Summary

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析のための硬質パーム種子の調製(英語)

Published: June 30, 2023
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Summary

このプロトコールは、MALDI-IMS分析用の水分含有量の少ない硬いシードサンプル切片の調製、分析種の元の分布と存在量の維持、高品質のシグナルと空間分解能の提供に関する詳細なガイダンスを説明することを目的としています。

Abstract

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析(MALDI-IMS)は、天然環境で化合物を同定するために適用されます。現在、MALDI-IMSは臨床解析で頻繁に使用されています。しかし、この手法を応用して、植物組織における化合物の生理学的情報を理解するための優れた展望が存在します。しかし、MALDI-IMSでは、適切なデータ取得と分析を成功させるために薄片(12-20 μm)を必要とするため、植物材料からの特定のサンプルの調製が困難な場合があります。この意味で、私たちは以前、 Euterpe oleracea (アサイーパーム)の硬い種子の薄切片を得るためのサンプル調製プロトコルを開発し、MALDI-IMSによる分子マッピングを可能にしました。

ここでは、開発されたプロトコルが、同じ属の他の種子を調製するのに適していることを示します。簡単に言うと、このプロトコルは、種子を脱イオン水に24時間浸し、サンプルをゼラチンで埋め込み、順応クライオスタットで切片化することに基づいていました。次に、マトリックス堆積のために、1:1(v/v)2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)と0.1%トリフルオロ酢酸(30 mg/mL)のメタノール溶液を使用して、エレクトロスプレーイオン化(ESI)ニードルスプレーにxyモーションプラットフォームを結合しました。 E. precatoria と E. edulis の 種子データは、ソフトウェアを使用して処理され、代謝物パターンがマッピングされました。

ヘキソースオリゴマーは、これらの種子に大量のマンナン(ヘキソースマンノースのポリマー)が含まれていることが知られているため、これらのサンプルのプロトコルの妥当性を証明するために、サンプルスライス内にマッピングされました。その結果、(Δ=162Da)の[M+K]+ 付加物で表されるヘキソースオリゴマーのピークが同定された。したがって、 以前に E. oleracea 種子用に開発されたサンプル前処理プロトコルにより、他の 2 つの硬いヤシ種子の MALDI-IMS 分析も可能になりました。要するに、この方法は、植物材料の形態解剖学と生理学、特に耐切創性サンプルの研究のための貴重なツールを構成する可能性があります。

Introduction

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析(MALDI-IMS)は、2次元の生体分子の割り当てを可能にし、イオン化可能な化合物のノンターゲット調査を提供し、特に生体試料におけるそれらの空間分布を決定する強力な方法です1,2。20年間にわたり、この技術により、脂質、ペプチド、炭水化物、タンパク質、その他の代謝物、および治療薬などの合成分子の同時検出と同定が可能になりました3,4。MALDI-IMSは、生体試料の抽出、精製、分離、標識、染色剤を介さずに、組織試料表面の化学分析を容易にします。しかし、分析を成功させるためには、この手法の極めて重要なステップは、特に環境順応のために広範囲にわたる複雑な器官に特殊化され、修飾された植物組織におけるサンプル調製です5。

植物組織の固有の物理化学的特性のため、MALDI-IMS分析の要件に適合し、切片作成中に組織の元の形状を維持するための適応プロトコルが必要です6,7。種子などの型破りなサンプルの場合、これらの組織は細胞壁が硬く、水分含有量が少ないため、切片の断片化を引き起こしやすく、化合物の非局在化を引き起こす可能性があるため、確立されたプロトコル8は適用できません9。

私たちの研究グループは、レンタル可能なアサイーパルプ13 の生産中に大量に生成される副産物であるアサイー (Euterpe oleracea Mart.) 種子 10,11,12 の分子マッピングと MALDI-IMS 分析に適合したプロトコルに関する実験データを公開しました。アイデアは、アサイー種子のさまざまな代謝産物の in situ マッピングのプロトコルを開発し、現在商業的に調査されていないこの農業廃棄物の可能な用途を提案することでした。しかし、アサイーシードの抵抗性により、MALDI-IMS 分析から適切なサンプル切片を得るためのプロトコルをオーダーメイドする必要がありました。

