Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie
Summary
Ein analytischer Arbeitsablauf, der auf Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) basiert, für eine hochzuverlässige und hochgradig reproduzierbare “Bottom-up”-Analyse von Histonmodifikationen und -identifizierung basierend auf Hauptparametern (Retentionszeit [RT], Kollisionsquerschnitt [CCS] und genaues Masse-zu-Ladungs-Verhältnis [m/z]).
Abstract
Histonproteine sind bei Eukaryoten sehr häufig und konserviert und spielen aufgrund von Strukturen, die als posttranslationale Modifikationen (PTMs) bekannt sind, eine große Rolle bei der Genregulation. Die Identifizierung der Position und Art jedes PTMs oder Musters von PTMs in Bezug auf externe oder genetische Faktoren ermöglicht es, diese Informationen statistisch mit biologischen Reaktionen wie DNA-Transkription, Replikation oder Reparatur zu korrelieren. In der vorliegenden Arbeit wird ein Hochdurchsatz-Analyseprotokoll für den Nachweis von Histon-PTMs aus biologischen Proben beschrieben. Der Einsatz von komplementärer Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) ermöglicht die Trennung und PTM-Zuordnung der biologisch relevantesten Modifikationen in einer einzigen Analyse. Der beschriebene Ansatz nutzt die jüngsten Entwicklungen in der abhängigen Datenerfassung (DDA) mit paralleler Akkumulation in der Mobilitätsfalle, gefolgt von sequentieller Fragmentierung und kollisionsinduzierter Dissoziation. Histon-PTMs werden basierend auf ihrer Retentionszeit, Mobilität und ihrem Fragmentierungsmuster sicher zugewiesen.
Introduction
In eukaryotischen Zellen wird DNA als Chromatin in funktionelle Einheiten verpackt, die Nukleosomen genannt werden. Diese Einheiten bestehen aus einem Oktamer von vier Kernhistonen (je zwei von H2A, H2B, H3 und H4)1,2,3,4. Histone gehören zu den am häufigsten vorkommenden und am höchsten konservierten Proteinen in Eukaryoten, die maßgeblich für die Genregulation verantwortlich sind5. Posttranslationale Histonmodifikationen (PTMs) spielen eine große Rolle bei der Regulation der Chromatindynamik und steuern verschiedene biologische Prozesse wie DNA-Transkription, -Replikation und -Reparatur6. PTMs treten hauptsächlich auf der zugänglichen Oberfläche der N-terminalen Regionen von Histonen auf, die mit DNA in Kontakt stehen 3,7. Schwanz- und Kernmodifikationen beeinflussen jedoch die Chromatinstruktur, verändern die Internukleosomeninteraktionen und rekrutieren spezifische Proteine 3,8.
Eine aktuelle Herausforderung bei der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-basierten Proteomik ist die potenzielle Co-Elution von Analyten von Interesse. Bei datenabhängigen Analysen (DDA) bedeutet dies den potenziellen Verlust mehrerer Vorläuferionen während des MS/MS-Erfassungsprozesses9. Time-of-Flight (ToF)-Instrumente erfassen Spektren mit sehr hoher Frequenz 9,10 (bis zu zehn kHz)11; Dadurch sind sie in der Lage, die gesamten Vorläuferionen innerhalb einer komplexen Probe (MS1) schnell zu scannen, was eine optimale Empfindlichkeit und MS/MS-Sequenzierungsraten (bis zu 100 Hz)9 verspricht und sie ideal für die biologische Probenanalysemacht 10. Die Empfindlichkeit, die bei diesen hohen Scanraten verfügbar ist, ist jedoch durch die MS/MS-Rate9 begrenzt. Die Hinzufügung der Gefangenen-Ionen-Mobilitätsspektrometrie (TIMS) in Kombination mit einem orthogonalen Quadrupol-Flugzeitspektrometer (qToF) wurde verwendet, um diese Einschränkungen zu mildern. In TIMS werden alle Vorläuferionen im Tandem akkumuliert und in Abhängigkeit von ihrer Mobilität eluiert, anstatt einzelne Vorläufermassen mit einem Quadrupol9 auszuwählen. Die parallele Akkumulations-serielle Fragmentierung (PASEF) ermöglicht Hunderte von MS/MS-Ereignissen pro Sekunde ohne Verlust der Empfindlichkeit9.
Das Hauptziel dieser Arbeit war es, die jüngsten Entwicklungen der DDA unter Verwendung von paralleler Akkumulation in der Mobilitätsfalle, gefolgt von sequentieller Fragmentierung und kollisionsinduzierter Dissoziation (CID), aufzuzeigen. Histon-PTMs wurden basierend auf ihren Retentionszeiten (RTs), Mobilitäten und Fragmentierungsmustern sicher zugewiesen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Histone sind grundlegende Proteine, die die Chromatinstruktur regulieren, indem sie mit der DNA in Form von Oktameren interagieren, die aus den vier Kernhistonen (je zwei von H2A, H2B, H3 und H4) bestehen20. Histone enthalten zahlreiche Lysin- und Argininreste, die leicht modifiziert werden können, was zu umfangreichen PTMs führt, die die Chromatinchemie verändern, indem sie die Histonfunktion beeinflussen oder an andere zelluläre Proteine binden21. PTMs können biologi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Material basiert auf Arbeiten, die von der National Science Foundation unter der Fördernummer unterstützt werden. HRD-1547798 und Grant No. HRD-2111661. Diese NSF-Zuschüsse wurden der Florida International University im Rahmen des CREST-Programms (Centers of Research Excellence in Science and Technology) gewährt. Dies ist der Beitrag Nummer 1672 des Institute of Environment, einem herausragenden Programm an der Florida International University. Zusätzliche Unterstützung wurde vom National Institute of Health im Rahmen des Grant No. R21AI135469 an Francisco Fernandez-Lima und Grant No. R01HD106051 an Benjamin A. Garcia sowie von der National Science Foundation unter Grant No. CHE-2127882 an Benjamin A. Garcia. Die Autoren danken Dr. Mario Gomez Hernandez für die anfängliche Unterstützung bei der ersten Methodenentwicklung.
Materials
| -80 °C Freezer | |||
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Animal Origin-Free |
| 1 mL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL |
| 10 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked |
| 10% NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution |
| 10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ | (Mediatech) | MT21031CM | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352196 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 200 µL Gel-Loading Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 02-707-138 | Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL |
| 200 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060310 | Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 352070 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 96-well flat bottom plate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| 96-well plate, V-Bottom 600 μL | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Acetonitrile (ACN) | Thermo Fisher Scientific | A998 | HPLC, Fisher Chemical |
| Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
| AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | AEBSF hydrochloride, 98% |
| Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 | Sigma Aldrich | 09830 | BioUltra, ≥99.5% (T) |
| Ammonium hydroxide solution, NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS |
| Argon (Ar) | Airgas | AR HP 300 | |
| BEH C18 HPLC column | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Heat shock fraction, pH 7, ≥98% |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | Anhydrous, powder, ≥97% |
| Cell dissociation buffer | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Ceramic scoring wafer | Restek | 20116 | |
| Compass DataAnalysis 6.0 | Bruker Datonics | ||
| Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
| Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
| Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
| Disposable Cell Lifters | Thermo Fisher Scientific | 08100240 | Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers |
| Disposable Pellet Pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| Formic acid (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS reagent, ≥96% |
| Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD | (Molex (Polymicro) | TSP075375 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38S | Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical |
| Glass Pasteur Pipettes | Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | |
| High-Performance Liquid Chromatograph | Shimadzu | Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System | |
| Hydrochloric acid, HCl | Sigma Aldrich | 258148 | ACS reagent, 37% |
| Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å | Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
| Hypersep cartridge | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
| LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥98% |
| Methanol, for HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima for HPLC, Fisher Chemical |
| Microcentrifuge Tube Adapters | GL Sciences | 501021514 | |
| Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Microcystin-LA |
| MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm | LEAP PAL Parts | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | model: ND3300 | |
| Nitrogen (N2) | Airgas | NI UHP300 | |
| PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
| pH indicator strips, Instachek | Micro Essential Lab | JR-113 | Model: Hydrion |
| Potassium chloride, KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS reagent, 99.0%–100.5% |
| Pressure Injection Cell | Next Advance | model: PC77 | |
| Propionic Anhydride | Sigma Aldrich | 8.00608 | For synthesis |
| Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) | NuAire, model: Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells |
| Sodium butyrate | Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98+% |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| SPE disk, C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm |
| SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor | Savant | model: SC210A | |
| Sucrose | Millipore | 1.07651 | suitable for microbiology |
| Sulfuric acid, H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
| TIMS-ToF Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | model Tims tof ms | |
| Trichloroacetic acid solution, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 N |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Suitable for HPLC, ≥99.0% |
| Triversa Nanomate | Advion | model: TR263 | |
| TrypsinProtease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| Tube rotator | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
| Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
References
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