Summary

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Published: January 12, 2024
doi:

Summary

Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir “aşağıdan yukarıya” analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.

Abstract

Histon proteinleri ökaryotlar arasında oldukça bol miktarda bulunur ve korunur ve posttranslasyonel modifikasyonlar (PTM’ler) olarak bilinen yapıların bir sonucu olarak gen düzenlemesinde büyük rol oynar. Dış veya genetik faktörlere göre her bir PTM’nin veya PTM modelinin konumunu ve doğasını belirlemek, bu bilginin DNA transkripsiyonu, replikasyonu veya onarımı gibi biyolojik tepkilerle istatistiksel olarak ilişkilendirilmesine izin verir. Bu çalışmada, biyolojik örneklerden histon PTM’lerinin tespiti için yüksek verimli bir analitik protokol açıklanmaktadır. Tamamlayıcı sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisinin (LC-TIMS-ToF MS/MS) kullanımı, biyolojik olarak en ilgili modifikasyonların tek bir analizde ayrılmasını ve PTM atanmasını sağlar. Açıklanan yaklaşım, hareketlilik tuzağında paralel birikim ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışma kullanarak bağımlı veri toplamadaki (DDA) son gelişmelerden yararlanır. Histon PTM’leri, tutma sürelerine, hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atanır.

Introduction

Ökaryotik hücrelerde DNA, kromatin olarak nükleozom adı verilen fonksiyonel birimler halinde paketlenir. Bu birimler dört çekirdek histondan oluşan bir oktamerden oluşur (her biri H2A, H2B, H3 ve H4’ten ikişer)1,2,3,4. Histonlar, gen regülasyonundan büyük ölçüde sorumlu olan ökaryotlarda en bol bulunan ve yüksek oranda korunan proteinler arasındadır5. Histon posttranslasyonel modifikasyonları (PTM’ler), kromatin dinamiğinin düzenlenmesinde büyük rol oynar ve DNA transkripsiyonu, replikasyonu ve onarımı gibi çeşitli biyolojik süreçlerin donatılmasında büyük rol oynar6. PTM’ler öncelikle DNA 3,7 ile temas halinde olan histonların N-terminal bölgelerinin erişilebilir yüzeyinde meydana gelir. Bununla birlikte, kuyruk ve çekirdek modifikasyonları kromatin yapısını etkiler, nükleozomlar arası etkileşimleri değiştirir ve spesifik proteinleri işe alır 3,8.

Sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS) tabanlı proteomik sırasındaki güncel bir zorluk, ilgilenilen analitlerin potansiyel birlikte elüsyonudur. Veriye bağlı analizler (DDA) söz konusu olduğunda, bu, MS/MS edinme işlemi sırasında birkaç öncü iyonun potansiyel kaybına dönüşür9. Uçuş süresi (ToF) cihazları çok yüksek frekanstaspektrum alır 9,10 (onlarca kHz’e kadar)11; bu, karmaşık bir numune (MS1) içindeki toplam öncü iyonları hızlı bir şekilde tarayabilmelerini sağlar, böylece optimum hassasiyet ve MS/MS dizileme oranları (100 Hz’e kadar)9 vaat eder ve onları biyolojik numune analizi için ideal hale getirir10. Bununla birlikte, bu yüksek tarama hızlarında mevcut olan hassasiyet, MS/MS hızı9 ile sınırlıdır. Bu sınırlamaları azaltmak için ortogonal dört kutuplu uçuş süresi (qToF) kütle spektrometresi ile birlikte tuzağa düşürülmüş iyon hareketlilik spektrometrisinin (TIMS) eklenmesi kullanıldı. TIMS’de, tüm öncü iyonlar art arda biriktirilir ve dört kutuplu9 ile tek öncü kütleleri seçmek yerine, hareketliliklerinin bir fonksiyonu olarak ayrıştırılır. Paralel birikim-seri parçalanma (PASEF), herhangi bir hassasiyet kaybı olmadan saniyede yüzlerce MS/MS olayına izin verir9.

