JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Gelijktijdige detectie van verschillende antilichaamklassen in een gemultiplexte serologische test

Published: July 14, 2023
doi:
10.3791/65323
, , , , , , , , , , ,
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the University of Tübingen, 2Department of Neurology,Sächsisches Krankenhaus Rodewisch, 3Department of Epidemiology,Helmholtz Centre for Infection Research, 4German Centre for Infection Research (DZIF)

Summary

Een driekanaals dual-reporter fluorescentiestroomanalysesysteem werd gebruikt om een op kralen gebaseerde multiplex-immunoassay te ontwikkelen die tegelijkertijd serummonsters evalueert voor IgG en IgM die worden opgewekt tegen meerdere antigenen van verschillende Borrelia-soorten die Lyme-borreliose veroorzaken in Europa en Noord-Amerika.

Abstract

Om de progressie van infectieziekten te volgen, is het nuttig om de immunoreactiviteit tegen verschillende antigene determinanten te beoordelen en verschillende antilichaamisotypen te meten, omdat ze in verschillende stadia van de immuunrespons van de gastheer verschijnen. Bij Lyme-borreliose kan de ziekteverwekker een van de vele leden van de Borrelia-soort zijn. Daarom vereist een correcte monsterclassificatie het evalueren van de immunoreactiviteit tegen verschillende antigenen van verschillende Borrelia-soorten . Bovendien kunnen antipathogene IgG- en IgM-responsen verschillende elicitatietijdverloopen hebben tijdens ziekteprogressie. Hier demonstreren we de ontwikkeling van een multiplex-immunoassay met twee reporters die nuttig is bij het identificeren van Borrelia-specifieke immuunrespons in menselijke serummonsters door tegelijkertijd zowel IgG- als IgM-immunoreactiviteit tegen verschillende bacteriële antigenen in dezelfde reactieput te evalueren. Deze dual-reporter-benadering behoudt de analytische prestaties van single-reporter-methoden, terwijl tijd en middelen worden bespaard en de vereisten voor steekproefomvang worden verminderd. Met deze test kan in wezen het dubbele van de serologische informatie worden gegenereerd uit een bloedmonster in de helft van de tijd.

Introduction

Lyme-borreliose is de meest voorkomende door teken overgedragen infectieziekte in gematigde klimaten van het noordelijk halfrond. Het wordt veroorzaakt door spirocheetbacteriën van het geslacht Borrelia, met vijf bekende menselijke pathogenen die variëren in geografische verspreiding2. De belangrijkste pathogene Borrelia-soorten in Europa zijn B. afzelii en B. garinii, waarbij B. burgdorferi s.s., B. spielmanii en B. bavariensis minder vaak betrokken zijn. In Noord-Amerika is B. burgdorferi s.s. de enige veroorzaker van Lyme-borreliose 2,3. Borrelia-pathogenen worden overgedragen door leden van het tekengeslacht Ixodes, waarbij overdracht binnen 24 uur na tekenbeet kan plaatsvinden4.

De diagnose van Lyme-borreliose wordt meestal gesteld aan de hand van klinische symptomen en vervolgens bevestigd door serologie. In zowel Europa als Noord-Amerika bevelen diagnostische richtlijnen een testreeks in twee stappen aan, bestaande uit een enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) met een refleximmunoblot om de antilichaamrespons tegen Borrelia-specifieke antigenen te evalueren 1,5,6,7,8,9 . Deze benadering is echter niet gevoelig en suboptimaal, vooral in de vroege fase van infectie wanneer de seroconversie onvolledig kan zijn en de anti-Borrelia IgG- en IgM-titers te laag zijn6.

Multiplex-immunoassays verbeteren traditionele immunoassays die slechts één doelwit tegelijk meten, en kunnen tegelijkertijd meerdere antilichaamisotyperesponsen evalueren tegen een of meer antigenen 10,11,12. Assays zoals ELISA’s zijn beperkt tot het identificeren en kwantificeren van een enkele analyt per reactie, in het huidige geval circulerend IgG of IgM geïnduceerd tegen een enkel bacterieel antigeen na infectie met Borrelia. Dit rapport illustreert het gebruik van op kralen gebaseerde analytprofileringstechnologie voor de ontwikkeling van een multiplex immunoassay die tegelijkertijd zowel IgG- als IgM-antilichamen detecteert tegen een van de hierin gekozen Borrelia-antigenen in menselijke serummonsters. We selecteerden vier antigenen die samen de meest voorkomende pathogene Borrelia-soorten bestrijken die inheems zijn in Europa (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) en Noord-Amerika (B. burgdorferi s.s.) (Tabel 1) 2,3. Dit maakt een beslissende identificatie van pathogenen mogelijk en de mogelijkheid om vroege IgM en latere, duurzamere, IgG-immunoreactiviteit in patiëntenmonsters te onderscheiden.

Doel-isotype Reporter Kanaal Antigeen Borrelia Soorten Zeven Antigeenkoppeling Concentratie
Igm PE OspC B. garinii 20047 5,0 μg/106 kralen
IgG BV421 VlsE B. burgdorferi s.s B31 1,25 μg/106 kralen
IgG BV421 DbpA B. burgdorferi s.s. ZS7 10,0 μg/106 kralen
IgG BV421 DbpA B. afzelii PKo 5,0 μg/106 kralen

Tabel 1: Representatieve Borrelia-antigenen die worden gebruikt voor de ontwikkeling van multiplextests.

