マルチプレックス血清学的検査における異なる抗体クラスの同時検出(英語)

適切な治験審査委員会/倫理委員会の承認を得て、この実験シリーズでのヒト血清サンプルの使用が認められました。サンプルは、SARS-CoV-2の血清有病率に関するドイツの全国研究から得られた匿名化された残留物質でした14。ヒトサンプルの使用は、ドイツのハノーバー医科大学の倫理委員会によって承認されました(9086_BO_S_2020)。今回の研究では、合計21のヒト血清サンプルが使用されました。 1. ヒト試料使用の倫理的承認 ヒトサンプルの使用について適切な倫理的承認を取得します。 2. 試薬・機器 ヒト血清サンプル:以前にライムボレリア症と診断された人、またはボレリア陰性の免疫状態が実証された人からの血清サンプルを使用して、技術的なアッセイの検証と品質管理を実行します12,14。 シングルレポーターインストゥルメンテーション。2チャンネルのシングルレポーター装置(材料表)を使用して、初期アッセイ開発と技術的バリデーションを行います。注:シングルレポーターシステムには2つのレーザーがあります:1)ビーズセット特異的な蛍光を識別して定量し、使用する場合は異なるビーズセットを識別します(分類チャンネル)、2)ビーズ結合ターゲット特異的フィコエリトリン(PE)蛍光を検出および定量します(レポーターチャンネル;532 nm励起、「オレンジ」565-585 nm発光)。したがって、単一のレポーターチャンネルを使用して一度に分析できる抗体アイソタイプクラス(IgGまたはIgMなど)のみです。抗ボレリア IgG と IgM を別々に評価するための初期バリデーション試験を、両方の抗体クラスに PE 標識検出試薬を使用するシングルレポーター 96 ウェルフォーマットで実施します。注:現在のアッセイでは、 ボレリア 抗原VlsEおよびDbpAの2つの変異体に特異的な循環IgGと、抗原OspCに特異的な循環IgMを代表例として評価しています。アッセイは、必要に応じて、他の抗ボレリア 抗原に対する血清免疫反応性を評価するために拡張することができます12。 デュアルレポーターインストゥルメンテーション。デュアル IgM/IgG アッセイの開発および技術的検証には、同じ反応で IgG/IgM の同時分析が可能な 3 チャンネルデュアルレポーター装置(材料表)を使用します(詳細は以下を参照)。この装置には合計3つの蛍光検出チャンネルがあり、そのうち2つは標的のIg関連シグナルを評価するレポーターチャンネルです。注:デュアルレポーターシステムには3つのレーザーがあります:1)ビーズセット特異的な蛍光(分類チャネル)を識別して定量化します。2)ターゲット特異的フィコエリトリン(PE)蛍光(レポーターチャンネル1;532 nm励起、「オレンジ」565-585 nm発光)を検出および定量し、3)第2のターゲット分析種のターゲット特異的ブリリアントバイオレット421(BV421)蛍光を評価します(レポーターチャンネル2;405 nm励起、「青」421-441 nm発光)。デュアルレポーターシステムは、96ウェルと384ウェルの両方のマイクロタイタープレート(半自動ハンドリング)アッセイフォーマットに対応しています。一般的なアッセイスキームを 図1に示します。プロトコルの手順については、以下で詳しく説明します。 3. 抗原カップリング ボレリア抗原を磁性、カルボキシル化、蛍光色分けされた6.5μmマイクロスフェア(ビーズ;資料表)1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)/スルホ-N-ヒドロキシコハク酸イミド(sNHS)ケミストリーを使用。注: 詳細な説明は、参考文献11および参考文献12 に記載されています。各抗原のカップリング濃度を表1に示します。結合ビーズは、使用するまで4°Cの暗所で保管してください。カップリング反応および検出反応に使用されるすべてのバッファーは、 補足資料に詳述されています。 4. アッセイ手順:シングルレポーターIgGまたはIgM血清学的アッセイ:96ウェルフォーマット サンプルを 2 ステップで希釈します(2 ステップ、どちらも 96 ウェルプレート、血清サンプルをアッセイバッファーで 200 倍希釈)。注:アッセイバッファーの組成は、1%(w/v)ウシ血清アルブミンを含む低クロスバッファー:PBSの1:4混合物です。Tween-20 を最終濃度 0.05 %(v/v)になるように混合物に添加します。サンプル希釈ステップ1:血清サンプル5 μLとアッセイバッファー120 μLを混合します(25倍希釈)。 サンプル希釈ステップ2:希釈液10 μLとアッセイバッファー70 μLを混合して、25倍のサンプル希釈液をさらに8倍に希釈し、最終的なサンプル希釈を200倍にします。 磁気ビーズ混合希釈ビーズ集団あたり(すなわち、固有の標的抗原あたり)に1.0×106ビーズ/mLを含むビーズミックスを調製します。 調製したビーズミックスをアッセイバッファーで25倍に希釈し、この希釈懸濁液中の最終的なビーズ濃度がビーズ集団あたり(つまり、固有の標的抗原あたり)に×4〜104ビーズ/mLになるようにします。 ビーズによる血清サンプルのインキュベーション25 μL の希釈結合ビーズ懸濁液(4.0 × 104 ビーズ/セット/mL を含む)を、96 ウェル半面積マイクロタイタープレートの割り当てられたウェルにピペットで移します(材料表)。 25 μLの200倍希釈血清サンプル(上記のステップ4.1から)を、25 μLの結合ビーズ懸濁液を含む適切なウェルに加えます。注:これにより、さらに 2 倍希釈が得られるため、ウェル内の最終的な血清サンプル希釈は 400 倍になり、最終的なビーズ数は 1000 ビーズ/ビーズセット/50 μL 反応になります。 96ウェル反応プレートをマイクロプレートシール(粘着ホイルまたはプラスチックプレートカバー)で覆います。 プレートシェーカーで20°C、750rpmで2時間インキュベートします。 ビーズ洗浄プレートシェーカーから96ウェルリアクションプレートを取り外し、接着プレートシールを慎重に取り外します。 96ウェル反応プレートをプレートウォッシャーに入れます。 自動磁気プレートウォッシャーを使用して、100 μLの洗浄バッファー(1× PBS + 0.05% v/v Tween 20)でビーズを3回洗浄します。 洗浄したビーズを100 μLの洗浄バッファーに再懸濁し、プレートを粘着ホイルまたはプラスチックプレートカバーで覆い、プレートシェーカーでプレートを20°C、1000rpmで1分間振とうします。 洗ったビーズを割るプレートシェーカーから96ウェルリアクションプレートを取り外し、接着プレートシールを慎重に取り外します。 ピペッティングで反応液を 5 回上下させて混合し、100 μL の各反応容量 50 μL を 2 つの新しい 96 ウェル反応プレート (IgG 検出用と IgM 検出用プレート) のそれぞれに移します。 検出抗体/試薬のインキュベーション注:この時点で、標的抗原共役ビーズは血清サンプルとインキュベートされ、抗原と反応する血清中の循環抗体(存在する場合)が抽出されています。免疫グロブリンが結合した反応ビーズは2つのプレートに分けられ、IgGとIgMはPE標識付きのアイソタイプ特異的二次抗体を使用して別々のプレートで検出および定量されます。プレートの取り扱いを20分ずらします。磁気プレートワッシャーを使用して、磁気ビーズを含むウェルから上清を吸引します。 各プレートについて、アッセイバッファーにPE標識ヤギ抗ヒトIgG(3 μg/mL)またはPE標識ロバ抗ヒトIgM(5 μg/mL)を含む適切なIg検出試薬ミックス(抗IgGまたは抗IgM)を調製します。各ビーズ含有ウェルについて、30μLの検出試薬を使用する。反応ウェルに十分な量のIgGおよびIgM検出試薬を調製し、ピペッティングの損失に対応するのに十分な量を確保します。 30 μL の IgG 検出試薬を、IgG プレート上の反応ビーズを含む各ウェルにピペットで移し、96 ウェル反応プレートをマイクロプレートシールで覆います。 30 μL の IgM 検出試薬を、IgM プレート上の反応ビーズを含む各ウェルにピペットで移し、96 ウェル反応プレートをマイクロプレートシールで覆います。 プレートシェーカーで750rpmで振とうしながら、20°Cで45分間インキュベートします。 ビーズ洗浄プレートシェーカーから96ウェルリアクションプレートを取り外し、接着プレートシールを慎重に取り外します。 96ウェル反応プレートを磁気プレートワッシャーに入れます。 磁気プレートワッシャーを使用して、100 μLの洗浄バッファーでビーズを3回洗浄します。 ビーズを100 μLの洗浄バッファーに再懸濁します。 単一のレポーター装置で結果を解析します。96ウェル反応プレートをマイクロプレートシールで覆います。 プレートシェーカーで 96 ウェル反応プレートを 20 °C、1000 rpm で 3 分間振とうします。 プレートシェーカーから96ウェル反応プレートを移し、シングルレポーターフローアナライザー装置に入れます(材料表)。 各サンプルについて、次の装置設定を使用して蛍光強度の中央値(MFI)を分析します:取り込み量 = 80 μL、カウント = 50/ビーズ集団、タイムアウト = 60秒、ゲーティング = 7,500-15,000)12,13。 5. アッセイ手順:デュアルレポーターIgGおよびIgM血清学的アッセイ:96ウェルフォーマット サンプル希釈(2ステップ、いずれも96ウェルプレート、アッセイバッファー中で200倍の血清サンプル希釈)サンプル希釈ステップ1:5 μLの血清サンプルを120 μLのアッセイバッファーと混合します(25倍希釈)。 サンプル希釈ステップ2:最初の希釈液10 μL(セクション5.1.1の25倍希釈サンプル)と70 μLアッセイバッファー(8倍希釈)を混合して、25倍のサンプル希釈液をさらに8倍に希釈し、最終的なサンプル希釈を200倍に希釈します。 磁気ビーズ混合希釈ビーズ集団あたり(すなわち、固有の標的抗原あたり)1.0×10 6ターゲット抗原共役ビーズ/mLを含むビーズミックスを調製します。注:この実験シリーズでは、各反応で4つのユニークな ボレリア 抗原に対するIgGとIgMの両方の免疫反応性を評価しました。 調製したビーズミックスをアッセイバッファーで50倍に希釈します。この希釈懸濁液中のビーズ濃度は、ビーズ集団あたり 2.0 × 104 ビーズ/mL です。注:予備調査で、ビーズ数の半分を使用した場合、蛍光シグナルが定量直線範囲内に維持されることが確認されたため、2 つのアッセイ間の直接的な比較可能性を可能にし、リソースを節約するために、二本鎖アッセイ反応におけるビーズの数は、シングルレポーター反応で使用したビーズの数から半分に減らしました。 ビーズによる血清サンプルのインキュベーション25 μLの希釈標的抗原共役ビーズ懸濁液(2.0 × 104 ビーズ/セット/mLを含む)を、96ウェルハーフエリアマイクロタイタープレートのあらかじめ割り当てられたウェルにピペットで移します。反応ウェルの正確な数とプレート上の配置は、オペレーターが決定したテストされたサンプルの総数と、サンプルごとに単一ウェルと複製ウェルのどちらを実行するかによって異なります。注:標的抗原共役磁気ビーズは、ヒト血清サンプルと反応します。抗ボレリア 抗原免疫反応性IgGとIgMの両方がサンプル中に存在する場合、同じ抗原共役ビーズに結合し、固定化されます。次に、結合したIgGとIgMの二次抗体定量を、同じ反応で同じビーズに対して実行し、IgGとIgMの同定に異なる蛍光色素を使用して、それらの分化を可能にします。 25 μLの200倍希釈血清(上記のステップ5.1から)を、25 μLの混合標的抗原共役ビーズ懸濁液を含む各ウェルに加えます(ステップ5.2)。注:これにより、さらに 2 倍希釈が生成されるため、ウェル内の最終的な血清サンプル希釈は 400 倍になり、最終的なビーズ数は 500 ビーズ/ビーズセット/50 μL 反応になります。 96ウェル反応プレートをマイクロプレートシール(粘着箔またはプラスチックプレートカバー)で覆います。 