Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir “aşağıdan yukarıya” analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.
Histon proteinleri ökaryotlar arasında oldukça bol miktarda bulunur ve korunur ve posttranslasyonel modifikasyonlar (PTM’ler) olarak bilinen yapıların bir sonucu olarak gen düzenlemesinde büyük rol oynar. Dış veya genetik faktörlere göre her bir PTM’nin veya PTM modelinin konumunu ve doğasını belirlemek, bu bilginin DNA transkripsiyonu, replikasyonu veya onarımı gibi biyolojik tepkilerle istatistiksel olarak ilişkilendirilmesine izin verir. Bu çalışmada, biyolojik örneklerden histon PTM’lerinin tespiti için yüksek verimli bir analitik protokol açıklanmaktadır. Tamamlayıcı sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisinin (LC-TIMS-ToF MS/MS) kullanımı, biyolojik olarak en ilgili modifikasyonların tek bir analizde ayrılmasını ve PTM atanmasını sağlar. Açıklanan yaklaşım, hareketlilik tuzağında paralel birikim ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışma kullanarak bağımlı veri toplamadaki (DDA) son gelişmelerden yararlanır. Histon PTM’leri, tutma sürelerine, hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atanır.
Ökaryotik hücrelerde DNA, kromatin olarak nükleozom adı verilen fonksiyonel birimler halinde paketlenir. Bu birimler dört çekirdek histondan oluşan bir oktamerden oluşur (her biri H2A, H2B, H3 ve H4’ten ikişer)1,2,3,4. Histonlar, gen regülasyonundan büyük ölçüde sorumlu olan ökaryotlarda en bol bulunan ve yüksek oranda korunan proteinler arasındadır5. Histon posttranslasyonel modifikasyonları (PTM’ler), kromatin dinamiğinin düzenlenmesinde büyük rol oynar ve DNA transkripsiyonu, replikasyonu ve onarımı gibi çeşitli biyolojik süreçlerin donatılmasında büyük rol oynar6. PTM’ler öncelikle DNA 3,7 ile temas halinde olan histonların N-terminal bölgelerinin erişilebilir yüzeyinde meydana gelir. Bununla birlikte, kuyruk ve çekirdek modifikasyonları kromatin yapısını etkiler, nükleozomlar arası etkileşimleri değiştirir ve spesifik proteinleri işe alır 3,8.
Sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS) tabanlı proteomik sırasındaki güncel bir zorluk, ilgilenilen analitlerin potansiyel birlikte elüsyonudur. Veriye bağlı analizler (DDA) söz konusu olduğunda, bu, MS/MS edinme işlemi sırasında birkaç öncü iyonun potansiyel kaybına dönüşür9. Uçuş süresi (ToF) cihazları çok yüksek frekanstaspektrum alır 9,10 (onlarca kHz’e kadar)11; bu, karmaşık bir numune (MS1) içindeki toplam öncü iyonları hızlı bir şekilde tarayabilmelerini sağlar, böylece optimum hassasiyet ve MS/MS dizileme oranları (100 Hz’e kadar)9 vaat eder ve onları biyolojik numune analizi için ideal hale getirir10. Bununla birlikte, bu yüksek tarama hızlarında mevcut olan hassasiyet, MS/MS hızı9 ile sınırlıdır. Bu sınırlamaları azaltmak için ortogonal dört kutuplu uçuş süresi (qToF) kütle spektrometresi ile birlikte tuzağa düşürülmüş iyon hareketlilik spektrometrisinin (TIMS) eklenmesi kullanıldı. TIMS’de, tüm öncü iyonlar art arda biriktirilir ve dört kutuplu9 ile tek öncü kütleleri seçmek yerine, hareketliliklerinin bir fonksiyonu olarak ayrıştırılır. Paralel birikim-seri parçalanma (PASEF), herhangi bir hassasiyet kaybı olmadan saniyede yüzlerce MS/MS olayına izin verir9.
Bu çalışmanın temel amacı, hareketlilik tuzağında paralel birikim ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) kullanarak DDA’nın son gelişmelerini göstermekti. Histon PTM’leri, tutma sürelerine (RT’ler), hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atandı.
