该协议描述了一种在小鼠模型中诱导准确且可重复的角膜和角膜缘碱损伤的方法。该协议是有利的,因为它允许对高度弯曲的小鼠角膜和角膜缘均匀分布损伤。
角膜对视力至关重要,外伤后的角膜愈合是维持其透明度和功能的基础。通过角膜损伤模型的研究,研究人员旨在加强对角膜如何愈合的理解,并制定预防和管理角膜混浊的策略。化学损伤是已在小鼠身上广泛研究的最流行的损伤模型之一。大多数以前的研究人员都使用浸泡在氢氧化钠中的平面纸来诱导角膜损伤。然而,使用扁平滤纸诱导角膜和角膜缘损伤是不可靠的,因为小鼠角膜高度弯曲。在这里,我们提出了一种新仪器,一种改进的活检打孔器,它使研究人员能够对小鼠角膜和角膜缘产生边界明确、局部且均匀分布的碱损伤。这种穿孔-环钻方法使研究人员能够对整个小鼠角膜和角膜缘进行准确且可重复的化学灼伤,同时使其他结构(如眼睑)不受化学物质的影响。此外,本研究引入了一种眼球摘除技术,该技术保留了内侧痈,作为识别地球鼻侧的标志。使用这种技术,延髓和睑结膜以及泪腺也保持完整。在受伤后第 0、1、2、6、8 和 14 天通过裂隙灯生物显微镜和荧光素染色进行眼科检查。临床、组织学和免疫组织化学结果证实,所有实验小鼠均存在角膜缘干细胞缺乏症和眼表再生失败。所提出的碱性角膜损伤模型是研究角膜缘干细胞缺乏症、角膜炎症和纤维化的理想选择。该方法也适用于研究局部眼科药物在小鼠角膜表面的临床前和临床疗效。
角膜对视力至关重要,并表现出独特的特征,包括透明度,这是清晰视力的先决条件。除了起到主要的保护作用外,角膜还占眼睛屈光力的2/31。由于角膜损伤和混浊在视力中的重要作用,角膜损伤和混浊会导致视力严重下降,是全球可预防失明的第二大原因 2,3。在伴有严重角膜缘功能障碍的角膜损伤中,角膜缘的屏障功能下降,导致结膜细胞向角膜表面迁移和角膜结膜形成 4,5,这极大地损害了视力。因此,需要有效的预防和治疗策略来解决角膜盲症和相关残疾的全球负担。
目前对人类角膜伤口愈合过程的理解是基于先前的研究,这些研究调查了角膜对各种损伤的反应。已经采用了几种技术和动物模型来诱导各种化学或机械性角膜损伤 6,7,8,9 并研究角膜伤口愈合过程的各个方面。
碱烧伤模型是一种成熟的损伤模型,其方法是直接在角膜表面施用氢氧化钠 (NaOH) 或使用扁平滤纸10 进行。碱损伤不仅在角膜和眼房中,而且在视网膜中导致促炎介质的释放和多形核细胞的浸润。这会诱导意外的视网膜神经节细胞凋亡和 CD45+ 细胞活化11。因此,使用碱损伤模型精确定位损伤部位以避免过度的意外损伤至关重要。
小鼠眼球的轴长约为3毫米12。由于角膜和视网膜之间的距离很短,因此存在陡峭的角膜曲率以提供高折射力以将光线聚焦在视网膜上(图1A)。正如我们之前报道的 13,使用扁平滤纸对这种高度弯曲的表面造成化学损伤是很困难的,尤其是在角膜缘处(图 1B)。诱发角膜缘损伤需要倾斜滤纸,这有可能对穹窿和邻近结膜造成意外损伤14.另一种方法是将化学试剂作为滴剂直接涂抹在角膜表面。然而,这种方法缺乏对暴露时间的控制,并且由于液体扩散到这些区域,存在诱发结膜、穹窿和眼睑损伤的潜在风险。
为了克服这些局限性,本研究提出了一种新的打孔-环钻诱导损伤的方法。该技术有几个优点,包括 (i) 在小鼠模型中诱导对整个角膜表面和角膜缘的有效化学损伤,(ii) 诱导角膜的局部和边界明确的损伤,(iii) 能够在预定的持续时间内应用任何感兴趣的液体,以及 (iv) 通过选择合适的活检打孔来诱导不同大小的角膜损伤的能力。这种方法对于大鼠和兔子损伤模型也是可行的,它们也表现出弯曲的角膜表面,是用于研究眼表伤口愈合的常见动物模型。
这项研究提出了一种创新设备,即穿孔环钻,可用于在小鼠模型中成功诱导有效且可重复的角膜和角膜缘损伤。这种角膜缘干细胞缺乏模型是研究损伤后角膜伤口愈合和结膜形成动力学的理想选择。
有证据表明,角膜缘生态位和小鼠角膜的中央部分都含有干细胞30。因此,需要有效的角膜和角膜缘损伤来产生干细胞缺陷模型,而这里介绍的损伤模型可以使弯曲的角膜缘在特定时期内暴露于化学试剂。为了确定NaOH损伤的最佳浓度和持续时间,使用了不同NaOH浓度和持续时间的损伤。较高的 NaOH 浓度或较长的暴露时间会导致组织损伤和纤维化增加。因此,研究人员可以根据研究的具体目标和所需的损伤严重程度来调整这些参数。
为了成功重现这种角膜缘和角膜缘损伤模型,应考虑几个关键因素。首先,必须测量目标眼的角膜缘到角膜缘直径,以确定合适的打孔尺寸。建议选择外径比此直径大 0.5 – 1 mm 的活检穿刺器。
如 图1G所示,所用液体的表面张力是防止眼面与冲头环钻边缘界面泄漏的重要因素。因此,无需对穿刺活检的尖端施加压力。
为避免对组织造成机械损伤,关键是要将环钻与眼睛保持在平行轴上,并避免对角膜缘施加压力。冲头环钻轴调整不当会增加泄漏风险,并导致受伤部位偏移和结果不准确。
