تحريض إصابة القرنية والقلوية الداكنة حول القزحية باستخدام تقنية الثقب في نموذج الفأر
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة للحث على إصابة القرنية والقلويات الداكنة حول سطح دقيقة وقابلة للتكرار في نموذج الفأر. البروتوكول مفيد لأنه يسمح بإصابة موزعة بالتساوي لقرنية الفأر المنحنية للغاية والليمبوس.
Abstract
القرنية أمر بالغ الأهمية للرؤية ، وشفاء القرنية بعد الصدمة أمر أساسي في الحفاظ على شفافيتها ووظيفتها. من خلال دراسة نماذج إصابة القرنية ، يهدف الباحثون إلى تعزيز فهمهم لكيفية شفاء القرنية وتطوير استراتيجيات لمنع عتامة القرنية وإدارتها. الإصابة الكيميائية هي واحدة من نماذج الإصابة الأكثر شعبية التي تمت دراستها على نطاق واسع على الفئران. استخدم معظم الباحثين السابقين ورقة مسطحة مبللة بهيدروكسيد الصوديوم للحث على إصابة القرنية. ومع ذلك ، فإن إحداث إصابة القرنية والداكنة حول الأطراف باستخدام ورق الترشيح المسطح لا يمكن الاعتماد عليه ، لأن قرنية الفأر منحنية للغاية. هنا ، نقدم أداة جديدة ، لكمة خزعة معدلة ، تمكن الباحثين من إنشاء إصابة قلوية محددة جيدا وموضعية وموزعة بالتساوي لقرنية الفئران والليمبوس. تمكن طريقة التثقيب والتريفين هذه الباحثين من إحداث حرق كيميائي دقيق وقابل للتكرار لقرنية الفئران بأكملها مع ترك الهياكل الأخرى ، مثل الجفون ، غير متأثرة بالمادة الكيميائية. علاوة على ذلك ، تقدم هذه الدراسة تقنية الاستئصال التي تحافظ على الغضروف الإنسي كمعلم لتحديد الجانب الأنفي من الكرة الأرضية. كما يتم الحفاظ على الملتحمة البصلية والجفنية والغدة الدمعية سليمة باستخدام هذه التقنية. تم إجراء فحوصات طب العيون عبر المجهر الحيوي للمصباح الشقي وتلطيخ الفلوريسئين في الأيام 0 و 1 و 2 و 6 و 8 و 14 بعد الإصابة. أكدت النتائج السريرية والنسيجية والكيميائية المناعية نقص الخلايا الجذعية الطرفية وفشل تجديد سطح العين في جميع فئران التجارب. يعد نموذج إصابة القرنية القلوية المقدم مثاليا لدراسة نقص الخلايا الجذعية الحوفي والتهاب القرنية والتليف. هذه الطريقة مناسبة أيضا للتحقيق في الكفاءة قبل السريرية والسريرية لأدوية العيون الموضعية على سطح القرنية الفئران.
Introduction
القرنية ضرورية للرؤية وتظهر خصائص فريدة ، بما في ذلك الشفافية ، وهي شرط أساسي للرؤية الواضحة. بالإضافة إلى القيام بدور وقائي رئيسي ، تمثل القرنية 2/3 من القوة الانكسارية للعين1. نظرا لدورها الهام في الرؤية ، تتسبب إصابات القرنية والعتامة في تدهور بصري كبير وهي مسؤولة عن ثاني أكبر سبب للعمى الذي يمكن الوقاية منه في جميع أنحاء العالم 2,3. في إصابات القرنية مع خلل وظيفي حاد في الأطراف ، تنخفض وظيفة الحاجز الواقي للطرف ، مما يؤدي إلى هجرة خلايا الملتحمة نحو سطح القرنية والملتحمةالقرنية 4,5 ، مما يضر بالرؤية بشكل كبير. لذلك يلزم وضع استراتيجيات وقائية وعلاجية فعالة لمعالجة العبء العالمي لعمى القرنية وما يتصل به من إعاقة.
يعتمد الفهم الحالي لعملية التئام جروح القرنية البشرية على الدراسات السابقة التي بحثت في استجابات القرنية للإصابات المختلفة. تم استخدام العديد من التقنيات والنماذج الحيوانية للحث على إصابات القرنية الكيميائية أو الميكانيكيةالمختلفة 6،7،8،9 والتحقيق في الجوانب المختلفة لعملية التئام جروح القرنية.
نموذج الحرق القلوي هو نموذج إصابة راسخ يتم إجراؤه عن طريق تطبيق هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) على سطح القرنية مباشرة أو باستخدام ورق ترشيح مسطح10. تؤدي الإصابة القلوية إلى إطلاق وسطاء مؤيدين للالتهابات وتسلل الخلايا متعددة الأشكال النووية ليس فقط في القرنية والغرفة الأمامية للعين ولكن أيضا في شبكية العين. هذا يحفز موت الخلايا المبرمج غير المقصود لخلايا العقدة الشبكية وتنشيط خلية CD45 + 11. لذلك ، من الأهمية بمكان تحديد موقع الإصابة بدقة لتجنب الإصابة المفرطة غير المقصودة باستخدام نموذج الإصابة القلوية.
يبلغ الطول المحوري لمقلة عين الفئران حوالي 3 مم12. بسبب هذه المسافة القصيرة بين القرنية والشبكية ، يوجد انحناء حاد في القرنية لتوفير قوة انكسارية عالية لتركيز الضوء على الشبكية (الشكل 1 أ). كما ذكرناسابقا 13 ، فإن إحداث إصابة كيميائية لهذا السطح شديد الانحناء باستخدام ورق ترشيح مسطح أمر صعب ، لا سيما في النسيان (الشكل 1 ب). يتطلب إحداث إصابة في الحافة إمالة ورق الترشيح ، والذي من المحتمل أن يتسبب في إصابة غير مقصودة للقبو والملتحمةالمجاورة 14. هناك طريقة أخرى تتضمن تطبيق العامل الكيميائي مباشرة كقطرات على سطح القرنية. ومع ذلك ، تفتقر هذه الطريقة إلى التحكم في وقت التعرض ، وهناك خطر محتمل لإحداث إصابة في الملتحمة والقبو والجفون بسبب انتشار السائل إلى هذه المناطق.
للتغلب على هذه القيود ، تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لكمة تريفين للحث على الإصابة. تتميز هذه التقنية بالعديد من المزايا بما في ذلك (i) إحداث إصابة كيميائية فعالة لسطح القرنية بالكامل و limbus في نموذج الفأر ، (ii) إحداث إصابة موضعية ومحددة جيدا للقرنية ، (iii) القدرة على تطبيق أي سائل مهم لمدة محددة مسبقا ، و (iv) القدرة على إحداث أحجام مختلفة من إصابات القرنية عن طريق اختيار لكمات الخزعة المناسبة. هذه الطريقة ممكنة أيضا لنماذج إصابة الفئران والأرانب ، والتي تظهر أيضا سطحا منحنيا للقرنية وهي نماذج حيوانية شائعة تستخدم لدراسة التئام الجروح على سطح العين.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقترح هذه الدراسة جهازا مبتكرا ، وهو punch-trephine ، والذي يمكن استخدامه للحث بنجاح على إصابة القرنية والطرفية الفعالة والقابلة للتكرار في نموذج الفأر. يعد نموذج نقص الخلايا الجذعية الحوفي هذا مثاليا للتحقيق في ديناميكيات التئام جروح القرنية والملتحمة بعد الإصابة.
تشير الدلائل إلى أن كلا من مكان القزحية والجزء المركزي من قرنية الفئران يحتويان على الخلايا الجذعية30. لذلك ، يلزم وجود إصابة فعالة في القرنية والأطراف لإنتاج نموذج نقص الخلايا الجذعية ، ويتيح نموذج الإصابة المقدم هنا تعرض طرف القرنية المنحني لعامل كيميائي لفترة محددة. لتحديد أفضل تركيز ومدة إصابة هيدروكسيد الصوديوم ، تم إلحاق إصابات بتركيزات ومدد مختلفة من هيدروكسيد الصوديوم. أدت تركيزات NaOH الأعلى أو فترات التعرض الأطول إلى زيادة تلف الأنسجة والتليف. لذلك ، يمكن للباحثين ضبط هذه المعلمات بناء على الأهداف المحددة لدراستهم وشدة الإصابة المطلوبة.
لإعادة إنتاج نموذج إصابة القرنية والداكنة حول القزحية بنجاح ، يجب مراعاة العديد من الاعتبارات الرئيسية. أولا ، من الضروري قياس قطر العين المستهدفة من القزحية إلى القزحية لتحديد الحجم المناسب للثقب. يوصى باختيار لكمة خزعة بقطر خارجي أكبر من هذا القطر بمقدار 0.5 – 1 مم.