We ontwikkelden in eerste instantie een single-reporter immunoassay die ofwel anti-Borrelia-antigeen IgG- of IgM-antilichamen detecteerde in twee afzonderlijke reacties en deze assays vervolgens samenvoegden tot een dual-reporter multiplex-assay die beide antilichaamisotypes in hetzelfde reactiemengsel meet. Magnetische kralen worden gekoppeld aan een pathogeen van belang en vervolgens geïncubeerd met serummonsters van patiënten. Het parelgekoppelde antigeen wordt herkend door en vangt zowel circulerend IgG als IgM op in serum dat wordt gegenereerd in een immuunrespons tegen dat pathogene antigeen. Bepaling IgG versus IgM-specificiteit wordt bepaald door de selectie van een secundair antilichaam dat bindt aan IgG of IgM, elk met een duidelijk fluorofoorsignaal geassocieerd met de twee secundaire antilichamen. Elk fluorescerend signaal wordt gedetecteerd in een van de twee Reporter-kanalen van het instrument (d.w.z. dual-reporter) met een andere excitatielaser en emissie-opname die specifiek zijn voor de enkele fluorofoor die wordt gebruikt om IgG of IgM te detecteren (hier respectievelijk Brilliant Violet 421 of phycoerythrin). Het instrument Classification Channel identificeert de kleurgecodeerde kleurstof die inherent is aan verschillende kralensets. Zo kunnen meerdere doelantigenen worden gekoppeld aan verschillend geverfde kralen, en de kralensets kunnen met elkaar worden gemengd en gebruikt om de diverse immunoreactiviteit van antipathogenen in serummonsters uitgebreid te beoordelen. Het classificatiekanaal identificeert elke individuele kralenset (d.w.z. specifiek antigeen) en meet de fluorescentie geassocieerd met IgG of IgM tegen dat antigeen. De resulterende multiplex-test bespaart tijd en middelen in vergelijking met minder uitgebreide klassieke tests en catalogiseert nauwkeurig de immunoreactiviteit van Lyme in beperkte monstervolumes. Terwijl een vergelijkbare dual-reporter-benadering eerder is gebruikt om immuunresponsen in andere pathologieën zoals SARS-CoV-2-infectie te categoriseren13, beschrijft dit rapport de toepassing van multiplex fluorescerende testtechnologie voor het karakteriseren van immunoreactiviteit bij Lyme-borreliose.