Histonlar, dört çekirdek histondan (H2A, H2B, H3 ve H4’ün ikişer tane) oluşan oktamerler şeklinde DNA ile etkileşime girerek kromatin yapısını düzenleyen temel proteinlerdir.20. Histonlar, kolayca değiştirilebilen çok sayıda lizin ve arginin kalıntısı içerir, bu da histon fonksiyonunu etkileyerek veya diğer hücresel proteinlere bağlanarak kromatin kimyasını değiştiren kapsamlı PTM’lere yol açar21. PTM’ler, çeşitli hastalıklarda, özellikle de …
The authors have nothing to disclose.
Bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı tarafından Hibe No kapsamında desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. HRD-1547798 ve Hibe No. HRD-2111661. Bu NSF Hibeleri, Bilim ve Teknolojide Araştırma Mükemmeliyet Merkezleri (CREST) Programının bir parçası olarak Florida Uluslararası Üniversitesi’ne verildi. Bu, Florida Uluslararası Üniversitesi’nde Seçkin Bir Program olan Çevre Enstitüsü’nden 1672 numaralı katkıdır. Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından Hibe No. kapsamında ek destek sağlanmıştır. R21AI135469 Francisco Fernandez-Lima ve Grant No. R01HD106051 Benjamin A. Garcia’ya ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından Hibe No. CHE-2127882’den Benjamin A. Garcia’ya. Yazarlar, ilk yöntem geliştirmeleri sırasında Dr. Mario Gomez Hernandez’in ilk desteğini kabul etmek isterler.
-80 °C Freezer | |||
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Animal Origin-Free |
1 mL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL |
10 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked |
10% NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution |
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ | (Mediatech) | MT21031CM | |
15 mL Conical Tubes | Corning | 352196 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
200 µL Gel-Loading Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 02-707-138 | Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL |
200 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060310 | Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE |
50 mL Conical Tubes | Corning | 352070 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
96-well flat bottom plate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
96-well plate, V-Bottom 600 μL | Axygen | P-DW-500-C-S | |
Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | ACS reagent, ≥99.5% |
Acetonitrile (ACN) | Thermo Fisher Scientific | A998 | HPLC, Fisher Chemical |
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | AEBSF hydrochloride, 98% |
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 | Sigma Aldrich | 09830 | BioUltra, ≥99.5% (T) |
Ammonium hydroxide solution, NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS |
Argon (Ar) | Airgas | AR HP 300 | |
BEH C18 HPLC column | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Heat shock fraction, pH 7, ≥98% |
Calcium chloride, CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | Anhydrous, powder, ≥97% |
Cell dissociation buffer | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
Ceramic scoring wafer | Restek | 20116 | |
Compass DataAnalysis 6.0 | Bruker Datonics | ||
Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
Disposable Cell Lifters | Thermo Fisher Scientific | 08100240 | Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers |
Disposable Pellet Pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
Formic acid (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS reagent, ≥96% |
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD | (Molex (Polymicro) | TSP075375 | |
Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38S | Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical |
Glass Pasteur Pipettes | Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | |
High-Performance Liquid Chromatograph | Shimadzu | Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System | |
Hydrochloric acid, HCl | Sigma Aldrich | 258148 | ACS reagent, 37% |
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å | Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
Hypersep cartridge | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥98% |
Methanol, for HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima for HPLC, Fisher Chemical |
Microcentrifuge Tube Adapters | GL Sciences | 501021514 | |
Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Microcystin-LA |
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm | LEAP PAL Parts | LAP.11190933 | |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | model: ND3300 | |
Nitrogen (N2) | Airgas | NI UHP300 | |
PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
pH indicator strips, Instachek | Micro Essential Lab | JR-113 | Model: Hydrion |
Potassium chloride, KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS reagent, 99.0%–100.5% |
Pressure Injection Cell | Next Advance | model: PC77 | |
Propionic Anhydride | Sigma Aldrich | 8.00608 | For synthesis |
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) | NuAire, model: Nuwind | NU-C200V | |
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells |
Sodium butyrate | Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98+% |
Sodium chloride, NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
SPE disk, C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm |
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor | Savant | model: SC210A | |
Sucrose | Millipore | 1.07651 | suitable for microbiology |
Sulfuric acid, H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
TIMS-ToF Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | model Tims tof ms | |
Trichloroacetic acid solution, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 N |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Suitable for HPLC, ≥99.0% |
Triversa Nanomate | Advion | model: TR263 | |
TrypsinProtease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
Tube rotator | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |