Criblage de modification des histones par chromatographie liquide, spectrométrie de mobilité des ions piégés et spectrométrie de masse à temps de vol
Summary
Un flux de travail analytique basé sur la chromatographie liquide, la spectrométrie de mobilité des ions piégés et la spectrométrie de masse à temps de vol (LC-TIMS-TOF MS/MS) pour une analyse ascendante hautement fiable et hautement reproductible des modifications et de l’identification des histones en fonction des principaux paramètres (temps de rétention [RT], section efficace de collision [CCS] et rapport masse/charge précis [m/z]).
Abstract
Les protéines d’histones sont très abondantes et conservées chez les eucaryotes et jouent un rôle important dans la régulation des gènes grâce à des structures connues sous le nom de modifications post-traductionnelles (PTM). L’identification de la position et de la nature de chaque PTM ou modèle de PTM par rapport à des facteurs externes ou génétiques permet de corréler statistiquement cette information avec des réponses biologiques telles que la transcription, la réplication ou la réparation de l’ADN. Dans le présent travail, un protocole analytique à haut débit pour la détection des PTM d’histones à partir d’échantillons biologiques est décrit. L’utilisation de la chromatographie liquide complémentaire, de la spectrométrie de mobilité des ions piégés et de la spectrométrie de masse à temps de vol (LC-TIMS-TOF MS/MS) permet de séparer et d’attribuer PTM les modifications les plus pertinentes sur le plan biologique en une seule analyse. L’approche décrite tire parti des développements récents de l’acquisition de données dépendantes (DDA) en utilisant l’accumulation parallèle dans le piège de mobilité, suivie d’une fragmentation séquentielle et d’une dissociation induite par la collision. Les PTM d’Histones sont attribués en toute confiance en fonction de leur temps de rétention, de leur mobilité et de leur modèle de fragmentation.
Introduction
Dans les cellules eucaryotes, l’ADN est emballé sous forme de chromatine dans des unités fonctionnelles appelées nucléosomes. Ces unités sont composées d’un octamère de quatre histones centrales (deux de chacune des catégories H2A, H2B, H3 et H4)1,2,3,4. Les histones sont parmi les protéines les plus abondantes et les mieux conservées chez les eucaryotes, qui sont en grande partie responsables de la régulation des gènes5. Les modifications post-traductionnelles des histones (PTM) jouent un rôle important dans la régulation de la dynamique de la chromatine et truquent divers processus biologiques tels que la transcription, la réplication et la réparation de l’ADN6. Les PTM se produisent principalement sur la surface accessible des régions N-terminales des histones qui sont en contact avec l’ADN 3,7. Cependant, les modifications de la queue et du noyau influencent la structure de la chromatine, modifiant les interactions internucléosomiques et recrutant des protéines spécifiques 3,8.
Un défi actuel de la protéomique basée sur la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) est la coélution potentielle d’analytes d’intérêt. Dans le cas des analyses dépendantes des données (DDA), cela se traduit par la perte potentielle de plusieurs ions précurseurs au cours du processus d’acquisition MS/MS9. Les instruments à temps de vol (ToF) acquièrent des spectres à très haute fréquence 9,10 (jusqu’à des dizaines de kHz)11 ; cela les rend capables de balayer rapidement les ions précurseurs totaux dans un échantillon complexe (MS1), promettant ainsi une sensibilité et des taux de séquençage MS/MS optimaux (jusqu’à 100 Hz)9 et les rendant idéaux pour l’analyse d’échantillons biologiques10. Néanmoins, la sensibilité disponible à ces vitesses de balayage élevées est limitée par le taux MS/MS9. L’ajout de la spectrométrie de mobilité des ions piégés (TIMS) en combinaison avec un spectromètre de masse orthogonal quadripolaire à temps de vol (qToF) a été utilisé pour atténuer ces limitations. Dans TIMS, tous les ions précurseurs sont accumulés en tandem et élués en fonction de leur mobilité, plutôt que de sélectionner des masses précurseurs uniques avec unquadripôle 9. La fragmentation en série par accumulation parallèle (PASEF) permet des centaines d’événements MS/MS par seconde sans aucune perte de sensibilité9.