Protocol

De juiste goedkeuring van de Institutional Review Board/Ethics Committee werd ontvangen voor het gebruik van menselijke serummonsters in deze experimentele serie. De monsters waren geanonimiseerde restmaterialen van een Duits nationaal onderzoek naar SARS-CoV-2-seroprevalentie14. Goedkeuring voor het gebruik van menselijke monsters werd verleend door de ethische commissie van de Hannover Medical School, Duitsland (9086_BO_S_2020). In de huidige studie werden in totaal 21 menselijke serummonsters gebruikt. 1. Ethische goedkeuring voor het gebruik van menselijke monsters Verkrijg passende ethische goedkeuringen voor het gebruik van menselijke monsters. 2. Reagentia en apparatuur Menselijke serummonsters: Voer technische testvalidatie en kwaliteitscontrole uit met behulp van serummonsters van personen die eerder zijn gediagnosticeerd met Lyme-borreliose of van aangetoonde Borrelia-negatieve immuunstatus12,14. Instrumentatie met één verslaggever. Gebruik een tweekanaals enkelvoudig rapportage-instrument (materiaaltabel) voor de initiële testontwikkeling en technische validatie.OPMERKING: Het single-reporter-systeem heeft twee lasers: 1) identificeert en kwantificeert parelset-specifieke fluorescentie om verschillende kralensets te onderscheiden, indien gebruikt (Classification Channel), en 2) detecteert en kwantificeert kraalgebonden doelspecifieke phycoerythrine (PE) fluorescentie (Reporter Channel; 532 nm excitatie, “oranje” 565-585 nm emissie). Er kan dus slechts één isotypeklasse van antilichamen (bijv. IgG of IgM) tegelijk worden geanalyseerd met behulp van het enkele Reporter-kanaal.Voer initiële validatiestudies uit om anti-Borrelia IgG en IgM afzonderlijk te beoordelen, in een single-reporter 96-wells formaat dat PE-gelabelde detectiereagentia gebruikt voor beide antilichaamklassen.OPMERKING: De huidige test evalueert circulerende IgG’s die specifiek zijn voor Borrelia-antigeen VlsE en twee varianten van DbpA, en circulerend IgM specifiek voor antigeen OspC, als representatieve voorbeelden. De test kannaar wens worden uitgebreid om de serumimmunoreactiviteit tegen andere anti-Borrelia-antigenen te evalueren. Dual-Reporter Instrumentatie. Gebruik een driekanaals dual-reporter-instrument (Table of Materials) dat gelijktijdige IgG/IgM-analyse in dezelfde reactie mogelijk maakt, voor de ontwikkeling en technische validatie van de dubbele IgM/IgG-assay (hieronder beschreven). Dit instrument heeft in totaal 3 fluorescentie-detecterende kanalen, waarvan 2 Reporter-kanalen die gerichte Ig-geassocieerde signalen evalueren.OPMERKING: Het dual-reporter-systeem heeft drie lasers: 1) identificeert en kwantificeert parelset-specifieke fluorescentie (classificatiekanaal); 2) detecteert en kwantificeert doelspecifieke fycoerythrine (PE) fluorescentie (Reporter Channel 1; 532 nm excitatie, “oranje” 565-585 nm emissie), en 3) evalueert doelspecifieke Brilliant Violet 421 (BV421) fluorescentie van een tweede doelanalyt (Reporter Channel 2; 405 nm excitatie, “blauwe” 421-441 nm emissie). Het dual-reporter-systeem is compatibel met zowel 96-wells als 384-well microtiterplaat (semi-geautomatiseerde handling) testformaten. Het algemene analyseschema is weergegeven in figuur 1. De stappen van het protocol worden hieronder beschreven. 3. Antigeenkoppeling Koppel de Borrelia-antigenen aan magnetische, gecarboxyleerde en fluorescerende kleurgecodeerde microsferen van 6,5 μm (kralen; Tabel met materialen) met behulp van 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)/sulfo-N-hydroxysuccinimide (sNHS)-chemie.OPMERKING: Een gedetailleerde beschrijving is te vinden in referentie11en referentie12. Zoek de koppelingsconcentratie van elk antigeen in tabel 1. Gekoppelde kralen moeten tot gebruik in het donker bij 4 °C worden bewaard. Alle buffers die worden gebruikt bij koppelings- en detectiereacties worden gedetailleerd beschreven in de aanvullende materialen. 4. Analyseprocedure: serologische test met IgG of IgM met één rapport: 96-wells formaat Verdun het monster in 2 stappen (2 stappen, beide in platen met 96 putjes; 200-voudige verdunning van het serummonster in de analysebuffer).OPMERKING: De samenstelling van de testbuffer is een 1:4 mengsel van Low Cross Buffer: PBS met 1% (w/v) runderserumalbumine. Tween-20 wordt aan het mengsel toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,05 % (v/v).Monsterverdunning stap 1: Meng 5 μl van het serummonster met 120 μl van de analysebuffer (25-voudige verdunning). Monsterverdunning stap 2: Verdun de 25-voudige monsterverdunning nog eens 8-voudig door 10 μL van de verdunning te mengen met 70 μL van de analysebuffer om de uiteindelijke monsterverdunning 200-voudig te maken. Verdunning van magnetische kralenmixMaak een kralenmix met 1,0 × 106 korrels/ml per kralenpopulatie (d.w.z. per uniek doelantigeen). Verdun het bereide parelmengsel 25-voudig in de analysebuffer om de uiteindelijke korrelconcentratie in deze verdunde suspensie nu 4 × 104 korrels/ml per korrelpopulatie te maken (d.w.z. per uniek doelantigeen). Incubatie van serummonsters met kralenPipetteer 25 μl verdunde gekoppelde multiplexkorrelsuspensie (met 4,0 × 104 korrels/set/ml) in toegewezen putjes van een microtiterplaat met 96 putjes (materiaaltabel). Voeg 25 μl 200-voudig verdund serummonster (uit stap 4.1 hierboven) toe aan geschikte putjes met 25 μl gekoppelde parelsuspensie.OPMERKING: Dit produceert een extra 2-voudige verdunning, dus de uiteindelijke verdunning van het serummonster in het putje is 400-voudig en het uiteindelijke aantal kralen is 1000 kralen/kralenset/50-μL-reactie. Bedek de reactieplaat met 96 putjes met een microplaatafdichting (zelfklevende folie of plastic plaatafdekkingen). Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 20 °C, bij 750 tpm op een platenschudder. Kralen wassenVerwijder de reactieplaat met 96 putjes van de platenschudder en verwijder voorzichtig de zelfklevende plaatafdichting. Plaats de reactieplaat met 96 putjes in een platenring. Was de parels drie keer met 100 μL wasbuffer (1× PBS + 0,05% v/v Tween 20) met behulp van de geautomatiseerde magnetische platenwasser. Resuspendeer gewassen kralen in 100 μL wasbuffer, dek de plaat af met zelfklevende folie of plastic plaatafdekking en schud de plaat gedurende 1 minuut op een bordenschudder bij 20 °C bij 1000 tpm. Splits de gewassen kralenVerwijder de reactieplaat met 96 putjes van de platenschudder en verwijder voorzichtig de zelfklevende plaatafdichting. Meng reacties door vijf keer op en neer te pipetteren en breng 50 μL van elk reactievolume van 100 μL over naar elk van de twee nieuwe reactieplaten met 96 putjes, één plaat voor IgG-detectie en één voor IgM-detectie. Incubatie van antilichamen/reagens, detectieOPMERKING: Op dit punt zijn doelantigeengekoppelde kralen geïncubeerd met serummonsters om circulerende antilichamen in serum (indien aanwezig) te extraheren die reageren met het antigeen(en). Gereageerde kralen met gebonden immunoglobuline zijn verdeeld in twee platen, en IgG en IgM worden nu gedetecteerd en gekwantificeerd in hun afzonderlijke platen met behulp van isotype-specifieke secundaire antilichamen met een PE-label. Spreiding van de plaatbehandeling met 20 min.Zuig het supernatans op uit de putjes met magneetparels met behulp van de magnetische platenring. Maak voor elke plaat de juiste Ig-detectiereagensmix (anti-IgG of anti-IgM), met PE-geconjugeerd geiten-anti-humaan IgG (3 μg/ml) of PE-geconjugeerd ezel-anti-humaan IgM (5 μg/ml) in de analysebuffer. Voor elk kraalhoudend putje wordt 30 μL detectiereagens gebruikt. Bereid voldoende IgG- en IgM-detectiereagensvolumes voor op reactieputjes, met voldoende extra om pipetteerverliezen op te vangen. Pipetteer 30 μL IgG-detectiereagens in elk putje met gereageerde parels op de IgG-plaat en bedek de reactieplaat met 96 putjes met een microplaatafdichting. Pipetteer 30 μL IgM-detectiereagens in elk putje met gereageerde parels op de IgM-plaat en bedek de reactieplaat met 96 putjes met een microplaatafdichting. Incubeer gedurende 45 minuten bij 20 °C terwijl u schudt bij 750 tpm op een platenschudder. Kralen wassenVerwijder de reactieplaat met 96 putjes van de platenschudder en verwijder voorzichtig de zelfklevende plaatafdichting. Plaats de reactieplaat met 96 putjes in een magnetische platenring. Was de kralen drie keer met 100 μL wasbuffer met behulp van de magnetische platenwasser. Resuspendeer de korrels in 100 μL wasbuffer. Analyseer de resultaten op het single reporter-instrument.Bedek de reactieplaat met 96 putjes met een microplaatafdichting. Schud de reactieplaat met 96 putjes gedurende 3 minuten bij 20 °C, bij 1000 tpm op een platenschudder. Breng de reactieplaat met 96 putjes over van de platenschudder en plaats deze in een flowanalysatorinstrument met één verslaggever (Materiaaltabel). Analyseer voor elk monster de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) met behulp van de volgende instrumentinstellingen: opnamevolume = 80 μL, Aantal = 50/kraalpopulatie, Time-out = 60s, Gating = 7.500-15.000)12,13. 5. Analyseprocedure: serologische test met dubbele verslaggever IgG en IgM: 96-wells formaat Monsterverdunning (2 stappen, beide in platen met 96 putjes; 200-voudige serummonsterverdunning in testbuffer)Monsterverdunning stap 1: Meng een serummonster van 5 μl met een testbuffer van 120 μl (25-voudige verdunning). Monsterverdunning stap 2: Verdun de 25-voudige monsterverdunningen nog eens 8-voudig door 10 μl van de eerste verdunning (25-voudig verdund monster uit punt 5.1.1) te mengen met 70 μl-analysebuffer (8-voudige verdunning), om de uiteindelijke monsterverdunning tot 200-voudig te verkrijgen. Verdunning van magnetische kralenmixBereid een korrelmix met 1,0 × 106 doelantigeengekoppelde kralen/ml per parelpopulatie (d.w.z. per uniek doelantigeen).OPMERKING: In deze experimentele reeks evalueerden we zowel IgG- als IgM-immunoreactiviteit tegen vier unieke Borrelia-antigenen in elke reactie. Verdun het bereide parelmengsel 50-voudig in de analysebuffer. De parelconcentratie in deze verdunde suspensie is nu 2,0 × 104 korrels/ml per parelpopulatie.OPMERKING: Het aantal korrels in de duplex-analysereactie is gehalveerd ten opzichte van het aantal dat wordt gebruikt in de reactie met één verslaggever om directe vergelijkbaarheid tussen de twee analyses mogelijk te maken en hulpbronnen te besparen, nadat voorlopige studies hadden bevestigd dat het fluorescentiesignaal binnen het lineaire kwantificeringsbereik werd gehouden bij gebruik van de helft van het aantal korrels. Incubatie van serummonsters met kralenPipetteer 25 μL verdunde doelantigeengekoppelde parelsuspensie (met 2,0 × 104 korrels/set/ml) in vooraf toegewezen putjes van een microtiterplaat met 96 putjes met een half oppervlak. Het exacte aantal reactieputjes en hun plaatsing op de plaat zijn afhankelijk van het door de operator bepaalde totale aantal geteste monsters en of er per monster enkele of replicaatputjes zullen worden uitgevoerd.OPMERKING: De antigeengekoppelde magnetische kralen zullen worden gereageerd met menselijke serummonsters. Zowel anti-Borrelia-antigeen immunoreactief IgG als IgM, indien aanwezig in monsters, zullen binden aan en geïmmobiliseerd worden op dezelfde antigeengekoppelde kralen. Secundaire antilichaamkwantificering van gebonden IgG en IgM zal vervolgens worden uitgevoerd op dezelfde kralen in dezelfde reacties, met behulp van verschillende fluoroforen voor IgG- en IgM-identificatie die hun differentiatie mogelijk maakt. Voeg 25 μl 200-voudig verdund serum (uit stap 5.1 hierboven) toe aan elk putje met 25 μl gemengde antigeengekoppelde parelsuspensie (stap 5.2).OPMERKING: Dit produceert een extra 2-voudige verdunning, dus de uiteindelijke verdunning van het serummonster in het putje is 400-voudig en het uiteindelijke aantal parels is 500 kralen/kralenset/50-μL-reactie. Bedek de reactieplaat met 96 putjes met een microplaatafdichting (zelfklevende folie of plastic plaatafdekking). Incubeer de plaat met kralen gedurende 2 uur bij 20 °C, bij 750 tpm op een platenschudder. Parel wassen (om overtollig serummonster te verwijderen)Verwijder de reactieplaat met 96 putjes van de platenschudder en verwijder de zelfklevende plaatafdichting. Plaats de reactieplaat met 96 putjes in een magnetische platenring. Was de kralen drie keer met 100 μL wasbuffer met behulp van de magnetische platenwasser. Zuig het uiteindelijke wasvolume op uit de korrels na de laatste wasstap. Detectie antilichaam (Incubatie – Deel I)Maak vers IgG- en IgM-reagens met dubbele detectie dat gebiotinyleerd anti-humaan IgG van geiten (1 μg/ml) bevat, samen met PE-geconjugeerd anti-humaan IgM van ezels (5 μg/ml) in de analysebuffer. Voor elk kraalhoudend putje wordt 30 μL Dual Detection Reagens gebruikt. Bereid voldoende IgG- en IgM-reagensvolumes voor met dubbele detectie voor reactieputjes, met voldoende extra om pipetteerverliezen op te vangen. Pipetteer 30 μL IgG- en IgM-reagens met dubbele detectie in elk toegewezen putje en bedek de reactieplaat met 96 putjes met een microplaatafdichting. Incubeer de plaat gedurende 45 minuten bij 20 °C terwijl u schudt bij 750 tpm op een platenschudder. Parel wassen (om overtollige detectie-antilichamen te verwijderen)Verwijder de reactieplaat met 96 putjes van de platenschudder en verwijder voorzichtig de zelfklevende plaatafdichting. Plaats de reactieplaat met 96 putjes in een geautomatiseerde magnetische platenring. Was de parels drie keer met een wasbuffer van 100 μL met behulp van de geautomatiseerde magnetische platenwasser. Zuig het uiteindelijke wasvolume op uit de korrels na de laatste wasstap. Streptavidin-geconjugeerde verslaggever (Incubatie – Deel II)Verdun vers BV421-gelabeld streptavidine in de analysebuffer tot een concentratie van 0,2 μg/ml. Voor elk kraalbevattend putje wordt 30 μL BV421-gelabeld Streptavidin gebruikt. Bereid voldoende BV421-gelabeld Streptavidine-volume voor op reactieputjes, met voldoende extra om pipetteerverliezen op te vangen. Pipetteer 30 μL verdund BV421-streptavidine in elk reactieputje en bedek de 96wells reactieplaat met de microplaatafdichting. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 20 °C terwijl u schudt met 750 tpm op een bordenschudder. Wasparels (om overtollig BV421-Streptavidine te verwijderen)Verwijder de reactieplaat met 96 putjes van de platenschudder en verwijder voorzichtig de zelfklevende plaatafdichting. Plaats de reactieplaat met 96 putjes in de magnetische plaatring. Was de parels drie keer met een wasbuffer van 100 μL met behulp van de geautomatiseerde magnetische platenwasser. Resuspendeer de parels in de putjes tot een eindvolume van 100 μL in wasbuffer. Analyseer resultaten op het dual-reporter-instrumentBedek de reactieplaat met 96 putjes met een microplaatafdichting. Incubeer de reactieplaat met 96 putjes gedurende 3 minuten bij 20 °C, bij 1000 tpm op een platenschudder. Breng de reactieplaat met 96 putjes over van de platenschudder naar het flowanalysatorinstrument met dubbele verslaggever (Materiaaltabel). Evalueer de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) van het monster volgens de instructies van de fabrikant (instrumentinstellingen: Dual-Reporter-modus, opnamevolume = 80 μL, aantal = 50/kraalpopulatie, time-out = 60s, gating = 7.500-15.000). 6. Dubbele reporter IgG en IgM serologische test: 384-well semi-geautomatiseerd formaat Voer de dual-reporter-assay uit in plaatformaat met 384 putjes met behulp van de analysestappen die worden beschreven in sectie 5, maar verwerk monsters met behulp van een pipetteerrobot en een geautomatiseerde magnetische platenwasser (materiaaltabel). Schud de plaat in het formaat met 384 putjes tijdens incubaties en wasbeurten op 1450 tpm, en schud de plaat 5 minuten bij 21 °C en 1800 tpm voordat u de fluorescentie meet.

Representative Results

Experimenteel overzichtDe algemene schema’s voor de Borrelia-assays op basis van één reporter en twee reporters op basis van kralen zijn weergegeven in figuur 1. Voor enkelvoudige antilichaamdoelen (d.w.z. IgG of IgM) gegenereerd tegen een bepaald Borrelia-antigeen, werden beide antilichaamklassen onafhankelijk geëvalueerd in menselijke serummonsters met behulp van een PE-geconjugeerd anti-isotype-antilichaam voor rapportage. Voor de dual-reporter-assay met gelijktijdige analyse van zowel IgG- als IgM-immunoreactiviteit, maakte Borrelia-antigeenspecifieke IgG-detectie gebruik van een gebiotinyleerd anti-humaan IgG + BV421-gelabeld Streptavidin (blauwe fluorescentie) reportersysteem, met behoud van de PE-geconjugeerde reporter (oranje fluorescentie) voor IgM-detectie. De workflow van de dual-reporter-assay is vergelijkbaar met de single-reporter-assay, met uitzondering van een extra incubatie van het detectiesysteem van 30 minuten met het tweedekanaals fluorescentiedetectiereagens BV421-Streptavidin. Figuur 1: Schema van de Borrelia-assays op basis van single-reporter en dual-reporter bead. (A) Het single-reporter-instrument werd gebruikt om de op kralen gebaseerde test te ontwikkelen en in eerste instantie te valideren die anti-Borrelia IgG of IgM afzonderlijk karakteriseerde, beide met behulp van een fycoerythritine (PE) fluorescerend reporterlabel dat signaal uitzendt in de “oranje” spectra. Elk gewenst Borrelia-antigeen kan aan de korrels worden gekoppeld en worden gebruikt om IgG of IgM in serummonsters op te vangen en te kwantificeren. Er zijn twee afzonderlijke immunoassays nodig om zowel de IgG- als de IgM-reactiviteit tegen een bepaald antigeen te evalueren. (B) Het dual-reporter-systeem maakte gelijktijdige analyse van serummonsters op zowel IgG- als IgM-antilichamen tegen elk afzonderlijk Borrelia-antigeen in hetzelfde putje mogelijk. Deze aanpak maakt gebruik van hetzelfde PE-geconjugeerde detectie-antilichaam om zich te richten op anti-Borrelia IgM, maar vervangt de IgG-detectie van een op PE gebaseerd systeem door het gebruik van een gebiotinyleerd primair detectie-antilichaam en BV421-gelabeld streptavidine (een “blauwe” zender) die een extra incubatiestap van het detectiesysteem van 30 minuten nodig heeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Precisie van de intra-assaySpearman-correlatieanalyse voor drie representatieve Borrelia-antigenen (Figuur 2) toonde uniforme reproduceerbaarheid van MFI-waarden aan bij het detecteren van anti-Borrelia-antilichamen die aanwezig zijn in menselijke sera. Figuur 2: Intra-assay Precisie van de dual-reporter bead-based Borrelia assay. De correlatieanalyse van Spearman toonde een hoge intra-assay-precisie van de dual-reporter-assay wanneer een PE-detectiesysteem werd gebruikt om Borrelia-specifieke IgM-antilichamen (A) te detecteren en een BV421-detectiesysteem werd gebruikt om Borrelia-specifieke IgG-antilichamen (B, C) te detecteren. In totaal werden 21 serummonsters in duplicaten geanalyseerd met behulp van een semi-geautomatiseerde procedure. In elke grafiek werden MFI-signalen tegen elkaar uitgezet en geanalyseerd door middel van lineaire regressie. Een lineaire curve (x=y) weergegeven als een rode stippellijn geeft identieke MFI-signalen voor detectiesystemen aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Precisie tussen de testsEr werd een goede reproduceerbaarheid van test tot test waargenomen met de test met twee rapporten. Levey-Jennings-grafieken (figuur 3) met MFI-waarden van een kwaliteitscontrolemonster gemeten over zeven onafhankelijke runs toonden de hoge inter-assay-precisie voor alle representatieve antigenen. De gemiddelde variatiecoëfficiënt (CV% = standaarddeviatie/gemiddelde × 100) van de vier representatieve Borrelia-antigenen was 5,3%. Lineariteit van de verdunningOmdat de oorspronkelijke single-reporter-assay en de nieuwe dual-reporter-assay verschillende flowcytometrische platforms gebruiken, vergeleken we de mediane fluorescentie-output van dezelfde antigeenimmunoassay tussen de twee flowcytometrie-instrumenten (Figuur 4). Monsterverdunningsreeksen leverden lineaire verdunningscurven op voor zowel IgM- als IgG-evaluatie, met een goede parallelliteit van dosis-respons tussen instrumenten over het gehele geëvalueerde verdunningsbereik (1:100-1:12.800). Figuur 3: Precisie tussen de analyses van de Borrelia-test op basis van twee reporters op kralen. Voor de evaluatie van de inter-assay precisie werd Borrelia-specifieke IgM (A) en IgG (B-D) antilichaamrespons van een kwaliteitscontrolemonster geanalyseerd gedurende zeven onafhankelijke runs, telkens in dubbele putjes. De tests werden handmatig uitgevoerd. MFI-waarden werden uitgezet in een Levey-Jennings-grafiek. Een groene lijn geeft het gemiddelde van alle waarden aan. Twee rode stippellijnen geven het tolerantiebereik van de inter-assay precisie aan. Dit werd berekend op basis van de gemiddelde waarde ± 2,5 keer de standaarddeviatie (2,5 S.D.). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Verdunningslineariteit van de Borrelia-test op basis van dubbele reporterparels. Bij monsterverdunningen van 100 tot 12.800 keer waren de verdunningscurven voor zowel IgM-detectie (A) als IgG-detectie (B) vergelijkbaar wanneer ze handmatig werden uitgevoerd met het single-reporter-instrument en het dual-reporter-instrument. Bij alle geteste verdunningen waren de MFI-waarden iets hoger bij gebruik van het instrument met één verslaggever (rode symbolen) dan met het instrument met twee verslaggevers (blauwe symbolen). Getoond zijn verdunningscurven voor 2 representatieve antigenen, waarbij elk verdunningspunt de gemiddelde meting van drievoudige putjes vertegenwoordigt met standaarddeviatie (SD *) aangegeven door foutbalken. Opmerking: Kleine SD’s zijn niet zichtbaar op deze schaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende materialen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Dit rapport belicht de ontwikkeling van een op kralen gebaseerde Borrelia-immunoassay met twee reporters die reproduceerbaar en gevoelig de anti-Borrelia-immunoreactiviteit in serummonsters bepaalt12. De verschillende pathogene Borrelia-soorten die Lyme-borreliose veroorzaken, kunnen worden onderscheiden door variantspecifieke antigeenheterogeniteit 6,7,8,9. De gemultiplexte test evalueert tegelijkertijd de IgG- en IgM-gemedieerde anti-Borrelia-immunoreactiviteit binnen dezelfde reactieput, waardoor reagentia, arbeid en monstermateriaal worden bespaard die anders nodig zijn om twee singleplex-assays afzonderlijk uit te voeren. Door IgM- en IgG-responsen in de loop van de tijd te vergelijken, kan de ziekteprogressie beter worden gevolgd, aangezien IgM-naar-IgG-seroconversie optreedt na infectie6.

Het dual-reporter-systeem maakt gebruik van twee verschillende detectie-antilichaamsystemen13,15. Verwante experimenten toonden geen significante detecteerbare kruisreactiviteit aan tussen Borrelia anti-IgM- en anti-IgG-detectiesystemen wanneer beide antilichaamklassen samen werden geanalyseerd in hetzelfde reactieputje12. Gezien de lagere bindingsaffiniteit van IgM versus IgG-antilichamen16,17, kozen we voor een PE-geconjugeerd detectie-antilichaam voor IgM-detectie (het eerste reporterkanaal van het dual-reporter-instrument) omdat PE een van de sterkst emitterende fluoroforen is die routinematig worden gebruikt in immunoassays18. Voor IgG-evaluatie gebruikten we een gebiotinyleerd detectie-antilichaam dat vervolgens werd verlicht met BV421-geconjugeerd streptavidine (het tweede reporterkanaal van het instrument)19. Ondanks de extra incubatiestap van 30 minuten in vergelijking met het systeem met één verslaggever, levert het systeem met twee verslaggevers twee keer zoveel informatie per reactie op. Over het algemeen vereist de multiplex-assay met twee reporters minder cumulatieve tijd- en materiaalinvoer dan het uitvoeren van twee single-reporter-assays.