Bu çalışmanın temel amacı, hareketlilik tuzağında paralel birikim ve ardından sıralı parçalanma ve çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) kullanarak DDA’nın son gelişmelerini göstermekti. Histon PTM’leri, tutma sürelerine (RT’ler), hareketliliklerine ve parçalanma modellerine göre güvenle atandı.

Protocol

NOT: Histon örnekleri, Bhanu ve ark. (2020)12. 1. Numune hazırlama Kültürlenmiş hücrelerin toplanmasıHücreler birleştiğinde, tripan mavisi dışlamasını kullanarak canlı olduklarından emin olun.NOT: Bu deneyler için bir HeLa S3 hücre hattı kullanıldı, ancak bu yöntem herhangi bir kültürlenmiş hücreye uygulanabilir. Ortamı aspire edin, ardından her plakaya 5 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) …

Representative Results

Aşağıdan yukarıya bir proteomik iş akışı (Şekil 7) tipik olarak aşağıdakileri içerir: ham bir numuneden hedef protein(ler)in ekstraksiyonu, ardından protein(ler)in konsantrasyonunun ölçülmesi ve ardından genellikle jel elektroforezi veya sıvı kromatografisi ile fraksiyonlama. Fraksiyonlamadan sonra, proteinler bir proteolitik enzim (genellikle tripsin) kullanılarak sindirilir ve son olarak, elde edilen peptitlerin kütle spektrometrik analizi ve yerleşik bir veri taban?…

Discussion

Histonlar, dört çekirdek histondan (H2A, H2B, H3 ve H4’ün ikişer tane) oluşan oktamerler şeklinde DNA ile etkileşime girerek kromatin yapısını düzenleyen temel proteinlerdir.20. Histonlar, kolayca değiştirilebilen çok sayıda lizin ve arginin kalıntısı içerir, bu da histon fonksiyonunu etkileyerek veya diğer hücresel proteinlere bağlanarak kromatin kimyasını değiştiren kapsamlı PTM’lere yol açar21. PTM’ler, çeşitli hastalıklarda, özellikle de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı tarafından Hibe No kapsamında desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. HRD-1547798 ve Hibe No. HRD-2111661. Bu NSF Hibeleri, Bilim ve Teknolojide Araştırma Mükemmeliyet Merkezleri (CREST) Programının bir parçası olarak Florida Uluslararası Üniversitesi’ne verildi. Bu, Florida Uluslararası Üniversitesi’nde Seçkin Bir Program olan Çevre Enstitüsü’nden 1672 numaralı katkıdır. Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından Hibe No. kapsamında ek destek sağlanmıştır. R21AI135469 Francisco Fernandez-Lima ve Grant No. R01HD106051 Benjamin A. Garcia’ya ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından Hibe No. CHE-2127882’den Benjamin A. Garcia’ya. Yazarlar, ilk yöntem geliştirmeleri sırasında Dr. Mario Gomez Hernandez’in ilk desteğini kabul etmek isterler.

