Summary

تحضير بذور النخيل الصلبة لتحليل قياس الطيف الكتلي بالليزر بمساعدة المصفوفة / تصوير التأين

Published: June 30, 2023
doi:

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى وصف إرشادات مفصلة حول تحضير أقسام عينات البذور الصلبة ذات المحتوى المائي المنخفض لتحليل نظام الرصد الدولي MALDI-IMS ، والحفاظ على التوزيع الأصلي للتحليلات ووفرتها وتوفير إشارة عالية الجودة ودقة مكانية.

Abstract

يتم تطبيق قياس الطيف الكتلي للامتزاز بالليزر / تصوير التأين بمساعدة المصفوفة (MALDI-IMS) لتحديد المركبات في بيئاتها الأصلية. وكثيرا ما يستخدم نظام الرصد الدولي حاليا في التحليل السريري. ومع ذلك ، يوجد منظور ممتاز لتطبيق هذه التقنية بشكل أفضل لفهم المعلومات الفسيولوجية للمركبات الكيميائية في الأنسجة النباتية. ومع ذلك، قد يكون التحضير صعبا بالنسبة لعينات محددة من المواد النباتية، حيث يتطلب نظام الرصد الدولي التابع ل MALDI شرائح رقيقة (12-20 ميكرومتر) للحصول على البيانات المناسبة والتحليل الناجح. وبهذا المعنى، قمنا سابقا بتطوير بروتوكول تحضير العينات للحصول على مقاطع رقيقة من البذور الصلبة Euterpe oleracea (نخيل الأساي)، مما يتيح رسم الخرائط الجزيئية بواسطة MALDI-IMS.

هنا ، نظهر أن البروتوكول المطور مناسب لإعداد بذور أخرى من نفس الجنس. باختصار ، استند البروتوكول إلى غمر البذور في ماء منزوع الأيونات لمدة 24 ساعة ، وتضمين عينات بالجيلاتين ، وتقسيمها في جهاز تبريد متأقلم. بعد ذلك ، لترسب المصفوفة ، تم إقران منصة حركة xy برذاذ إبرة التأين بالرش الكهربائي (ESI) باستخدام حمض 1: 1 (v / v) 2،5-dihydroxybenzoic (DHB) ومحلول ميثانول مع 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك عند 30 مجم / مل. تمت معالجة بيانات بذور E. precatoria و E. edulis باستخدام برنامج لرسم خريطة لأنماط الأيض الخاصة بهم.

تم تعيين الأوليغومرات السداسية داخل شرائح العينة لإثبات كفاية البروتوكول لتلك العينات ، حيث من المعروف أن تلك البذور تحتوي على كميات كبيرة من المنان ، وهو بوليمر من المانوز السداسي. نتيجة لذلك ، تم تحديد قمم oligomers hex ، ممثلة ب [M + K] + adducts من (Δ = 162 Da). وهكذا، فإن بروتوكول تحضير العينات، الذي سبق تطويره خصيصا لبذور E. oleracea ، مكن أيضا من تحليل MALDI-IMS لبذرتين أخريين من بذور النخيل الصلب. باختصار ، يمكن أن تشكل الطريقة أداة قيمة للبحث في علم التشريح المورفولوجي وعلم وظائف الأعضاء للمواد النباتية ، خاصة من العينات المقاومة للقطع.

Introduction

يعد قياس الطيف الكتلي للتصوير بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-IMS) طريقة قوية تسمح بتعيين جزيء حيوي ثنائي الأبعاد ، وتوفر فحصا غير مستهدف للمركبات المؤينة ، وتحدد توزيعها المكاني ، خاصة في العينات البيولوجية 1,2. على مدى عقدين من الزمن ، مكنت هذه التقنية من الكشف والتعرف في وقت واحد على الدهون والببتيدات والكربوهيدرات والبروتينات والمستقلبات الأخرى والجزيئات الاصطناعية مثل الأدوية العلاجية 3,4. يسهل MALDI-IMS التحليل الكيميائي في سطح عينة الأنسجة دون عوامل استخراج أو تنقية أو فصل أو وضع العلامات أو تلطيخ العينات البيولوجية. ومع ذلك ، من أجل التحليل الناجح ، فإن الخطوة المحورية في هذه التقنية هي تحضير العينة ، خاصة في الأنسجة النباتية ، المتخصصة والمعدلة إلى أعضاء معقدة واسعة الانتشار بسبب التأقلم البيئي5.

بسبب الخصائص الفيزيائية والكيميائية المتأصلة في الأنسجة النباتية ، هناك حاجة إلى بروتوكول مكيف ليناسب متطلبات تحليل MALDI-IMS والحفاظ على الشكل الأصلي للأنسجة أثناء تحضير التقسيم6،7. في حالة العينات غير التقليدية ، مثل البذور ، لا تنطبق البروتوكولات8 المعمول بها لأن هذه الأنسجة لها جدران خلوية صلبة ومحتوى مائي منخفض ، مما قد يتسبب بسهولة في تجزئة القسم ويؤدي إلى عدم تمركز المركب9.

نشرت مجموعتنا البحثية بيانات تجريبية حول رسم الخرائط الجزيئية وبروتوكولا معدلا لتحليل MALDI-IMS لبذور الأساي (Euterpe oleracea Mart.)10،11،12 ، وهو منتج ثانوي تم إنشاؤه بكميات كبيرة أثناء إنتاج لب الأساي القابل للتأجير13. كانت الفكرة هي تطوير بروتوكول لرسم الخرائط في الموقع لمختلف المستقلبات في بذور الأساي ، مما يساعد على اقتراح الاستخدامات الممكنة لهذه النفايات الزراعية التي لا يتم استكشافها تجاريا حاليا. ومع ذلك، ونظرا لمقاومة بذور الأساي، كان من الضروري وضع بروتوكول للحصول على تقسيم مناسب للعينات من تحليل نظام الرصد الدولي التابع لوزارة التنمية المحلية.

في هذا السياق ، حفز لب الأساي المهم اقتصاديا على زيادة تسويق الفواكه الأخرى من أشجار النخيل من جنس Euterpe ذات الخصائص الحسية المماثلة. ثمار شجرتي النخيل الناشئتين اللتين تم إنتاجهما على نطاق صناعي كبديل ل açaí14,15 هما E. precatoria (المعروفة باسم açaí-do-amazonas) ، التي تنمو في الأراضي الجافة في الأمازون ، و E. edulis (المعروفة باسم juçara) ، وهي نموذجية من غابة المحيط الأطلسي. ومع ذلك ، فإن استهلاك açaí-do-amazonas و juçara يؤدي إلى نفس التراكم للبذور المقاومة وغير الصالحة للأكل التي لم يتم الاستفادة منها ولم تتم دراستها حتى الآن فيما يتعلق بتركيبها الكيميائي المفصل.

وهكذا، فإننا نوضح هنا أن البروتوكول الذي سبق وضعه يمكن استخدامه، مع القليل من التعديلات، لتحليل بذور E. precatoria و E. edulis لرسم الخرائط الجزيئية بواسطة MALDI-IMS، مما يثبت أنه أداة قوية يمكن استخدامها لتحليل تكوين هذه الموارد ويمكن أن تساعد في تحديد استخداماتها المحتملة في مجال التكنولوجيا الحيوية. وعلاوة على ذلك، فإن الوصف التفصيلي المقدم هنا يمكن أن يساعد الآخرين الذين يواجهون صعوبات مماثلة في إعداد مواد مقاومة لتحليل نظام الرصد الدولي التابع لوزارة التنمية في المالديف.

Protocol

تم التبرع ببذور Euterpe precatoria من قبل المعهد الوطني ل Pesquisas da Amazônia (ماناوس ، البرازيل) ، وتم التبرع ببذور Euterpe edulis من قبل Silo – Arte e Latitude Rural (Resende ، البرازيل) بعد عملية إزالة اللب الصناعي. تم حفظ البذور في صناديق بلاستيكية محكمة الغلق في درجة حرارة الغرفة. 1. التحليل الطيفي…

Representative Results

وقد مكن البروتوكول المبتكر نظام الرصد الدولي من تحليل نظام الرصد الدولي التابع ل MALDI-IMS لبذور E. precatoria و E. edulis. نتيجة لذلك ، يمكننا تأكيد الوزن الجزيئي للكربوهيدرات ودرجة البلمرة (DP) كتوضيح هيكلي جزئي. أظهرت المعلومات الجزيئية المقدمة من تحليل MALDI-IMS (الشكل 1 <strong …

Discussion

تتكون النباتات من أنسجة متخصصة لوظائف كيميائية حيوية محددة. ولذلك، يجب تصميم بروتوكول تحضير العينات لنظام الرصد الدولي التابع ل MALDI-IMS وفقا لمختلف الأنسجة النباتية ذات الخواص الفيزيائية والكيميائية المحددة، حيث يجب أن تحافظ العينات على توزيعها الأصلي للتحليل ووفرتها للحصول على إشارة عا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل معهد Serrapilheira (Serra-1708-15009) ، ومؤسسة Carlos Chagas Filho لدعم البحوث في ولاية ريو دي جانيرو (FAPERJ-JCNE-SEI-260003 / 004754 / 2021). قدم معهد Serrapilheira والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq) منحا دراسية للدكتور فيليبي لوبيز بروم والدكتور غابرييل ر. مارتينز (برنامج بناء القدرات المؤسسية / INT / MCTI). تم الاعتراف بالتنسيق من أجل تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES) لمنح منحة ماجستير للسيد دافي إم إم سي دا سيلفا. تم الاعتراف بمركز الطيف في ماساس دي بيولوجيكولاس (CEMBIO-UFRJ) للخدمات المقدمة مع تحليلات MALDI-IMS ، والسيد آلان مينيزيس دو ناسيمنتو ومركز Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT) ، بتمويل من MCTI / SISNANO / INT-CENANO-CNPQ منحة Nº 442604/2019 ، نشكرهم على تحليل التكوين الأولي.