De sterke prestaties en stabiliteit van de gemultiplexte Borrelia-test werden geïllustreerd door een hoge reproduceerbaarheid in precisiestudies binnen en tussen de assays, en door het aantonen van verdunningslineariteit en verdunningsparallellisme over een breed scala aan monsterconcentraties voor zowel IgG- als IgM-beoordeling. We hebben hogere absolute fluorescentie-emissieniveaus waargenomen voor dezelfde fluoroforen met behulp van het eenkanaalsinstrument versus het tweekanaalssysteem (≈1,7× hoger met PE), toe te schrijven aan verschillen in de optica en kalibratie-instellingen tussen de twee instrumenten (Figuur 4). Niettemin bleven de fluorescentie-emissiecurven met beide fluoroforen binnen het lineaire bereik van beide instrumenten bij extreme hoge en lage monsterverdunning, en een eventuele discrepantie in de gemeten absolute fluorescentie had geen invloed op de classificatie van de blootstellingsstatus aan Borrelia. 12 okt.

Een groot voordeel van deze op kralen gebaseerde Borrelia multiplex test is het gemak waarmee de test kan worden aangepast of uitgebreid om verschillende of aanvullende analyten te evalueren, bijvoorbeeld om antilichamen tegen antigenen van andere Borrelia soorten te detecteren. xMAP magnetische parelsets bevatten verschillende kleurstofcombinaties die kunnen worden onderscheiden in het classificatiekanaal van het instrument en theoretisch kunnen worden geïmplementeerd in multiplex-assays die tegelijkertijd tot 500 unieke analyten binnen hetzelfde monster kunnen evalueren. Terwijl de huidige studie vier representatieve Borrelia-antigenen belicht om de functionaliteit en stabiliteit van de test aan te tonen en om het single- en dual-reporter-systeem te vergelijken, ondervraagt de uiteindelijke test acht antigenen die samen alle vijf klinisch relevante Borrelia-pathogenen kunnen identificeren die in Europa en Noord-Amerika circuleren12.

Hoge doorvoerprestaties zijn mogelijk met behulp van standaard microtiterplaten met 384 putjes in een semi-geautomatiseerd testformaat. Dankzij de compatibiliteit van de test en het instrument met zowel 96- als 384-putplaten kan de multiplex-test van Borrelia worden gebruikt als een efficiënt screeningsinstrument voor het snel analyseren van grote monstersets, zoals nationale studies20. Handmatige uitvoering van de test blijft mogelijk voor kleinere monstersets met kleinere platen met 96 putjes.

Beperkingen van de studie omvatten de vergelijkende evaluatie van slechts enkele Borrelia-immunoreactiviteitsdoelen in een klein aantal menselijke serummonsters. De oorspronkelijke studie bevestigde echter wel dat de testprestaties voor zowel IgG als IgM behouden bleven bij het analyseren van acht antigenen van alle vijf bekende Borrelia-soorten binnen een grotere steekproefset12. Ook kan het dual-reporter-instrument slechts twee antilichaamisotypen tegelijkertijd beoordelen binnen elke reactie, dus volledige isotypeprofilering zou het uitvoeren van aanvullende testreacties vereisen13.

Concluderend beschrijft dit rapport de succesvolle fusie en conversie van op kralen gebaseerde immunoassays met één reporter in dual-reporter-assays die tegelijkertijd pathogene Borrelia-specifieke IgG– en IgM-antilichamen in menselijke serummonsters kunnen evalueren. Deze gecombineerde aanpak bespaart totale tijd, materiaal en arbeid om hetzelfde gegevensvolume te genereren als twee onafhankelijke tests met één rapport. De multiplex-assay kan worden geschaald van 96-wells tot 384-well microtiterplaatformaat en kan semi-geautomatiseerd worden door het gebruik van gerobotiseerde plaat- en vloeistofbehandelingsinstrumentatie, waardoor het geschikt is voor toepassingen met een hoge doorvoer, zoals grote populatieonderzoeken. Op kralen gebaseerde dual-reporter-assaysystemen hebben eerder nut aangetoond bij het evalueren van bijvoorbeeld immuunresponsen op andere virale en bacteriële pathogenen13,21, het beoordelen van allogene antilichaamresponsen tegen HLA-epitopen bij orgaantransplantatie22 en het onderzoeken van mechanismen van auto-immuunziekten23. Het huidige rapport beschrijft het gebruik van multiplextechnologie om blootstelling aan de Borrelia-pathogenen die de ziekte van Lyme veroorzaken te identificeren, als een voorbeeld van hoe laboratoria deze aanpak kunnen aanpassen voor het onderzoeken van complexe immuunmechanismen in verschillende pathologieën.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit rapport werd gefinancierd door Luminex (Austin, TX). De auteurs danken Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) voor de hulp bij het analytisch en wetenschappelijk redigeren. De auteurs bedanken ook Harald Klein en Christoph von Eichel-Streiber van tgcBIOMICS GmbH (Bingen, Duitsland) voor het leveren van de Borrelia-antigenen die in het onderzoek zijn gebruikt. Menselijke serummonsters voor technische testvalidatie en kwaliteitscontrole werden verkregen uit: 1) de multilokale en seriële prevalentiestudie naar antilichamen tegen SARS-CoV-2 in Duitsland via de afdeling Epidemiologie, Helmholtz Centre for Infection Research, Braunschweig, Duitsland; en 2)de afdeling Neurologie, Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (Rodewisch, Duitsland). Goedkeuring voor het gebruik van menselijke monsters werd verleend door de ethische commissie van de Hannover Medical School, Duitsland (9086_BO_S_2020).

Materials

Antibodies and Detection Reagents Source Catalog Number
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Jackson ImmunoResearch (Dianova) 109-066-098 
Brilliant Violet 421-Streptavidin BD Biosciences 563259
Donkey Anti-Human IgM  Jackson ImmunoResearch (Dianova) 709-116-073
Borrelia Antigens tgcBIOMICS (Bingen, Germany)
Coupling Reagents
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific Pierce 77149 ProteoChem (100 mg)
10x PBS Fisher Scientific BP399-4
BSA Carl Roth T844.3
MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer) Carl Roth 4256.2
Na2HPO4 Carl Roth 4984.1
ProClin300 Sigma 48914-U
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Scientific Pierce 24510 (500 mg)
Triton X-100 Thermo Scientific 85111
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies Source
384-well plate Corning, Cat# 3570
96-well deep-well plates ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450
96-well half-area plates  Corning, Cat# 3690
BioTek 405 TS Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
BioTek MultiFlo FX Plate Washer BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA 
DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes) ThermoFisher, Cat# 12320D
Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX
KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates)  ThermoFisher, Cat# A31508
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) Luminex Corp., Austin, TX
SmartBlock Plates Eppendorf, Cat# 5363000039
ThermoMixer C Eppendorf, Cat# 5382000015
ThermoTop Eppendorf, Cat# 5308000003
xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument) Luminex Corp., Austin, TX
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stanek, G., Strle, F. Lyme borreliosis-from tick bite to diagnosis and treatment. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 233-258 (2018).
  2. Stanek, G., Wormser, G. P., Gray, J., Strle, F. Lyme borreliosis. The Lancet. 379 (9814), 461-473 (2012).
  3. Rizzoli, A., et al. Lyme borreliosis in Europe. Eurosurveillance. 16 (27), 19906 (2011).
  4. Cook, M. J. Lyme borreliosis: a review of data on transmission time after tick attachment. International Journal of General Medicine. 8, 1-8 (2015).
  5. Strle, F., Stanek, G., Lipsker, D., Jaulhac, B. Clinical Manifestations and Diagnosis of Lyme Borreliosis. Lyme Borreliosis: Biological and Clinical Aspects. , 51-110 (2009).
  6. Wilske, B., Fingerle, V., Schulte-Spechtel, U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 49 (1), 13-21 (2007).
  7. Dessau, R. B., et al. To test or not to test? Laboratory support for the diagnosis of Lyme borreliosis: a position paper of ESGBOR, the ESCMID study group for Lyme borreliosis. Clinical Microbiology and Infection. 24 (2), 118-124 (2018).
  8. Eldin, C., et al. Review of European and American guidelines for the diagnosis of Lyme borreliosis. Médecine et Maladies Infectieuses. 49 (2), 121-132 (2019).
  9. Lantos, P. M., et al. Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America (IDSA), American Academy of Neurology (AAN), and American College of Rheumatology (ACR): 2020 Guidelines for the Prevention, Diagnosis and Treatment of Lyme Disease. Clinical Infectious Diseases. 72 (1), e1-e48 (2021).
  10. Gerritzen, A., Brandt, S. Serodiagnosis of Lyme borreliosis with bead based immunoassays using multiplex technology. Methods. 56 (4), 477-483 (2012).
  11. Embers, M. E., et al. Five-antigen fluorescent bead-based assay for diagnosis of Lyme disease. Clinical Vaccine Immunology. 23 (4), 294-303 (2016).
  12. Häring, J., et al. Borrelia multiplex: a bead-based multiplex assay for the simultaneous detection of Borrelia specific IgG/IgM class antibodies. BMC Infectious Diseases. 22 (1), 859 (2022).
  13. Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
  14. Gornyk, D., et al. SARS-CoV-2 Seroprevalence in Germany. Deutsches Ärzteblatt International. 118 (48), 824-831 (2021).
  15. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. . xMAP Cookbook. , (2022).
  16. Racine, R., Winslow, G. M. IgM in microbial infections: Taken for granted. Immunology Letters. 125 (2), 79-85 (2009).
  17. Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature Reviews Immunology. 10 (11), 778-786 (2010).
  18. Kovaleski, G., et al. Extraction and purification of phycobiliproteins from algae and their applications. Frontiers in Chemistry. 10, 1065355 (2022).
  19. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: A new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry Part A. 81 (6), 456-466 (2012).
  20. Coors, A., et al. Regional seropositivity for Borrelia burgdorferi and associated risk factors: findings from the Rhineland Study, Germany. Parasites & Vectors. 15 (1), 241 (2022).
  21. Gürsoy, M., et al. Salivary IgA and IgG antibody responses against periodontitis-associated bacteria in Crohn’s Disease. International Journal of Molecular Science. 24 (3), 2385 (2023).
  22. Argani, H. Anti-HLA Antibody: The role of epitopes in organ transplantation. Experimental and Clinical Transplantation. 17 (Suppl 1), 38-42 (2019).
  23. Laman, J. D., Huizinga, R., Boons, G. J., Jacobs, B. C. Guillain-Barré syndrome: expanding the concept of molecular mimicry. Trends in Immunology. 43 (4), 296-308 (2022).

Tags

Lyme BorreliosisAntibody DetectionMultiplex AssayIgGIgMBorrelia SpeciesDual-reporterLuminexSerological TestingVaccine DevelopmentImmune Response CharacterizationInfectious Disease Monitoring

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Häring, J., Michel, T., Becker, M., Junker, D., Tchitchagua, T., Leschnik, O., Lange, B., Castell, S., Krause, G., Strengert, M., Dulovic, A., Schneiderhan-Marra, N. Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test. J. Vis. Exp. (197), e65323, doi:10.3791/65323 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image