يهدف هذا البروتوكول إلى وصف إرشادات مفصلة حول تحضير أقسام عينات البذور الصلبة ذات المحتوى المائي المنخفض لتحليل نظام الرصد الدولي MALDI-IMS ، والحفاظ على التوزيع الأصلي للتحليلات ووفرتها وتوفير إشارة عالية الجودة ودقة مكانية.
يتم تطبيق قياس الطيف الكتلي للامتزاز بالليزر / تصوير التأين بمساعدة المصفوفة (MALDI-IMS) لتحديد المركبات في بيئاتها الأصلية. وكثيرا ما يستخدم نظام الرصد الدولي حاليا في التحليل السريري. ومع ذلك ، يوجد منظور ممتاز لتطبيق هذه التقنية بشكل أفضل لفهم المعلومات الفسيولوجية للمركبات الكيميائية في الأنسجة النباتية. ومع ذلك، قد يكون التحضير صعبا بالنسبة لعينات محددة من المواد النباتية، حيث يتطلب نظام الرصد الدولي التابع ل MALDI شرائح رقيقة (12-20 ميكرومتر) للحصول على البيانات المناسبة والتحليل الناجح. وبهذا المعنى، قمنا سابقا بتطوير بروتوكول تحضير العينات للحصول على مقاطع رقيقة من البذور الصلبة Euterpe oleracea (نخيل الأساي)، مما يتيح رسم الخرائط الجزيئية بواسطة MALDI-IMS.
هنا ، نظهر أن البروتوكول المطور مناسب لإعداد بذور أخرى من نفس الجنس. باختصار ، استند البروتوكول إلى غمر البذور في ماء منزوع الأيونات لمدة 24 ساعة ، وتضمين عينات بالجيلاتين ، وتقسيمها في جهاز تبريد متأقلم. بعد ذلك ، لترسب المصفوفة ، تم إقران منصة حركة xy برذاذ إبرة التأين بالرش الكهربائي (ESI) باستخدام حمض 1: 1 (v / v) 2،5-dihydroxybenzoic (DHB) ومحلول ميثانول مع 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك عند 30 مجم / مل. تمت معالجة بيانات بذور E. precatoria و E. edulis باستخدام برنامج لرسم خريطة لأنماط الأيض الخاصة بهم.
تم تعيين الأوليغومرات السداسية داخل شرائح العينة لإثبات كفاية البروتوكول لتلك العينات ، حيث من المعروف أن تلك البذور تحتوي على كميات كبيرة من المنان ، وهو بوليمر من المانوز السداسي. نتيجة لذلك ، تم تحديد قمم oligomers hex ، ممثلة ب [M + K] + adducts من (Δ = 162 Da). وهكذا، فإن بروتوكول تحضير العينات، الذي سبق تطويره خصيصا لبذور E. oleracea ، مكن أيضا من تحليل MALDI-IMS لبذرتين أخريين من بذور النخيل الصلب. باختصار ، يمكن أن تشكل الطريقة أداة قيمة للبحث في علم التشريح المورفولوجي وعلم وظائف الأعضاء للمواد النباتية ، خاصة من العينات المقاومة للقطع.
يعد قياس الطيف الكتلي للتصوير بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-IMS) طريقة قوية تسمح بتعيين جزيء حيوي ثنائي الأبعاد ، وتوفر فحصا غير مستهدف للمركبات المؤينة ، وتحدد توزيعها المكاني ، خاصة في العينات البيولوجية 1,2. على مدى عقدين من الزمن ، مكنت هذه التقنية من الكشف والتعرف في وقت واحد على الدهون والببتيدات والكربوهيدرات والبروتينات والمستقلبات الأخرى والجزيئات الاصطناعية مثل الأدوية العلاجية 3,4. يسهل MALDI-IMS التحليل الكيميائي في سطح عينة الأنسجة دون عوامل استخراج أو تنقية أو فصل أو وضع العلامات أو تلطيخ العينات البيولوجية. ومع ذلك ، من أجل التحليل الناجح ، فإن الخطوة المحورية في هذه التقنية هي تحضير العينة ، خاصة في الأنسجة النباتية ، المتخصصة والمعدلة إلى أعضاء معقدة واسعة الانتشار بسبب التأقلم البيئي5.
بسبب الخصائص الفيزيائية والكيميائية المتأصلة في الأنسجة النباتية ، هناك حاجة إلى بروتوكول مكيف ليناسب متطلبات تحليل MALDI-IMS والحفاظ على الشكل الأصلي للأنسجة أثناء تحضير التقسيم6،7. في حالة العينات غير التقليدية ، مثل البذور ، لا تنطبق البروتوكولات8 المعمول بها لأن هذه الأنسجة لها جدران خلوية صلبة ومحتوى مائي منخفض ، مما قد يتسبب بسهولة في تجزئة القسم ويؤدي إلى عدم تمركز المركب9.