Materials

1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock Hamilton Company 81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid Sigma Aldrich Co, MO, USA 149357
APCI needle Bruker Daltonik, Bremen, Germany 602193
AxiDraw V3 xy motion platform Evil Mad Scientist, CA, USA 2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software  creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape 3M, USA 1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging Bruker Daltonik, Bremen, Germany image acquisition
FTMS Processing Bruker Daltonik, Bremen, Germany data calibration
Gelatin from bovine skin Sigma Aldrich Co, MO, USA G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818 Leica  Biosystems, Nussloch, Germany 0358 38926
indium tin oxide coated glass slide Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8237001
Inkscape Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter Buehler, Illinois, USA
Methanol J.T.Baker 9093-03
Mili-Q water 18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound Fisher HealthCare, Texas, USA 4585
Parafilm "M" Sealing Film Amcor HS234526B
Quanta 450 FEG FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software  Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump kdScientific, MA, USA 78-9100K
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich Co, MO, USA 302031
X-Max spectrometer Oxford Instruments, Ableton, UK

References

  1. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  2. Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry. , (2017).
  3. Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andrén, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
  4. Zaima, N., Hayasaka, T., Goto-Inoue, N., Setou, M. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 5040-5055 (2010).
  5. Qin, L., et al. Recent advances in matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) for in Situ analysis of endogenous molecules in plants. Phytochemical Analysis. 29 (4), 351-364 (2018).
  6. Bhandari, D. R., et al. High resolution mass spectrometry imaging of plant tissues: Towards a plant metabolite atlas. Analyst. 140 (22), 7696-7709 (2015).
  7. Boughton, B. A., Thinagaran, D., Sarabia, D., Bacic, A., Roessner, U. Mass spectrometry imaging for plant biology: a review. Phytochemistry Reviews. 15 (3), 445-488 (2016).
  8. Dong, Y., et al. Sample preparation for mass spectrometry imaging of plant tissues: a review. Frontiers in Plant Science. 7, 60 (2016).
  9. Zhang, Y. X., Zhang, Y., Shi, Y. P. A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals. Food Chemistry. 398, 133911 (2023).
  10. Brum, F. L., Martins, G. R., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. The acquisition of thin sections of açaí (Euterpe oleracea Mart.) seed with elevated potassium content for molecular mapping by mass spectrometry imaging. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , e9474 (2023).
  11. Martins, G. R., et al. Chemical characterization, antioxidant and antimicrobial activities of açaí seed (Euterpe oleracea Mart.) extracts containing A- and B-type procyanidins. LWT. 132, 109830 (2020).
  12. Martins, G. R., et al. Phenolic profile and antioxidant properties in extracts of developing açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (51), 16218-16228 (2022).
  13. Jorge, F. T. A., Silva, A. S. A., Brigagão, G. V. Açaí waste valorization via mannose and polyphenols production: techno-economic and environmental assessment. Biomass Conversion and Biorefinery. , (2022).
  14. Carvalho, L. M. J., Esmerino, A. A., Carvalho, J. L. V. Jussaí (Euterpe edulis): a review. Food Science and Technology. 42, (2022).
  15. Yamaguchi, K. K. d. L., Pereira, L. F. R., Lamarão, C. V., Lima, E. S., Veiga-Junior, V. F. d. Amazon acai: chemistry and biological activities: A Review. Food Chemistry. 179, 137-151 (2015).
  16. Wu, R., et al. Copper adhesive tape attached to the reverse side of a non-conductive glass slide to achieve protein MALDI-imaging in FFPE-tissue sections. Chemical Communications. 57 (82), 10707-10710 (2021).
  17. Dufresne, M., Patterson, N. H., Norris, J. L., Caprioli, R. M. Combining salt doping and matrix sublimation for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of neutral lipids. Analytical Chemistry. 91 (20), 12928-12934 (2019).
  18. Aguiar, M. O., de Mendonça, M. S. Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart (Palmae). Revista Brasileira de Sementes. 25, 37-42 (2003).
  19. Panza, V., Láinez, V., Maldonado, S. Seed structure and histochemistry in the palm Euterpe edulis. Botanical Journal of the Linnean Society. 145 (4), 445-453 (2004).
  20. Alves, V. M., et al. Provenient residues from industrial processing of açaí berries (Euterpe precatoria Mart): nutritional and antinutritional contents, phenolic profile, and pigments. Food Science and Technology. 42, (2022).
  21. Inada, K. O. P., et al. Screening of the chemical composition and occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) and jussara (Euterpe edulis) fruits and their fractions. Journal of FunctionalFoods. 17, 422-433 (2015).
  22. Monteiro, A. F., Miguez, I. S., Silva, J. P. R. B., Silva, A. S. High concentration and yield production of mannose from açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds via mannanase-catalyzed hydrolysis. Scientific Reports. 9 (1), 10939 (2019).

Play Video

Cite This Article
Martins, G. R., Brum, F. L., da Silva, D. M. M. C., Barbosa, L. C., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. Preparation of Hard Palm Seeds for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Imaging Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (196), e65650, doi:10.3791/65650 (2023).

View Video