これに関連して、経済的に重要なアサイーパルプは、同様の感覚特性を持つエウテルペ属のヤシの木からの他の果物の商業化の増加を動機付けました。アサイー14,15 の代替として工業規模で生産されている 2 つの新興ヤシの木の果実は、アマゾンの乾燥地で育つ E. precatoria (アサイー ド アマゾナスとして知られている) と、大西洋岸森林から典型的な E. edulis (ジュサラとして知られている) です。それにもかかわらず、アサイー・ド・アマゾナスとジュサラの消費は、役に立たず、それらの詳細な化学組成に関してこれまで研究されていなかった耐性のある食べられない種子の同じ蓄積につながります。

したがって、MALDI-IMSによる分子マッピングのために E.precatoria および E.edulis 種子を分析するために、以前に考案されたプロトコルをほとんど適応せずに使用できることをここで実証し、これらのリソースの組成の分析に使用できる強力なツールであり、それらの潜在的なバイオテクノロジーの使用を決定するのに役立つことを証明します。さらに、ここでの詳細な説明は、MALDI-IMS分析用の耐性材料を調製する際に同様の困難を抱えている他の人に役立ちます。

Protocol

Euterpe precatoria の種子は、Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia(ブラジル、マナウス)から寄贈され、 Euterpe edulis の種子は、産業パルプ化プロセスの後、Silo – Arte e Latitude Rural(Resende、ブラジル)から寄贈されました。種子は密封されたプラスチックの箱に室温で維持した。 1. マトリックス支援レーザー脱離イオン化イメージング質量分析法(MALDI-IMS) <ol…

Representative Results

考案されたプロトコルにより、E. precatoria および E. edulis 種子の MALDI-IMS 解析が可能になりました。その結果、部分的な構造解明として、糖質の分子量と重合度(DP)を確認することができました。MALDI-IMS分析(図1および図2)で得られた分子情報では、マトリックスに塩を添加することなく、ヘキソースオリゴマー(Δ = 162 Da)の[M…

Discussion

植物は、特定の生化学的機能のために特殊な組織で構成されています。したがって、MALDI-IMSのサンプル調製プロトコルは、サンプルが高品質のシグナルと空間分解能のために元の分析種の分布と存在量を維持する必要があるため、特定の物理化学的特性を持つさまざまな植物組織に従って設計する必要があります8。

MALDI-IMS分析の前に、サンプルを適切?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、セラピリェイラ研究所(Serra-1708-15009)とリオデジャネイロ州におけるカルロス・シャーガス・フィーリョ研究支援財団(FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021)から資金提供を受けました。セラピリヘイラ研究所と国家科学技術開発評議会(CNPq)は、フェリペ・ロペス・ブルム博士とガブリエル・R・マーティンス博士(制度的能力開発プログラム/ INT/MCTI)に奨学金を授与しました。高等教育要員の改善のための調整(CAPES)は、Davi M.M.C.da Silva氏に修士奨学金を授与したことが認められています。Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) は、MALDI-IMS 分析で提供されたサービスで認められており、MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ grant Nº 442604/2019 の資金提供を受けた Alan Menezes do Nascimento 氏と Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT) は、元素組成分析に感謝しています。

Materials

1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock Hamilton Company 81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid Sigma Aldrich Co, MO, USA 149357
APCI needle Bruker Daltonik, Bremen, Germany 602193
AxiDraw V3 xy motion platform Evil Mad Scientist, CA, USA 2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software  creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape 3M, USA 1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging Bruker Daltonik, Bremen, Germany image acquisition
FTMS Processing Bruker Daltonik, Bremen, Germany data calibration
Gelatin from bovine skin Sigma Aldrich Co, MO, USA G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818 Leica  Biosystems, Nussloch, Germany 0358 38926
indium tin oxide coated glass slide Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8237001
Inkscape Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter Buehler, Illinois, USA
Methanol J.T.Baker 9093-03
Mili-Q water 18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound Fisher HealthCare, Texas, USA 4585
Parafilm "M" Sealing Film Amcor HS234526B
Quanta 450 FEG FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software  Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump kdScientific, MA, USA 78-9100K
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich Co, MO, USA 302031
X-Max spectrometer Oxford Instruments, Ableton, UK

References

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Martins, G. R., Brum, F. L., da Silva, D. M. M. C., Barbosa, L. C., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. Preparation of Hard Palm Seeds for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Imaging Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (196), e65650, doi:10.3791/65650 (2023).

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