Materials

-80 °C Freezer
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 Animal Origin-Free
1 mL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060710 Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 14-282-300 Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL
10 µL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060100 Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked
10% NP-40 Thermo Fisher Scientific 28324 NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution
10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ (Mediatech) MT21031CM
15 mL Conical Tubes Corning 352196 Falcon Conical Centrifuge Tubes
200 µL Gel-Loading Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 02-707-138 Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL
200 µL Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 94060310 Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610737 Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE
50 mL Conical Tubes Corning 352070 Falcon Conical Centrifuge Tubes
96-well flat bottom plate Thermo Fisher Scientific 12565501
96-well plate, V-Bottom 600 μL Axygen P-DW-500-C-S
Acetone Sigma Aldrich 179124 ACS reagent, ≥99.5%
Acetonitrile (ACN) Thermo Fisher Scientific A998 HPLC, Fisher Chemical
Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade Thermo Fisher Scientific LS120 Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific
AEBSF Thermo Fisher Scientific 328110500 AEBSF hydrochloride, 98%
Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 Sigma Aldrich 09830 BioUltra, ≥99.5% (T)
Ammonium hydroxide solution, NH4OH Sigma Aldrich AX1303 Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS
Argon (Ar) Airgas AR HP 300
BEH C18 HPLC column Waters 186003625 XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A7906 Heat shock fraction, pH 7, ≥98%
Calcium chloride, CaCl2 Sigma Aldrich C4901 Anhydrous, powder, ≥97%
Cell dissociation buffer Thermo Fisher Scientific 13151014
Ceramic scoring wafer Restek 20116
Compass DataAnalysis 6.0 Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2 Bruker Daltonics
Compass IsotopePattern Bruker Daltonics
Compass timsControl 4.1 Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 1610436
Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 89237526
Disposable Cell Lifters Thermo Fisher Scientific  08100240 Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers
Disposable Pellet Pestles Thermo Fisher Scientific 12-141-363 Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher Scientific P2325 1 M
Formic acid (FA) Sigma Aldrich 695076 ACS reagent, ≥96%
Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD (Molex (Polymicro) TSP075375
Glacial Acetic Acid Thermo Fisher Scientific A38S Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical
Glass Pasteur Pipettes Sigma Aldrich BR747725-1000EA
High-Performance Liquid Chromatograph  Shimadzu Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System
Hydrochloric acid, HCl Sigma Aldrich 258148 ACS reagent, 37%
Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å Thermo Fisher Scientific 60106-402
Hypersep cartridge Thermo Fisher Scientific 60109-404
LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF Agilent G1969-85000 TuningMix
Magnesium chloride, MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Anhydrous, ≥98%
Methanol, for HPLC Thermo Fisher Scientific A454 Optima for HPLC, Fisher Chemical  
Microcentrifuge Tube Adapters GL Sciences 501021514
Microcystin Thermo Fisher Scientific 50-200-8727 Enzo Life Sciences Microcystin-LA
MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm LEAP PAL Parts LAP.11190933
Nanodrop Thermo Fisher Scientific model: ND3300
Nitrogen (N2) Airgas NI UHP300
PEAKS Studio X+ Bioinformatic Solutions
pH indicator strips, Instachek Micro Essential Lab JR-113 Model: Hydrion
Potassium chloride, KCl Sigma Aldrich P3911 ACS reagent, 99.0%–100.5%
Pressure Injection Cell Next Advance  model: PC77
Propionic Anhydride Sigma Aldrich 8.00608 For synthesis
Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) NuAire, model: Nuwind NU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g ESI Source Solutions r13.aq.0003
SDS-PAGE Gels Bio-Rad 4569035 Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells
Sodium butyrate Thermo Fisher Scientific A11079.06 98+%
Sodium chloride, NaCl Sigma Aldrich S9888 ACS reagent, ≥99.0%
SPE disk, C18 VWR 76333-134 Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm
SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor Savant model: SC210A
Sucrose Millipore 1.07651 suitable for microbiology
Sulfuric acid, H2SO4  Sigma Aldrich 339741 99.999%
TIMS-ToF Mass Spectrometer Bruker Daltonics model Tims tof ms
Trichloroacetic acid solution, TCA Sigma Aldrich T0699 6.1 N
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Aldrich 302031 Suitable for HPLC, ≥99.0%
Triversa Nanomate Advion model: TR263
TrypsinProtease, MS Grade Thermo Fisher Scientific 90057
Tube rotator Thermo Fisher Scientific 88881001
Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific 88880017
Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade Thermo Fisher Scientific LS118 Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific 

References

  1. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245 (2019).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
  4. Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
  5. Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
  6. Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
  7. Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
  8. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  9. Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
  10. Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
  11. Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
  12. Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756 (2020).
  13. Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
  14. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  15. Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
  16. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138 (2021).
  17. Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619 (2021).
  18. Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14 (2020).
  19. Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
  20. Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
  21. Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
  22. Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
  23. Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).
  24. Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
  25. Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
  26. Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
  27. Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
  28. Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
  29. Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).

Play Video

Cite This Article
Fernandez-Rojas, M., Fuller, C. N., Valadares Tose, L., Willetts, M., Park, M. A., Bhanu, N. V., Garcia, B. A., Fernandez-Lima, F. Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (203), e65589, doi:10.3791/65589 (2024).

View Video