L’objectif principal de ce travail était de montrer les développements récents de la DDA en utilisant une accumulation parallèle dans le piège de mobilité suivie d’une fragmentation séquentielle et d’une dissociation induite par collision (CID). Les PTM d’Histones ont été attribués en toute confiance en fonction de leurs temps de rétention (RT), de leurs mobilités et de leurs modèles de fragmentation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les histones sont des protéines de base qui régulent la structure de la chromatine en interagissant avec l’ADN sous forme d’octamères constitués des quatre histones centrales (deux de chacune des H2A, H2B, H3 et H4)20. Les histones contiennent de nombreux résidus de lysine et d’arginine, qui sont facilement modifiés, ce qui conduit à des PTM étendus qui modifient la chimie de la chromatine en influençant la fonction des histones ou en se liant à d’autres protéines cellulaires<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce matériel est basé sur des travaux soutenus par la National Science Foundation dans le cadre de la subvention No. HRD-1547798 et Grant No. HRD-2111661. Ces subventions NSF ont été accordées à la Florida International University dans le cadre du programme Centers of Research Excellence in Science and Technology (CREST). Il s’agit de la contribution numéro 1672 de l’Institut de l’environnement, un programme prééminent de l’Université internationale de Floride. Un soutien supplémentaire a été fourni par l’Institut national de la santé dans le cadre de la subvention n°. R21AI135469 à Francisco Fernandez-Lima et Grant No. R01HD106051 à Benjamin A. Garcia, ainsi que par la National Science Foundation sous la subvention No. CHE-2127882 à Benjamin A. Garcia. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Mario Gomez Hernandez pour son soutien initial lors du développement initial de la méthode.
Materials
| -80 °C Freezer | |||
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Animal Origin-Free |
| 1 mL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL |
| 10 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked |
| 10% NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution |
| 10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ | (Mediatech) | MT21031CM | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352196 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 200 µL Gel-Loading Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 02-707-138 | Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL |
| 200 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060310 | Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 352070 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 96-well flat bottom plate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| 96-well plate, V-Bottom 600 μL | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Acetonitrile (ACN) | Thermo Fisher Scientific | A998 | HPLC, Fisher Chemical |
| Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
| AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | AEBSF hydrochloride, 98% |
| Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 | Sigma Aldrich | 09830 | BioUltra, ≥99.5% (T) |
| Ammonium hydroxide solution, NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS |
| Argon (Ar) | Airgas | AR HP 300 | |
| BEH C18 HPLC column | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Heat shock fraction, pH 7, ≥98% |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | Anhydrous, powder, ≥97% |
| Cell dissociation buffer | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Ceramic scoring wafer | Restek | 20116 | |
| Compass DataAnalysis 6.0 | Bruker Datonics | ||
| Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
| Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
| Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
| Disposable Cell Lifters | Thermo Fisher Scientific | 08100240 | Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers |
| Disposable Pellet Pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| Formic acid (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS reagent, ≥96% |
| Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD | (Molex (Polymicro) | TSP075375 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38S | Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical |
| Glass Pasteur Pipettes | Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | |
| High-Performance Liquid Chromatograph | Shimadzu | Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System | |
| Hydrochloric acid, HCl | Sigma Aldrich | 258148 | ACS reagent, 37% |
| Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å | Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
| Hypersep cartridge | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
| LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥98% |
| Methanol, for HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima for HPLC, Fisher Chemical |
| Microcentrifuge Tube Adapters | GL Sciences | 501021514 | |
| Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Microcystin-LA |
| MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm | LEAP PAL Parts | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | model: ND3300 | |
| Nitrogen (N2) | Airgas | NI UHP300 | |
| PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
| pH indicator strips, Instachek | Micro Essential Lab | JR-113 | Model: Hydrion |
| Potassium chloride, KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS reagent, 99.0%–100.5% |
| Pressure Injection Cell | Next Advance | model: PC77 | |
| Propionic Anhydride | Sigma Aldrich | 8.00608 | For synthesis |
| Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) | NuAire, model: Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells |
| Sodium butyrate | Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98+% |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| SPE disk, C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm |
| SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor | Savant | model: SC210A | |
| Sucrose | Millipore | 1.07651 | suitable for microbiology |
| Sulfuric acid, H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
| TIMS-ToF Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | model Tims tof ms | |
| Trichloroacetic acid solution, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 N |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Suitable for HPLC, ≥99.0% |
| Triversa Nanomate | Advion | model: TR263 | |
| TrypsinProtease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| Tube rotator | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
| Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
References
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