نشرت مجموعتنا البحثية بيانات تجريبية حول رسم الخرائط الجزيئية وبروتوكولا معدلا لتحليل MALDI-IMS لبذور الأساي (Euterpe oleracea Mart.)10،11،12 ، وهو منتج ثانوي تم إنشاؤه بكميات كبيرة أثناء إنتاج لب الأساي القابل للتأجير13. كانت الفكرة هي تطوير بروتوكول لرسم الخرائط في الموقع لمختلف المستقلبات في بذور الأساي ، مما يساعد على اقتراح الاستخدامات الممكنة لهذه النفايات الزراعية التي لا يتم استكشافها تجاريا حاليا. ومع ذلك، ونظرا لمقاومة بذور الأساي، كان من الضروري وضع بروتوكول للحصول على تقسيم مناسب للعينات من تحليل نظام الرصد الدولي التابع لوزارة التنمية المحلية.
في هذا السياق ، حفز لب الأساي المهم اقتصاديا على زيادة تسويق الفواكه الأخرى من أشجار النخيل من جنس Euterpe ذات الخصائص الحسية المماثلة. ثمار شجرتي النخيل الناشئتين اللتين تم إنتاجهما على نطاق صناعي كبديل ل açaí14,15 هما E. precatoria (المعروفة باسم açaí-do-amazonas) ، التي تنمو في الأراضي الجافة في الأمازون ، و E. edulis (المعروفة باسم juçara) ، وهي نموذجية من غابة المحيط الأطلسي. ومع ذلك ، فإن استهلاك açaí-do-amazonas و juçara يؤدي إلى نفس التراكم للبذور المقاومة وغير الصالحة للأكل التي لم يتم الاستفادة منها ولم تتم دراستها حتى الآن فيما يتعلق بتركيبها الكيميائي المفصل.
وهكذا، فإننا نوضح هنا أن البروتوكول الذي سبق وضعه يمكن استخدامه، مع القليل من التعديلات، لتحليل بذور E. precatoria و E. edulis لرسم الخرائط الجزيئية بواسطة MALDI-IMS، مما يثبت أنه أداة قوية يمكن استخدامها لتحليل تكوين هذه الموارد ويمكن أن تساعد في تحديد استخداماتها المحتملة في مجال التكنولوجيا الحيوية. وعلاوة على ذلك، فإن الوصف التفصيلي المقدم هنا يمكن أن يساعد الآخرين الذين يواجهون صعوبات مماثلة في إعداد مواد مقاومة لتحليل نظام الرصد الدولي التابع لوزارة التنمية في المالديف.
تتكون النباتات من أنسجة متخصصة لوظائف كيميائية حيوية محددة. ولذلك، يجب تصميم بروتوكول تحضير العينات لنظام الرصد الدولي التابع ل MALDI-IMS وفقا لمختلف الأنسجة النباتية ذات الخواص الفيزيائية والكيميائية المحددة، حيث يجب أن تحافظ العينات على توزيعها الأصلي للتحليل ووفرتها للحصول على إشارة عا?…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا العمل من قبل معهد Serrapilheira (Serra-1708-15009) ، ومؤسسة Carlos Chagas Filho لدعم البحوث في ولاية ريو دي جانيرو (FAPERJ-JCNE-SEI-260003 / 004754 / 2021). قدم معهد Serrapilheira والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq) منحا دراسية للدكتور فيليبي لوبيز بروم والدكتور غابرييل ر. مارتينز (برنامج بناء القدرات المؤسسية / INT / MCTI). تم الاعتراف بالتنسيق من أجل تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES) لمنح منحة ماجستير للسيد دافي إم إم سي دا سيلفا. تم الاعتراف بمركز الطيف في ماساس دي بيولوجيكولاس (CEMBIO-UFRJ) للخدمات المقدمة مع تحليلات MALDI-IMS ، والسيد آلان مينيزيس دو ناسيمنتو ومركز Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT) ، بتمويل من MCTI / SISNANO / INT-CENANO-CNPQ منحة Nº 442604/2019 ، نشكرهم على تحليل التكوين الأولي.
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
Carbon double-sided conductive tape | |||
Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
Compressed air | |||
copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
Everhart-Thornley detector | |||
FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
Oil vacuum pump | |||
Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |