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Immunology and Infection

Rilevamento simultaneo di diverse classi di anticorpi in un test sierologico multiplexato

Published: July 14, 2023
doi:
10.3791/65323
, , , , , , , , , , ,
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen, 2Department of Neurology,Sächsisches Krankenhaus Rodewisch, 3Department of Epidemiology,Helmholtz Centre for Infection Research, 4German Centre for Infection Research (DZIF)

Summary

Un sistema di analisi del flusso di fluorescenza a doppio reporter a tre canali è stato utilizzato per sviluppare un test immunologico multiplex basato su microsfere che valuta simultaneamente i campioni di siero per IgG e IgM suscitati contro più antigeni di diverse specie di Borrelia che causano la borreliosi di Lyme in Europa e Nord America.

Abstract

Per monitorare la progressione delle malattie infettive, è utile valutare l’immunoreattività nei confronti di vari determinanti antigenici e misurare diversi isotipi anticorpali perché compaiono in fasi diverse della risposta immunitaria dell’ospite. Con la borreliosi di Lyme, l’agente patogeno può essere uno dei molteplici membri della specie Borrelia . Pertanto, una corretta classificazione dei campioni richiede la valutazione dell’immunoreattività contro diversi antigeni di diverse specie di Borrelia . Inoltre, le risposte anti-patogene IgG e IgM possono avere diversi decorsi temporali di elicitazione durante la progressione della malattia. Qui dimostriamo lo sviluppo di un test immunologico multiplex a due reporter che ha utilità nell’identificare la risposta immunitaria specifica per Borrelia in campioni di siero umano valutando simultaneamente l’immunoreattività sia IgG che IgM contro diversi antigeni batterici nello stesso pozzetto di reazione. Questo approccio a doppio reporter mantiene le prestazioni analitiche dei metodi a reporter singolo, risparmiando tempo e risorse e riducendo i requisiti di dimensione del campione. Questo test consente essenzialmente di raddoppiare le informazioni sierologiche da un campione di sangue nella metà del tempo.

Introduction

La borreliosi di Lyme è la malattia infettiva trasmessa dalle zecche più comune nei climi moderati dell’emisfero settentrionale1. È causata da batteri spirocheta del genere Borrelia, con cinque patogeni umani noti che variano nella distribuzione geografica2. Le principali specie patogene di Borrelia in Europa sono B. afzelii e B. garinii, mentre B. burgdorferi s.s., B. spielmanii e B. bavariensis sono implicate meno frequentemente. In Nord America, B. burgdorferi s.s. è l’unico agente eziologico della borreliosidi Lyme 2,3. I patogeni della Borrelia sono trasmessi dai membri del genere di zecche Ixodes, con trasmissione in grado di avvenire entro 24 ore dal morso della zecca4.

La diagnosi di borreliosi di Lyme è tipicamente fatta dai sintomi clinici e successivamente confermata dalla sierologia. Sia in Europa che in Nord America, le linee guida diagnostiche raccomandano una serie di test in due fasi che consistono in un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) con un immunoblot riflesso per valutare la risposta anticorpale contro gli antigeni specifici di Borrelia 1,5,6,7,8,9 . Tuttavia, questo approccio manca di sensibilità e non è ottimale, in particolare nella fase iniziale dell’infezione, quando la sieroconversione può essere incompleta e i titoli di IgG e IgM anti-Borrelia sono troppo bassi6.

I dosaggi immunologici multiplex migliorano i dosaggi immunologici tradizionali che misurano un solo bersaglio alla volta e possono valutare simultaneamente più risposte isotipiche anticorpali contro uno o più antigeni 10,11,12. I saggi come ELISA si limitano a identificare e quantificare un singolo analita per reazione, nel caso attuale le IgG circolanti o le IgM indotte contro un singolo antigene batterico dopo l’infezione da Borrelia. Questo rapporto illustra l’utilizzo della tecnologia di profilazione degli analiti basata su microsfere per lo sviluppo di un test immunologico multiplex che rileva simultaneamente gli anticorpi IgG e IgM contro uno qualsiasi degli antigeni Borrelia qui scelti in campioni di siero umano. Abbiamo selezionato quattro antigeni che insieme coprono le specie patogene più comuni di Borrelia originarie dell’Europa (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) e Nord America (B. burgdorferi s.s.) (Tabella 1) 2,3. Ciò consente l’identificazione decisiva dei patogeni e la capacità di discernere l’immunoreattività delle IgM precoci e delle IgG successive, più durevoli, nei campioni dei pazienti.

Isotipo bersaglio Canale Reporter Antigene Specie Borrelia Sforzo Concentrazione di accoppiamento dell’antigene
Igm PE OspC B. garinii 20047 5,0 μg/106 perline
IgG BV421 VlsE B. burgdorferi s.s B31 (Inglese) 1,25 μg/106 perline
IgG BV421 DbpA B. burgdorferi s.s. ZS7 10,0 μg/106 perline
IgG BV421 DbpA B. afzelii PKo 5,0 μg/106 perline

Tabella 1: Antigeni rappresentativi di Borrelia utilizzati per lo sviluppo di saggi multiplex.

Inizialmente abbiamo sviluppato un test immunologico a singolo reporter che ha rilevato anticorpi anti-antigene IgG o IgM anti-Borrelia in due reazioni separate e poi abbiamo unito questi test in un test multiplex a doppio reporter che misura entrambi gli isotipi di anticorpi nella stessa miscela di reazione. Le microsfere magnetiche vengono accoppiate a un antigene bersaglio del patogeno di interesse e quindi incubate con campioni di siero del paziente. L’antigene accoppiato a microsfere viene riconosciuto e cattura sia le IgG che le IgM circolanti nel siero generato in una risposta immunitaria contro l’antigene patogeno. La specificità delle IgG rispetto alle IgM del test è determinata dalla selezione di un anticorpo secondario che si lega alle IgG o alle IgM, ciascuna con un segnale fluoroforico distinto associato ai due anticorpi secondari. Ogni segnale fluorescente viene rilevato in uno dei due canali reporter dello strumento (cioè dual-reporter) che ha un diverso laser di eccitazione e cattura dell’emissione specifico per il singolo fluoroforo utilizzato per rilevare IgG o IgM (in questo caso Brilliant Violet 421 o ficoeritrina, rispettivamente). Il canale di classificazione dello strumento identifica il colorante codificato a colori inerente a diversi set di perline. Pertanto, più antigeni bersaglio possono essere accoppiati a perle colorate in modo diverso e i set di microsfere possono essere mescolati insieme e utilizzati per valutare in modo completo diverse immunoreattività anti-patogeno in campioni di siero. Il canale di classificazione identifica ogni singolo set di microsfere (cioè l’antigene specifico) e misura la fluorescenza associata a IgG o IgM contro quell’antigene. Il test multiplex risultante consente di risparmiare tempo e risorse rispetto ai test classici meno completi e cataloga accuratamente l’immunoreattività di Lyme in volumi di campione limitati. Mentre un simile approccio dual-reporter è stato precedentemente utilizzato per classificare le risposte immunitarie in altre patologie come l’infezione da SARS-CoV-213, questo rapporto descrive in dettaglio l’applicazione della tecnologia di test fluorescente multiplex per caratterizzare l’immunoreattività nella borreliosi di Lyme.

Protocol

È stata ricevuta l’approvazione appropriata del Comitato di revisione istituzionale/Comitato etico per l’uso di campioni di siero umano in questa serie sperimentale. I campioni erano materiali residui anonimizzati provenienti da uno studio nazionale tedesco sulla sieroprevalenza di SARS-CoV-214. L’approvazione per l’uso di campioni umani è stata concessa dal Comitato Etico della Hannover Medical School, Germania (9086_BO_S_2020). Un totale di 21 campioni di siero umano sono stati utilizzati in questo studio. 1. Approvazione etica per l’uso di campioni umani Ottenere le approvazioni etiche appropriate per l’uso di campioni umani. 2. Reagenti e attrezzature Campioni di siero umano: eseguire la convalida tecnica del test e il controllo di qualità utilizzando campioni di siero di persone a cui è stata precedentemente diagnosticata la borreliosi di Lyme o che hanno dimostrato di essere stati immunitari negativi alla Borrelia 12,14. Strumentazione a reporter singolo. Utilizzare uno strumento a reporter singolo a due canali (Table of Materials) per lo sviluppo iniziale del saggio e la convalida tecnica.NOTA: Il sistema single-reporter è dotato di due laser: 1) identifica e quantifica la fluorescenza specifica del set di microsfere per discriminare diversi set di microsfere, se utilizzati (canale di classificazione) e 2) rileva e quantifica la fluorescenza della ficoeritrina (PE) specifica per il bersaglio legato alle microsfere (canale reporter; eccitazione 532 nm, emissione “arancione” 565-585 nm). Pertanto, solo una singola classe di isotipi di anticorpi (ad esempio, IgG o IgM) può essere analizzata contemporaneamente utilizzando il singolo Reporter Channel.Eseguire studi di convalida iniziali per valutare separatamente le IgG e le IgM anti-Borrelia , in un formato a 96 pozzetti a reporter singolo che utilizza reagenti di rilevamento marcati con PE per entrambe le classi di anticorpi.NOTA: L’attuale test valuta le IgG circolanti specifiche per l’antigene Borrelia VlsE e due varianti di DbpA e le IgM circolanti specifiche per l’antigene OspC, come esempi rappresentativi. Il test può essere ampliato per valutare l’immunoreattività sierica contro altri antigeni anti-Borrelia , come desiderato12. Strumentazione a doppio reporter. Utilizzare uno strumento a tre canali a doppio reporter (Table of Materials) che consenta l’analisi simultanea di IgG/IgM nella stessa reazione, per lo sviluppo e la validazione tecnica del doppio test IgM/IgG (dettagliato di seguito). Questo strumento dispone di 3 canali di rilevamento della fluorescenza totale, di cui 2 sono Canali Reporter che valutano i segnali associati alle Ig mirate.NOTA: Il sistema a doppio reporter è dotato di tre laser: 1) identifica e quantifica la fluorescenza specifica del set di microsfere (canale di classificazione); 2) rileva e quantifica la fluorescenza della ficoeritrina (PE) target-specifica (Reporter Channel 1; eccitazione 532 nm, emissione “arancione” 565-585 nm) e 3) valuta la fluorescenza target-specifica Brilliant Violet 421 (BV421) di un secondo analita target (Reporter Channel 2; eccitazione 405 nm, emissione “blu” 421-441 nm). Il sistema a doppio reporter è compatibile con i formati di saggio per microtitolazione a 96 e 384 pozzetti (manipolazione semiautomatica). Lo schema generale del saggio è mostrato nella Figura 1. I passaggi del protocollo sono descritti di seguito. 3. Accoppiamento dell’antigene Accoppiare gli antigeni Borrelia a microsfere magnetiche, carbossilate e fluorescenti da 6,5 μm (microsfere; Tabella dei materiali) utilizzando la chimica dell’1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide (EDC)/sulfo-N-idrossisuccinimide (sNHS).NOTA: Una descrizione dettagliata è disponibile nel riferimento11e nel riferimento12. Trova la concentrazione di accoppiamento di ciascun antigene nella Tabella 1. Le perline accoppiate devono essere conservate al buio a 4 °C fino all’uso. Tutti i tamponi utilizzati nelle reazioni di accoppiamento e rilevamento sono descritti in dettaglio nei materiali supplementari. 4. Procedura di analisi: test sierologico IgG o IgM a reporter singolo: formato a 96 pozzetti Diluire il campione in 2 fasi (2 fasi, entrambe in piastre da 96 pozzetti; diluizione del campione di siero di 200 volte nel tampone del saggio).NOTA: La composizione del tampone del saggio è una miscela 1:4 di PBS Low Cross Buffer: contenente l’1% (p/v) di albumina sierica bovina. Tween-20 viene aggiunto alla miscela fino a una concentrazione finale dello 0,05 % (v/v).Fase 1 della diluizione del campione: Miscelare 5 μL del campione di siero con 120 μL del tampone del saggio (diluizione 25 volte). Fase 2 della diluizione del campione: Diluire ulteriormente la diluizione del campione di 25 volte 8 volte mescolando 10 μL di diluizione con 70 μL del tampone del saggio per ottenere la diluizione finale del campione di 200 volte. Diluizione della miscela di microsfere magnetichePreparare una miscela di microsfere contenente 1,0 × 106 perline/mL per popolazione di microsfere (cioè per antigene bersaglio unico). Diluire la miscela di microsfere preparata di 25 volte nel tampone del saggio per rendere la concentrazione finale di microsfere in questa sospensione diluita è ora di 4 × 104 perline/mL per popolazione di microsfere (cioè per antigene bersaglio unico). Incubazione del campione di siero con perlinePipettare 25 μL di sospensione di microsfere multiplex accoppiate diluite (contenenti 4,0 × 104 microsbead/set/mL) nei pozzetti assegnati di una piastra per microtitolazione a semiarea da 96 pozzetti (Tabella dei materiali). Aggiungere 25 μL di campione di siero diluito 200 volte (dal punto 4.1 sopra) in pozzetti appropriati contenenti 25 μL di sospensione a microsfere accoppiate.NOTA: Questo produce un’ulteriore diluizione di 2 volte, quindi la diluizione finale del campione di siero nel pozzetto è di 400 volte e il conteggio finale delle microsfere è di 1000 perline/set di perline/reazione di 50 μL. Coprire la piastra di reazione a 96 pozzetti con un sigillo per micropiastre (pellicola adesiva o coperchi per piastre di plastica). Incubare la piastra per 2 ore a 20 °C, a 750 giri/min su un agitatore per piastre. Lavaggio delle perlineRimuovere la piastra di reazione a 96 pozzetti dall’agitatore per piastre e rimuovere con cautela la guarnizione adesiva della piastra. Mettere la piastra di reazione a 96 pozzetti in una rondella per piastre. Lavare le perle tre volte con tampone di lavaggio da 100 μL (1× PBS + 0,05% v/v Tween 20) utilizzando la lavatrice automatica per piastre magnetiche. Risospendere le perle lavate in 100 μL di tampone di lavaggio, coprire la piastra con una pellicola adesiva o un coperchio di plastica e agitare la piastra su uno scuotipiastra per 1 minuto a 20 °C a 1000 giri/min. Dividere le perline lavateRimuovere la piastra di reazione a 96 pozzetti dall’agitatore per piastre e rimuovere con cautela la guarnizione adesiva della piastra. Miscelare le reazioni pipettando su e giù cinque volte e trasferire 50 μL di ciascun volume di reazione da 100 μL a ciascuna delle due nuove piastre di reazione a 96 pozzetti, una piastra per la rilevazione delle IgG e una per la rilevazione delle IgM. Incubazione di anticorpi/reagenti di rilevamentoNOTA: A questo punto, le perle accoppiate all’antigene bersaglio sono state incubate con campioni di siero per estrarre gli anticorpi circolanti nel siero (se presenti) che reagiscono con l’antigene o gli antigeni. Le microsfere reagite con immunoglobuline legate sono state divise in due piastre e le IgG e le IgM sono ora rilevate e quantificate nelle loro piastre separate utilizzando anticorpi secondari specifici per l’isotipo con un’etichetta PE. Scaglionare la movimentazione del piatto di 20 min.Aspirare il surnatante dai pozzetti contenenti le biglie magnetiche utilizzando la rondella per piastre magnetiche. Per ciascuna piastra, preparare la miscela appropriata di reagenti per il rilevamento delle Ig (anti-IgG o anti-IgM), contenente IgG anti-umane di capra coniugate con PE (3 μg/mL) o IgM anti-umane d’asino coniugate con PE (5 μg/mL) nel tampone del saggio. Per ogni pozzetto contenente microsfere vengono utilizzati 30 μL di reagente di rilevazione. Preparare volumi sufficienti di reagenti per la rilevazione di IgG e IgM per i pozzetti di reazione, con un numero sufficiente di reagenti per sopportare le perdite di pipettaggio. Pipettare 30 μL di reagente per la rilevazione delle IgG in ciascun pozzetto contenente le microsfere reagite sulla piastra IgG e coprire la piastra di reazione a 96 pozzetti con un sigillo per micropiastra. Pipettare 30 μL di reagente per la rilevazione delle IgM in ciascun pozzetto contenente le microsfere reagite sulla piastra IgM e coprire la piastra di reazione a 96 pozzetti con un sigillo per micropiastre. Incubare per 45 minuti a 20 °C agitando a 750 giri/min su uno shaker a piastra. Lavaggio delle perlineRimuovere la piastra di reazione a 96 pozzetti dall’agitatore per piastre e rimuovere con cautela la guarnizione adesiva della piastra. Mettere la piastra di reazione a 96 pozzetti in una rondella magnetica per piastre. Lavare le perline tre volte con un tampone di lavaggio da 100 μL utilizzando la rondella magnetica per piastre. Risospendere le perle in 100 μL di tampone di lavaggio. Analizza i risultati sullo strumento reporter singolo.Coprire la piastra di reazione a 96 pozzetti con un sigillo per micropiastre. Agitare la piastra di reazione a 96 pozzetti per 3 minuti a 20 °C, a 1000 giri/min su uno shaker per piastre. Trasferire la piastra di reazione a 96 pozzetti dall’agitatore per piastre e inserirla in uno strumento per analizzatore di flusso a reporter singolo (Tabella dei materiali). Per ciascun campione, analizzare l’intensità fluorescente mediana (MFI) utilizzando le seguenti impostazioni dello strumento: Volume di assorbimento = 80 μL, Conteggio = 50/popolazione di microsfere, Timeout = 60 s, Gating = 7.500-15.000)12,13. 5. Procedura di analisi: test sierologico IgG e IgM a doppio reporter: formato a 96 pozzetti Diluizione del campione (2 fasi, entrambe in piastre da 96 pozzetti; diluizione del campione di siero 200 volte nel tampone del saggio)Fase 1 della diluizione del campione: miscelare un campione di siero da 5 μL con un tampone da 120 μL (diluizione 25 volte). Fase 2 della diluizione del campione: diluire le diluizioni del campione di 25 volte di altre 8 volte mescolando 10 μL della prima diluizione (campione diluito di 25 volte di cui alla sezione 5.1.1) con un tampone del saggio di 70 μL (diluizione di 8 volte), per ottenere una diluizione finale del campione a 200 volte. Diluizione della miscela di microsfere magnetichePreparare una miscela di microsfere contenente 1,0 ×10 6 microsfere accoppiate all’antigene bersaglio/mL per popolazione di microsfere (cioè per antigene bersaglio unico).NOTA: In questa serie sperimentale, abbiamo valutato sia l’immunoreattività IgG che quella IgM contro quattro antigeni unici di Borrelia in ciascuna reazione. Diluire la miscela di microsfere preparata 50 volte nel tampone del saggio. La concentrazione di microsfere in questa sospensione diluita è ora di 2,0 × 104 perline/mL per popolazione di microsfere.NOTA: Il numero di microsfere nella reazione del saggio duplex è dimezzato rispetto a quello utilizzato nella reazione a singolo reporter per consentire la comparabilità diretta tra i due saggi e per risparmiare risorse, dopo che studi preliminari hanno confermato che il segnale di fluorescenza è stato mantenuto all’interno dell’intervallo lineare di quantificazione quando si utilizza la metà del numero di perline. Incubazione del campione di siero con perlinePipettare 25 μL di sospensione diluita di microsfere accoppiate all’antigene bersaglio (contenente 2,0 × 104 microsbead/set/mL) in pozzetti preassegnati di una piastra per microtitolazione a semiarea da 96 pozzetti. Il numero esatto di pozzetti di reazione e il loro posizionamento sulla piastra dipendono dal numero totale di campioni testati determinato dall’operatore e dal fatto che verranno eseguiti pozzetti singoli o replicati per campione.NOTA: Le microsfere magnetiche accoppiate all’antigene target verranno fatte reagire con campioni di siero umano. Sia le IgG che le IgM immunoreattive dell’antigene anti-Borrelia , se presenti nei campioni, si legano e vengono immobilizzate sulle stesse perle accoppiate all’antigene. La quantificazione anticorpale secondaria di IgG e IgM legate sarà quindi eseguita sulle stesse perle nelle stesse reazioni, utilizzando diversi fluorofori per l’identificazione di IgG e IgM che ne consentono il differenziamento. Aggiungere 25 μL di siero diluito 200 volte (dal passaggio 5.1 sopra) in ciascun pozzetto contenente 25 μL di sospensione di microsfere accoppiate all’antigene bersaglio misto (passaggio 5.2).NOTA: Questo produce un’ulteriore diluizione di 2 volte, quindi la diluizione finale del campione di siero nel pozzetto è di 400 volte e il conteggio finale delle microsfere è di 500 perline/set di perline/reazione da 50 μL. Coprire la piastra di reazione a 96 pozzetti con un sigillo per micropiastre (pellicola adesiva o coperchio per piastra di plastica). Incubare la piastra con le perle per 2 ore a 20 °C, a 750 giri/min su uno scuotitore per piastre. Lavaggio delle perline (per rimuovere il campione di siero in eccesso)Rimuovere la piastra di reazione a 96 pozzetti dall’agitatore per piastre e rimuovere la guarnizione adesiva della piastra. Mettere la piastra di reazione a 96 pozzetti in una rondella magnetica per piastre. Lavare le perline tre volte con un tampone di lavaggio da 100 μL utilizzando la rondella magnetica per piastre. Aspirare il volume di lavaggio finale dalle perle dopo l’ultima fase di lavaggio. Anticorpo di rivelazione (Incubazione – Parte I)Preparare il reagente fresco a doppia rilevazione di IgG e IgM contenente IgG anti-umane di capra biotinilate (1 μg/mL) insieme a IgM anti-umane (5 μg/mL) coniugate con PE in tampone del saggio. Per ogni pozzetto contenente microsfere vengono utilizzati 30 μL di reagente a doppia rilevazione. Preparare volumi sufficienti di reagenti a doppia rivelazione IgG e IgM per i pozzetti di reazione, con un numero sufficiente di reagenti aggiuntivi per gestire le perdite di pipettaggio. Pipettare 30 μL di reagente a doppia rilevazione IgG e IgM in ciascun pozzetto assegnato e coprire la piastra di reazione a 96 pozzetti con un sigillo per micropiastra. Incubare la piastra per 45 minuti a 20 °C agitando a 750 giri/min su uno scuotitore per piastre. Lavaggio delle perline (per rimuovere gli anticorpi di rilevamento in eccesso)Rimuovere la piastra di reazione a 96 pozzetti dall’agitatore per piastre e rimuovere con cautela la guarnizione adesiva della piastra. Inserire la piastra di reazione a 96 pozzetti in una lavatrice automatica per piastre magnetiche. Lavare le perle tre volte con un tampone di lavaggio da 100 μL utilizzando la lavapiastre magnetica automatizzata. Aspirare il volume di lavaggio finale dalle perle dopo l’ultima fase di lavaggio. Reporter coniugato con streptavidina (Incubazione – Parte II)Diluire la streptavidina fresca marcata con BV421 in tampone del saggio a una concentrazione di 0,2 μg/mL. Per ogni pozzetto contenente microsfere, vengono utilizzati 30 μL di streptavidina marcata con BV421. Preparare un volume sufficiente di streptavidina marcato con BV421 per i pozzetti di reazione, con un extra sufficiente per sopportare le perdite di pipettaggio. Pipettare 30 μL di BV421-Streptavidina diluita in ciascun pozzetto di reazione e coprire la piastra di reazione a 96 pozzetti con il sigillo per micropiastra. Incubare la piastra per 30 minuti a 20 °C agitando a 750 giri/min su uno shaker per piastre. Lavare le perline (per rimuovere l’eccesso BV421-Streptavidina)Rimuovere la piastra di reazione a 96 pozzetti dall’agitatore per piastre e rimuovere con cautela la guarnizione adesiva della piastra. Inserire la piastra di reazione a 96 pozzetti nella rondella della piastra magnetica. Lavare le perle tre volte con un tampone di lavaggio da 100 μL utilizzando la lavapiastre magnetica automatizzata. Risospendere le microsfere all’interno dei pozzetti fino a un volume finale di 100 μL nel tampone di lavaggio. Analizza i risultati sullo strumento a doppio reporterCoprire la piastra di reazione a 96 pozzetti con un sigillo per micropiastre. Incubare la piastra di reazione a 96 pozzetti per 3 minuti a 20 °C, a 1000 giri/min su un agitatore per piastre. Trasferire la piastra di reazione a 96 pozzetti dall’agitatore per piastre allo strumento analizzatore di flusso a doppio reporter (Tabella dei materiali). Valutare l’intensità fluorescente mediana (MFI) del campione secondo le istruzioni del produttore (Impostazioni dello strumento: Modalità Dual-Reporter, Volume di assorbimento = 80 μL, Conteggio = 50/popolazione di microsfere, Timeout = 60 secondi, Gating = 7.500-15.000). 6. Test sierologico IgG e IgM a doppio reporter: formato semiautomatico a 384 pozzetti Eseguire il saggio a doppio reporter in formato piastra a 384 pozzetti utilizzando le fasi del saggio descritte nella sezione 5, ma processare i campioni utilizzando un robot di pipettaggio e una lavatrice magnetica automatica per piastre (Tabella dei materiali). Nel formato a 384 pozzetti, agitare le piastre durante le incubazioni e i lavaggi a 1450 giri/min e, prima di misurare la fluorescenza, agitare la piastra per 5 minuti a 21 °C e 1800 giri/min.