يعد التوتر السطحي للسائل المستخدم عاملا مهما في منع التسرب عند السطح البيني بين سطح العين وحافة التريفين المثقوب كما هو موضح في الشكل 1G. لذلك ، ليست هناك حاجة للضغط على طرف الخزعة لكمة.
لتجنب التسبب في أضرار ميكانيكية للأنسجة ، من الأهمية بمكان تثبيت التريفين المثقوب في محور مواز مع العين والامتناع عن الضغط على الطرف. يمكن أن يؤدي الضبط غير الصحيح لمحور التثقيب إلى زيادة خطر التسرب ويؤدي إلى موقع إصابة غير دقيق ونتائج غير دقيقة.
تتضمن بعض القيود المحتملة لهذه التقنية الحاجة إلى تحديد حجم الثقب المناسب ، واكتساب الكفاءة في حمل التريفين المثقوب ، والمخاطر المحتملة للتسبب في إصابة ميكانيكية. ومع ذلك ، يمكن التغلب على هذه القيود من خلال الممارسة وباتباع التعليمات الموضحة في هذا البروتوكول. تعتبر سلالة الفئران والفئة العمرية من العوامل الأخرى التي تؤثر على عملية إعادة الظهارة ويجب أخذها في الاعتبار في الدراسة.
علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول المقترح مفيد لأنه يفصل طريقة الاستئصال التي تحافظ على الملتحمة البصلية والجفنية وتسمح بتحديد الجزء الأنفي من الكرة الأرضية دون تطبيق الغرز الجراحية كعلامة. أشارت الأبحاث السابقة إلى أن منطقة الأنف في العين تمتلك أدنى تعصيب عصبي مقارنة بمناطق القرنية الأخرى ، مما يجعلها أكثر عرضة للأوعية الدموية الجديدة وتقليل فعالية التجدد31,32.
باختصار ، فإن العلامات السريرية ل LSCD ، مثل عتامة القرنية (CO) ، والعيوب الظهارية المستمرة ، والأوعية الدموية الجديدة للقرنية (NV) ، جنبا إلى جنب مع التغيرات النسيجية الملحوظة ، بما في ذلك حؤول الخلايا الكأسية ، والتعبير عن K13 على سطح القرنية ، وغياب K12 على سطح القرنية ، تؤكد وجود LSCD في هذا النموذج. تقدم هذه النتائج دليلا على أن هذه التقنية الجديدة فعالة في تحفيز LSCD. يمكن استخدام نموذج الإصابة الكيميائية هذا في الدراسات قبل السريرية للتحقيق في الأدوية الجديدة والعلاجات الصيدلانية في مجال إصابة القرنية وتجديدها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقر بأن NEI P30-EY026877 يدعم هذا البحث. نحن نقدر كثيرا شارلين وانغ ومختبر الدكتور إيرف وايزمان في معهد جامعة ستانفورد لبيولوجيا الخلايا الجذعية والطب التجديدي على كل ما قدموه من مساعدة كريمة في توفير التجارب. نحن نقدر مساعدة هيراد رضائيبور في إعداد وتحرير الصور.
Materials
| Anti-K12 antibody | ABCAM | ab185627 | |
| Anti-K13 antibody | ABCAM | ab92551 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher Scientific | B14 | |
| C57BL/6 mice | Dr Weissman Lab, Stanford University | ||
| Curved forceps | Storz | E1885 | |
| Disposable 90 degree bent needle | |||
| Disposable biopsy punch | Med blades | ||
| Donkey anti-rabbit IgG H&L | ABCAM | ab150073 | |
| Ethanol | ThermoFisher Scientific | T038181000CS | |
| Ethiqa XR (Buprenorphine extended-release injectable suspension) | Fidelis Animal Health | ||
| Heating pad for mouse | |||
| Ketamine hydrochloride | Ambler | ANADA 200-055 | |
| OCT | Tissue-Tek 4583 | ||
| Ophthalmic surgical scissors | |||
| pH Indicator Sticks | Whatman | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Slit-lamp microscope | NIDEK | SL-450 | |
| Sodium fluorescein AK-fluor 10% | Dailymed | NDC17478-253-10 | |
| Sterile irrigation solution (BSS) | Alcon | 9017036-0119 | |
| Sterile syringe, 1 and 5 ml | |||
| Straight forceps | Katena K5 | 4550- Storz E1684 | |
| Surgical eye spears | American White 17240 Cross | ||
| Surgical microscope | Zeiss S5 microscope | ||
| Tetracaine ophthalmic drop | Alcon | NDC0065-0741-14 | |
| Timer | |||
| Triple antibiotic ophthalmic ointment | Bausch and Lomb | ||
| TritonX -100 | Fisher Scientific | 50-295-34 | |
| Two-speed rotary tool | 200-1/15 Two Speed Rotary Toolkit | ||
| Xylazine | AnaSed | NADA#139-236 |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: a global problem. Clinical & experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
- Lamm, V., Hara, H., Mammen, A., Dhaliwal, D., Cooper, D. K. C. Corneal blindness and xenotransplantation. Xenotransplantation. 21 (2), 99-114 (2014).