该技术的一些潜在局限性包括需要选择合适的冲头尺寸、熟练握住冲头环钻以及造成机械损伤的潜在风险。但是,这些限制可以通过实践和遵循本协议中概述的说明来克服。小鼠的品系和年龄范围是影响再上皮化过程的其他因素,必须在研究中考虑。
此外,拟议的方案是有利的,因为它详细介绍了一种保留延髓和睑结膜的剜除方法,并允许在不应用手术缝合线作为标记的情况下确定球的鼻部。先前的研究表明,与角膜的其他区域相比,眼睛的鼻部区域具有最低的神经支配,这使得它更容易受到新生血管形成和再生功效降低的影响31,32。
综上所述,LSCD的临床体征,如角膜混浊(CO)、持续性上皮缺损和角膜新生血管形成(NV),以及观察到的组织学变化,包括杯状细胞化生、角膜表面K13表达和角膜表面K12缺失,证实了LSCD在该模型中的存在。这些发现提供了证据,证明这种新技术可有效诱导LSCD。这种化学损伤模型可用于临床前研究,以研究角膜损伤和再生领域的新药和药物治疗。
The authors have nothing to disclose.
我们承认NEI P30-EY026877支持这项研究。我们非常感谢Charlene Wang和斯坦福大学干细胞生物学和再生医学研究所的Irv Weissman博士实验室在提供实验动物方面提供的所有帮助。我们感谢 Hirad Rezaeipoor 在准备和编辑图像方面的帮助。
Anti-K12 antibody | ABCAM | ab185627 | |
Anti-K13 antibody | ABCAM | ab92551 | |
Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher Scientific | B14 | |
C57BL/6 mice | Dr Weissman Lab, Stanford University | ||
Curved forceps | Storz | E1885 | |
Disposable 90 degree bent needle | |||
Disposable biopsy punch | Med blades | ||
Donkey anti-rabbit IgG H&L | ABCAM | ab150073 | |
Ethanol | ThermoFisher Scientific | T038181000CS | |
Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) | Fidelis Animal Health | ||
Heating pad for mouse | |||
Ketamine hydrochloride | Ambler | ANADA 200-055 | |
OCT | Tissue-Tek 4583 | ||
Ophthalmic surgical scissors | |||
pH Indicator Sticks | Whatman | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Slit-lamp microscope | NIDEK | SL-450 | |
Sodium fluorescein AK-fluor 10% | Dailymed | NDC17478-253-10 | |
Sterile irrigation solution (BSS) | Alcon | 9017036-0119 | |
Sterile syringe, 1 and 5 ml | |||
Straight forceps | Katena K5 | 4550- Storz E1684 | |
Surgical eye spears | American White 17240 Cross | ||
Surgical microscope | Zeiss S5 microscope | ||
Tetracaine ophthalmic drop | Alcon | NDC0065-0741-14 | |
Timer | |||
Triple antibiotic ophthalmic ointment | Bausch and Lomb | ||
TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
Two-speed rotary tool | 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit | ||
Xylazine | AnaSed | NADA#139-236 |