Representative Results

Panoramica sperimentaleGli schemi generali per i saggi Borrelia basati su microsfere a singolo e doppio reporter sono mostrati nella Figura 1. Per i singoli bersagli anticorpali (cioè IgG o IgM) generati contro un dato antigene Borrelia , entrambe le classi di anticorpi sono state valutate in modo indipendente in campioni di siero umano utilizzando un anticorpo anti-isotipo coniugato con PE per la segnalazione. Per il test a doppio reporter con analisi simultanea dell’immunoreattività sia IgG che IgM, la rilevazione delle IgG specifiche per l’antigene Borrelia ha utilizzato un sistema reporter anti-IgG umano biotinilato + BV421 marcato con streptavidina (fluorescenza blu), pur mantenendo il reporter coniugato con PE (fluorescenza arancione) per il rilevamento delle IgM. Il flusso di lavoro del test a doppio reporter è simile a quello del test a reporter singolo, ad eccezione di un’ulteriore incubazione del sistema di rilevamento di 30 minuti con il reagente di rilevamento della fluorescenza a secondo canale BV421-Streptavidina. Figura 1: Schema dei saggi Borrelia basati su microsfere a singolo e doppio reporter. (A) Lo strumento single-reporter è stato utilizzato per sviluppare e convalidare inizialmente il test basato su microsfere che caratterizzava singolarmente le IgG o le IgM anti-Borrelia , entrambi utilizzando un’etichetta reporter fluorescente di ficoeritritina (PE) che emette segnale negli spettri “arancioni”. Qualsiasi antigene di Borrelia desiderato può essere accoppiato alle microsfere e utilizzato per catturare e quantificare le IgG o le IgM presenti nei campioni di siero. Sono necessari due test immunologici separati per valutare la reattività delle IgG e delle IgM contro un determinato antigene. (B) Il sistema a doppio reporter ha permesso l’analisi simultanea di campioni di siero per gli anticorpi IgG e IgM contro ogni singolo antigene Borrelia nello stesso pozzetto. Questo approccio utilizza lo stesso anticorpo di rilevamento coniugato con PE per colpire le IgM anti-Borrelia , ma sostituisce il rilevamento delle IgG da un sistema basato su PE all’utilizzo di un anticorpo di rilevamento primario biotinilato e di streptavidina marcata con BV421 (un emettitore “blu”) che richiede un’ulteriore fase di incubazione del sistema di rilevamento di 30 minuti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Precisione intra-analisiL’analisi di correlazione di Spearman per tre antigeni rappresentativi di Borrelia (Figura 2) ha dimostrato una riproducibilità uniforme dei valori di MFI nel rilevamento di anticorpi anti-Borrelia presenti nei sieri umani. Figura 2: Precisione intra-saggio del saggio Borrelia a base di microsfere a doppio reporter. L’analisi di correlazione di Spearman ha mostrato un’elevata precisione intra-test del test a doppio reporter quando è stato utilizzato un sistema di rilevamento PE per rilevare gli anticorpi IgM specifici per Borrelia (A) e un sistema di rilevamento BV421 è stato utilizzato per rilevare gli anticorpi IgG specifici per Borrelia (B, C). Un totale di 21 campioni di siero sono stati analizzati in duplicati utilizzando una procedura semi-automatizzata. In ogni grafico, i segnali MFI sono stati tracciati l’uno contro l’altro e analizzati mediante regressione lineare. Una curva lineare (x=y) indicata come una linea tratteggiata rossa indica segnali MFI identici per i sistemi di rilevamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Precisione tra i saggiÈ stata osservata una buona riproducibilità da saggio a saggio con il saggio a doppio reporter. I diagrammi di Levey-Jennings (Figura 3) con i valori di MFI di un campione di controllo qualità misurato su sette cicli indipendenti hanno dimostrato l’elevata precisione tra i saggi per tutti gli antigeni rappresentativi. Il coefficiente di variazione percentuale medio (CV% = deviazione standard/media × 100) dei quattro antigeni rappresentativi di Borrelia è stato del 5,3%. Linearità di diluizionePoiché il test originale single-reporter e il nuovo test dual-reporter impiegano piattaforme citometriche a flusso diverse, abbiamo confrontato i risultati mediani di fluorescenza dello stesso test immunologico dell’antigene tra i due strumenti di citometria a flusso (Figura 4). Le serie di diluizione del campione hanno fornito curve di diluizione lineari per la valutazione sia delle IgM che delle IgG, con un buon parallelismo dose-risposta tra gli strumenti nell’intero intervallo di diluizione valutato (1:100-1:12.800). Figura 3: Precisione tra i saggi del saggio Borrelia basato su biglie a doppio reporter. Per la valutazione della precisione tra i test, la risposta anticorpale IgM (A) e IgG (B-D) Borrelia-specifica di un campione di controllo qualità è stata analizzata in sette cicli indipendenti, ogni volta in pozzetti duplicati. I saggi sono stati eseguiti manualmente. I valori MFI sono stati tracciati in un grafico di Levey-Jennings. Una linea verde indica la media di tutti i valori. Due linee tratteggiate rosse indicano l’intervallo di tolleranza della precisione tra i saggi. Questo è stato calcolato dal valore medio ± 2,5 volte la deviazione standard (2,5 S.D.). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Linearità di diluizione del saggio Borrelia basato su biglie a doppio reporter. A diluizioni del campione da 100 a 12.800 volte, le curve di diluizione sia per il rilevamento delle IgM (A) che per il rilevamento delle IgG (B) erano simili quando eseguite manualmente con lo strumento a reporter singolo e lo strumento a doppio reporter. A tutte le diluizioni testate, i valori di MFI sono risultati leggermente più alti utilizzando lo strumento a reporter singolo (simboli rossi) rispetto allo strumento a doppio reporter (simboli blu). Sono mostrate le curve di diluizione per 2 antigeni rappresentativi, con ogni punto di diluizione che rappresenta la misura media dei pozzetti triplicati con deviazione standard (SD*) indicata da barre di errore. Nota: le SD di piccole dimensioni non sono visibili su questa scala. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Materiali supplementari. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussion

Questo rapporto evidenzia lo sviluppo di un test immunologico della Borrelia basato su due reporter che determina in modo riproducibile e sensibile l’immunoreattività anti-Borrelia nei campioni di siero12. Le varie specie patogene di Borrelia che causano la borreliosi di Lyme possono essere differenziate in base all’eterogeneità dell’antigene variante-specifica 6,7,8,9. Il test multiplexato valuta contemporaneamente l’immunoreattività anti-Borrelia mediata da IgG e IgM all’interno dello stesso pozzetto di reazione, conservando così i reagenti, la manodopera e il materiale del campione altrimenti necessario per eseguire separatamente due saggi singleplex. Il confronto delle risposte IgM e IgG nel tempo può consentire un migliore monitoraggio della progressione della malattia, poiché la sieroconversione da IgM a IgG avviene dopo l’infezione6.

Il sistema a doppio reporter utilizza due diversi sistemi di anticorpi di rilevamento13,15. Esperimenti correlati non hanno dimostrato alcuna significativa cross-reattività rilevabile tra i sistemi di rilevamento anti-IgM e anti-IgG di Borrelia quando entrambe le classi di anticorpi sono state analizzate insieme nello stesso pozzettodi reazione 12. Considerando la minore affinità di legame degli anticorpi IgM rispetto agli anticorpi IgG 16,17, abbiamo scelto un anticorpo di rilevamento coniugato con PE per il rilevamento di IgM (il primo canale reporter dello strumento a doppio reporter) perché il PE è uno dei fluorofori a emissione più forte utilizzati di routine nei saggi immunologici18. Per la valutazione delle IgG, abbiamo utilizzato un anticorpo di rilevamento biotinilato che è stato successivamente illuminato con streptavidina coniugata con BV421 (il secondo canale reporter dello strumento)19. Nonostante la fase di incubazione aggiuntiva di 30 minuti rispetto al sistema a reporter singolo, il sistema a doppio reporter produce il doppio delle informazioni per reazione. Nel complesso, il test multiplexato a doppio reporter richiede meno tempo cumulativo e input di materiale rispetto all’esecuzione di due saggi a reporter singolo.

Le elevate prestazioni e la stabilità del test della Borrelia multiplexato sono state esemplificate dall’elevata riproducibilità negli studi di precisione intra e inter-saggio e dalla dimostrazione della linearità della diluizione e del parallelismo della diluizione su un’ampia gamma di concentrazioni di campioni per la valutazione sia delle IgG che delle IgM. Abbiamo osservato livelli di emissione di fluorescenza assoluta più elevati per gli stessi fluorofori utilizzando lo strumento a canale singolo rispetto al sistema a doppio canale (≈1,7× in più con PE), attribuibili a differenze nelle impostazioni ottiche e di calibrazione tra i due strumenti (Figura 4). Ciononostante, le curve di emissione della fluorescenza con entrambi i fluorofori sono rimaste all’interno dell’intervallo lineare di entrambi gli strumenti agli estremi di diluizione del campione alto e basso, e qualsiasi discrepanza nella fluorescenza assoluta misurata non ha influenzato la classificazione dello stato di esposizione alla Borrelia . 12

Uno dei principali vantaggi di questo test Borrelia multiplex a base di microsfere è la facilità con cui il test può essere modificato o ampliato per valutare analiti diversi o aggiuntivi, ad esempio per rilevare anticorpi contro antigeni di altre specie di Borrelia . I set di microsfere magnetiche xMAP contengono diverse combinazioni di coloranti che possono essere distinte nel canale di classificazione dello strumento e possono teoricamente essere implementate in saggi multiplex in grado di valutare contemporaneamente fino a 500 analiti unici all’interno dello stesso campione. Mentre l’attuale studio evidenzia quattro antigeni rappresentativi di Borrelia per dimostrare la funzionalità e la stabilità del test e per confrontare il sistema a singolo e doppio reporter, il test finale interroga otto antigeni che insieme possono identificare tutti e cinque i patogeni di Borrelia clinicamente rilevanti che circolano in Europa e Nord America12.

