MALDI-IMS analizini de mümkün kıldı. Kısacası, yöntem, özellikle kesilmeye dayanıklı numunelerden botanik materyallerin morfo-anatomisi ve fizyolojisi üzerine araştırmalar için değerli bir araç oluşturabilir.
Introduction
Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon-görüntüleme kütle spektrometrisi (MALDI-IMS), iki boyutlu biyomolekül atamasına izin veren, iyonlaşabilir bileşiklerin hedefsiz araştırılmasını sağlayan ve özellikle biyolojik örneklerde uzamsal dağılımlarını belirleyen güçlü bir yöntemdir 1,2. Yirmi yıldır bu teknik, lipitlerin, peptitlerin, karbonhidratların, proteinlerin, diğer metabolitlerin ve terapötik ilaçlar gibi sentetik moleküllerin eşzamanlı olarak saptanmasını ve tanımlanmasını sağlamıştır 3,4. MALDI-IMS, biyolojik numunelerin ekstraksiyonu, saflaştırılması, ayrılması, etiketlenmesi veya boyanması olmadan bir doku numunesi yüzeyinde kimyasal analizi kolaylaştırır. Bununla birlikte, başarılı bir analiz için, bu teknikte çok önemli bir adım, özellikle çevresel iklimlendirme nedeniyle yaygın karmaşık organlara özelleşmiş ve modifiye edilmiş bitki dokularında numune hazırlamadır5.
Doğal bitki dokusu fizikokimyasal özellikleri nedeniyle, MALDI-IMS analizinin gerekliliklerine uyacak ve kesit hazırlığı sırasında dokunun orijinal şeklini koruyacak uyarlanmış bir protokole ihtiyaç vardır 6,7. Tohumlar gibi geleneksel olmayan numuneler söz konusu olduğunda, bu dokular sert hücre duvarlarına ve düşük su içeriğine sahip olduğundan, oluşturulan protokoller8 uygulanamaz, bu da kolayca kesit parçalanmasına neden olabilir ve bileşik delokalizasyonayol açabilir 9.
Araştırma grubumuz, kiralanabilir açai posasının üretimi sırasında yüksek miktarlarda üretilen bir yan ürün olan açai (Euterpe oleracea Mart.)tohumu 10,11,12’nin moleküler haritalama ve MALDI-IMS analizi için uyarlanmış bir protokol hakkında deneysel veriler yayınlamıştır13. Buradaki fikir, açai tohumlarındaki farklı metabolitlerin yerinde haritalanması için bir protokol geliştirmek ve şu anda ticari olarak araştırılmayan bu tarımsal atıklar için olası kullanımları önermeye yardımcı olmaktı. Bununla birlikte, açai tohumunun direnci nedeniyle, MALDI-IMS analizinden uygun numune kesiti elde etmek için özel bir protokol yapılması gerekiyordu.
Bu bağlamda, ekonomik açıdan önemli olan açai posası, benzer duyusal özelliklere sahip Euterpe cinsi palmiye ağaçlarından elde edilen diğer meyvelerin artan ticarileşmesini motive etmiştir. Açaí 14,15’e alternatif olarak endüstriyel ölçekte üretilen iki palmiye ağacının meyvesi, Amazon kurak alanında yetişen E. precatoria (açaí-do-amazonas olarak bilinir) ve Atlantik Ormanı’ndan tipik olan E. edulis (juçara olarak bilinir). Bununla birlikte, açaí-do-amazonas ve juçara tüketimi, mevcut olmayan ve ayrıntılı kimyasal bileşimleri ile ilgili olarak şimdiye kadar çalışılmamış olan aynı dirençli ve yenmeyen tohum birikimine yol açmaktadır.
Bu nedenle, daha önce tasarlanan protokolün, MALDI-IMS tarafından moleküler haritalama için E. precatoria ve E. edulis tohumlarını analiz etmek için birkaç uyarlama ile kullanılabileceğini ve bu kaynakların bileşiminin analizi için kullanılabilecek güçlü bir araç olduğunu kanıtladığını ve potansiyel biyoteknolojik kullanımlarını belirlemeye yardımcı olabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, burada verilen ayrıntılı açıklama, MALDI-IMS analizi için dirençli malzemelerin hazırlanmasında benzer zorluklar yaşayan diğer kişilere yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bitkiler, belirli biyokimyasal işlevler için özel dokulardan oluşur. Bu nedenle, numunelerin yüksek kaliteli sinyal ve uzamsal çözünürlük için orijinal analit dağılımını ve bolluğunu koruması gerektiğinden, MALDI-IMS için numune hazırlama protokolü, spesifik fizikokimyasal özelliklere sahip çeşitli bitki dokularına göre tasarlanmalıdır8.
MALDI-IMS analizinden önce, numunelerin uygun şekilde toplanması ve saklanması öncelikli olarak dü?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Serrapilheira Enstitüsü (Serra-1708-15009) ve Carlos Chagas Filho Rio de Janeiro Eyaletindeki Araştırmaları Destekleme Vakfı (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021) tarafından finanse edilmiştir. Serrapilheira Enstitüsü ve Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Kalkınma Konseyi (CNPq), Dr. Felipe Lopes Brum ve Dr. Gabriel R. Martins’e (Kurumsal Kapasite Geliştirme Programı/INT/MCTI) burs verdi. Yüksek Öğretim Personelinin Geliştirilmesi Koordinasyonu (CAPES), Bay Davi M. M. C. da Silva’ya Yüksek Lisans bursu verdiği için kabul edilmektedir. Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ), MALDI-IMS analizleri ile sağlanan hizmetler için tanınmaktadır ve Bay Alan Menezes do Nascimento ve Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT), MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ hibe Nº 442604/2019 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
References
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry. , (2017).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andrén, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Zaima, N., Hayasaka, T., Goto-Inoue, N., Setou, M. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 5040-5055 (2010).
- Qin, L., et al. Recent advances in matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) for in Situ analysis of endogenous molecules in plants. Phytochemical Analysis. 29 (4), 351-364 (2018).
- Bhandari, D. R., et al. High resolution mass spectrometry imaging of plant tissues: Towards a plant metabolite atlas. Analyst. 140 (22), 7696-7709 (2015).
- Boughton, B. A., Thinagaran, D., Sarabia, D., Bacic, A., Roessner, U. Mass spectrometry imaging for plant biology: a review. Phytochemistry Reviews. 15 (3), 445-488 (2016).
- Dong, Y., et al. Sample preparation for mass spectrometry imaging of plant tissues: a review. Frontiers in Plant Science. 7, 60 (2016).
- Zhang, Y. X., Zhang, Y., Shi, Y. P. A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals. Food Chemistry. 398, 133911 (2023).
- Brum, F. L., Martins, G. R., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. The acquisition of thin sections of açaí (Euterpe oleracea Mart.) seed with elevated potassium content for molecular mapping by mass spectrometry imaging. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , e9474 (2023).
- Martins, G. R., et al. Chemical characterization, antioxidant and antimicrobial activities of açaí seed (Euterpe oleracea Mart.) extracts containing A- and B-type procyanidins. LWT. 132, 109830 (2020).
- Martins, G. R., et al. Phenolic profile and antioxidant properties in extracts of developing açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (51), 16218-16228 (2022).
- Jorge, F. T. A., Silva, A. S. A., Brigagão, G. V. Açaí waste valorization via mannose and polyphenols production: techno-economic and environmental assessment. Biomass Conversion and Biorefinery. , (2022).
- Carvalho, L. M. J., Esmerino, A. A., Carvalho, J. L. V. Jussaí (Euterpe edulis): a review. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Yamaguchi, K. K. d. L., Pereira, L. F. R., Lamarão, C. V., Lima, E. S., Veiga-Junior, V. F. d. Amazon acai: chemistry and biological activities: A Review. Food Chemistry. 179, 137-151 (2015).
- Wu, R., et al. Copper adhesive tape attached to the reverse side of a non-conductive glass slide to achieve protein MALDI-imaging in FFPE-tissue sections. Chemical Communications. 57 (82), 10707-10710 (2021).
- Dufresne, M., Patterson, N. H., Norris, J. L., Caprioli, R. M. Combining salt doping and matrix sublimation for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of neutral lipids. Analytical Chemistry. 91 (20), 12928-12934 (2019).
- Aguiar, M. O., de Mendonça, M. S. Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart (Palmae). Revista Brasileira de Sementes. 25, 37-42 (2003).
- Panza, V., Láinez, V., Maldonado, S. Seed structure and histochemistry in the palm Euterpe edulis. Botanical Journal of the Linnean Society. 145 (4), 445-453 (2004).
- Alves, V. M., et al. Provenient residues from industrial processing of açaí berries (Euterpe precatoria Mart): nutritional and antinutritional contents, phenolic profile, and pigments. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Inada, K. O. P., et al. Screening of the chemical composition and occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) and jussara (Euterpe edulis) fruits and their fractions. Journal of FunctionalFoods. 17, 422-433 (2015).
- Monteiro, A. F., Miguez, I. S., Silva, J. P. R. B., Silva, A. S. High concentration and yield production of mannose from açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds via mannanase-catalyzed hydrolysis. Scientific Reports. 9 (1), 10939 (2019).