- Danjo, S., Friend, J., Thoft, R. A. Conjunctival epithelium in healing of corneal epithelial wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1445-1449 (1987).
- Shapiro, M. S., Friend, J., Thoft, R. A. Corneal re-epithelialization from the conjunctiva. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 21 (1 Pt 1), 135-142 (1981).
- Shah, D., Aakalu, V. K., Das, H. Murine Corneal Epithelial Wound Modeling. Wound Regeneration: Methods and Protocols. , 175-181 (2021).
- Rittié, L., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Mouse models of corneal scarring. Fibrosis: Methods and Protocols. 1627, 117-122 (2017).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (178), 63112 (2021).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Paschalis, E. I., et al. The Role of Microglia and Peripheral Monocytes in Retinal Damage after Corneal Chemical Injury. The American Journal of Pathology. 188 (7), 1580-1596 (2018).
- Jiang, M., et al. Single-Shot Dimension Measurements of the Mouse Eye Using SD-OCT. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 43 (3), 252-256 (2012).
- Shadmani, A., Razmkhah, M., Jalalpoor, M. H., Lari, S. Y., Eghtedari, M. Autologous Activated Omental versus Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Corneal Alkaline Injury: An Experimental Study. Journal of Current Ophthalmology. 33 (2), 136-142 (2021).
- Swarup, A., et al. PNP Hydrogel Prevents Formation of Symblephara in Mice After Ocular Alkali Injury. Translational Vision Science & Technology. 11 (2), 31-31 (2022).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), 2771 (2012).
- Jaber, S. M., et al. Dose Regimens, Variability, and Complications Associated with Using Repeat-Bolus Dosing to Extend a Surgical Plane of Anesthesia in Laboratory Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 684-691 (2014).
- Navarro, K. L., et al. Mouse Anesthesia: The Art and Science. ILAR Journal. 62 (1-2), 238-273 (2021).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in Aseptic Rodent Surgery. Current Protocols in Immunology. 1, 1.12.1-1.12.14 (2008).
- ACLAM Medical Records Committee. Medical Records for Animals Used in Research, Teaching, and Testing: Public Statement from the American College of Laboratory Animal Medicine. ILAR Journal. 48 (1), 37-41 (2007).
- Yoeruek, E., et al. Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
- Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (3), 242-253 (2020).
- Kvanta, A., Sarman, S., Fagerholm, P., Seregard, S., Steen, B. Expression of Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Inflammation-associated Corneal Neovascularization. Experimental Eye Research. 70 (4), 419-428 (2000).
- Tseng, S. C., Hirst, L. W., Farazdaghi, M., Green, W. R. Goblet cell density and vascularization during conjunctival transdifferentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (10), 1168-1176 (1984).
- Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Investigative ophthalmology & visual science. 32 (1), 96-105 (1991).
- Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
- Deng, S. X., et al. Global consensus on the definition, classification, diagnosis and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 38 (3), 364-375 (2019).
- Wei, Z. G., Wu, R. L., Lavker, R. M., Sun, T. T. In vitro growth and differentiation of rabbit bulbar, fornix, and palpebral conjunctival epithelia: Implications on conjunctival epithelial transdifferentiation and stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 34 (5), 1814-1828 (1993).
- Kao, W. W. Y. Keratin expression by corneal and limbal stem cells during development. Experimental Eye Research. 200, 108206 (2020).
- Park, M., et al. Plasticity of ocular surface epithelia: Using a murine model of limbal stem cell deficiency to delineate metaplasia and transdifferentiation. Stem Cell Reports. 17 (11), 2451-2466 (2022).
- Li, J., et al. Identification for Differential Localization of Putative Corneal Epithelial Stem Cells in Mouse and Human. Scientific Reports. 7 (1), 5169 (2017).
- McKenna, C. C., Lwigale, P. Y. Innervation of the Mouse Cornea during Development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 30-35 (2011).
- He, J., Bazan, H. E. P. Neuroanatomy and Neurochemistry of Mouse Cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (2), 664-674 (2016).