Le prestazioni ad alta produttività sono possibili utilizzando piastre per microtitolazione standard a 384 pozzetti in un formato di saggio semiautomatico. La compatibilità del saggio e dello strumento con piastre a 96 e 384 pozzetti consente di utilizzare il test multiplex Borrelia come strumento di screening efficiente per analizzare rapidamente grandi set di campioni, come gli studi nazionali20. L’esecuzione manuale del test rimane possibile per set di campioni più piccoli che utilizzano piastre più piccole a 96 pozzetti.

I limiti dello studio includono la valutazione comparativa di pochi bersagli di immunoreattività di Borrelia in un piccolo numero di campioni di siero umano. Tuttavia, lo studio originale ha confermato che le prestazioni del test sia per le IgG che per le IgM sono state mantenute durante l’analisi di otto antigeni di tutte e cinque le specie di Borrelia conosciute all’interno di un set di campionipiù ampio 12. Inoltre, lo strumento a doppio reporter può valutare solo due isotipi di anticorpi contemporaneamente all’interno di ciascuna reazione, quindi la profilazione completa degli isotipi richiederebbe l’esecuzione di ulteriori reazioni di analisi13.

In conclusione, questo rapporto descrive in dettaglio il successo della fusione e della conversione di saggi immunologici a singolo reporter basati su microsfere in saggi a doppio reporter in grado di valutare simultaneamente gli anticorpi IgG e IgM patogeni specifici per Borrelia in campioni di siero umano. Questo approccio combinato consente di risparmiare tempo totale, materiale e manodopera per generare lo stesso volume di dati di due saggi indipendenti a singolo reporter. Il test multiplex può essere scalato dal formato della piastra per microtitolazione a 96 pozzetti a quello a 384 pozzetti e può essere semi-automatizzato mediante l’uso di piastre robotizzate e strumentazione per la manipolazione dei liquidi, il che lo rende adatto per applicazioni ad alto rendimento come le indagini su grandi popolazioni. I sistemi di analisi a doppio reporter basati su microsfere hanno precedentemente dimostrato utilità nella valutazione, ad esempio, delle risposte immunitarie ad altri patogeni virali e batterici13,21, nella valutazione delle risposte anticorpali allogeniche contro gli epitopi HLA nei trapianti di organi22 e nell’esplorazione dei meccanismi delle malattie autoimmuni23. L’attuale rapporto descrive in dettaglio l’uso della tecnologia multiplex per identificare l’esposizione ai patogeni Borrelia che causano la malattia di Lyme, come esempio di come i laboratori possono adattare questo approccio per esplorare meccanismi immunitari complessi in diverse patologie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo rapporto è stato finanziato da Luminex (Austin, TX). Gli autori ringraziano Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) per l’assistenza analitica e scientifica nell’editing. Gli autori ringraziano anche Harald Klein e Christoph von Eichel-Streiber di tgcBIOMICS GmbH (Bingen, Germania) per aver fornito gli antigeni Borrelia utilizzati nello studio. I campioni di siero umano per la validazione tecnica dei test e il controllo di qualità sono stati ottenuti da: 1) lo studio di prevalenza multilocale e seriale sugli anticorpi contro SARS-CoV-2 in Germania tramite il Dipartimento di epidemiologia, Centro Helmholtz per la ricerca sulle infezioni, Braunschweig, Germania; e 2)il Dipartimento di Neurologia, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, Germania). L’approvazione per l’uso di campioni umani è stata concessa dal Comitato Etico della Hannover Medical School, Germania (9086_BO_S_2020).

Materials

Antibodies and Detection Reagents Source Catalog Number
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Jackson ImmunoResearch (Dianova) 109-066-098 
Brilliant Violet 421-Streptavidin BD Biosciences 563259
Donkey Anti-Human IgM  Jackson ImmunoResearch (Dianova) 709-116-073
Borrelia Antigens tgcBIOMICS (Bingen, Germany)
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific Pierce 77149 ProteoChem (100 mg)
10x PBS Fisher Scientific BP399-4
BSA Carl Roth T844.3
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer) Carl Roth 4256.2
Na2HPO4 Carl Roth 4984.1
ProClin300 Sigma 48914-U
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Scientific Pierce 24510 (500 mg)
Triton X-100 Thermo Scientific 85111
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies Source
384-well plate Corning, Cat# 3570
96-well deep-well plates ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450
96-well half-area plates  Corning, Cat# 3690
BioTek 405 TS Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
BioTek MultiFlo FX Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes) ThermoFisher, Cat# 12320D
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates)  ThermoFisher, Cat# A31508
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) Luminex Corp., Austin, TX
SmartBlock Plates Eppendorf, Cat# 5363000039
ThermoMixer C Eppendorf, Cat# 5382000015
ThermoTop Eppendorf, Cat# 5308000003
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX
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References

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Häring, J., Michel, T., Becker, M., Junker, D., Tchitchagua, T., Leschnik, O., Lange, B., Castell, S., Krause, G., Strengert, M., Dulovic, A., Schneiderhan-Marra, N. Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. J. Vis. Exp. (197), e65323, doi:10.3791/65323 (2023).
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