プレートをビーズとともに、プレートシェーカー上で20°C、750rpmで2時間インキュベートします。 ビーズ洗浄(余分な血清サンプルを除去するため)プレートシェーカーから96ウェルリアクションプレートを取り外し、接着プレートシールを取り外します。 96ウェル反応プレートを磁気プレートワッシャーに入れます。 磁気プレートワッシャーを使用して、100 μLの洗浄バッファーでビーズを3回洗浄します。 最終洗浄ステップ後のビーズから最終洗浄量を吸引します。 検出抗体(インキュベーション – パートI)ビオチン化ヤギ抗ヒトIgG(1 μg/mL)とPE標識ロバ抗ヒトIgM(5 μg/mL)を含む新鮮なIgGおよびIgMデュアル検出試薬をアッセイバッファーに作製します。ビーズ含有ウェルごとに、30 μLのデュアル検出試薬を使用します。反応ウェルに十分な量の IgG および IgM デュアル検出試薬を調製し、ピペッティングの損失に対応するのに十分な量を確保します。 30 μL の IgG および IgM デュアル検出試薬を割り当てられた各ウェルにピペットで移し、96 ウェル反応プレートをマイクロプレートシールで覆います。 プレートシェーカーで750rpmで振とうしながら、プレートを20°Cで45分間インキュベートします。 ビーズ洗浄(過剰検出抗体の除去)プレートシェーカーから96ウェルリアクションプレートを取り外し、接着プレートシールを慎重に取り外します。 96ウェル反応プレートを自動磁気プレート洗浄機に入れます。 自動磁気プレートウォッシャーを使用して、100 μLの洗浄バッファーでビーズを3回洗浄します。 最終洗浄ステップ後のビーズから最終洗浄量を吸引します。 ストレプトアビジン標識レポーター(インキュベーション – パートII)新鮮なBV421標識ストレプトアビジンをアッセイバッファーで0.2 μg/mLの濃度に希釈します。ビーズ含有ウェルごとに、30 μLのBV421標識ストレプトアビジンを使用します。反応ウェル用に十分な量のBV421標識ストレプトアビジンを調製し、ピペッティングの損失に対応するのに十分な量を余分に用意します。 希釈したBV421-ストレプトアビジン30 μLを各反応ウェルにピペットで移し、96ウェル反応プレートをマイクロプレートシールで覆います。 プレートシェーカーで750rpmで振とうしながら、プレートを20°Cで30分間インキュベートします。 洗浄ビーズ(余分なBV421-ストレプトアビジンを除去するため)プレートシェーカーから96ウェルリアクションプレートを取り外し、接着プレートシールを慎重に取り外します。 96ウェル反応プレートを磁気プレートワッシャーに入れます。 自動磁気プレートウォッシャーを使用して、100 μLの洗浄バッファーでビーズを3回洗浄します。 ウェル内のビーズを洗浄バッファー中に最終容量100 μLになるまで再懸濁します。 デュアルレポーター装置で結果を分析96ウェル反応プレートをマイクロプレートシールで覆います。 96ウェル反応プレートをプレートシェーカーで20°C、1000rpmで3分間インキュベートします。 96ウェル反応プレートをプレートシェーカーからデュアルレポーターフローアナライザー装置に移します(材料表)。 メーカーの指示に従ってサンプルの蛍光強度(MFI)の中央値を評価します(装置設定:デュアルレポーターモード、取り込み量 = 80 μL、カウント = 50/ビーズ集団、タイムアウト = 60秒、ゲーティング = 7,500-15,000)。 6. デュアルレポーターIgGおよびIgM血清学的アッセイ:384ウェル半自動フォーマット デュアルレポーターアッセイは、セクション5で詳述したアッセイステップを使用して384ウェルプレートフォーマットで実施しますが、サンプルはピペッティングロボットと自動磁気プレートウォッシャーを使用して処理します(材料表)。384ウェルフォーマットでは、インキュベーション中にプレートを振とうし、1450 rpmで洗浄し、蛍光を測定する前に、プレートを21°Cおよび1800 rpmで5分間振とうします。