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Genetics

Un flujo de trabajo integrado para estudiar la arquitectura del genoma espacio-temporal centrada en el promotor en poblaciones celulares escasas

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/65316
, , , ,
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

Summary

La expresión génica está regulada por interacciones de promotores génicos con elementos reguladores distales. Aquí, describimos cómo la baja entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite la identificación de estas interacciones en tipos de células raras, que antes no se podían medir.

Abstract

La transcripción de genes espaciotemporales está estrechamente regulada por elementos reguladores distales, como potenciadores y silenciadores, que dependen de la proximidad física con sus promotores de genes objetivo para controlar la transcripción. Aunque estos elementos reguladores son fáciles de identificar, sus genes diana son difíciles de predecir, ya que la mayoría de ellos son específicos de tipo celular y pueden estar separados por cientos de kilobases en la secuencia lineal del genoma, saltándose otros genes no diana. Durante varios años, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) ha sido el estándar de oro para la asociación de elementos reguladores distales a sus genes diana. Sin embargo, PCHi-C se basa en la disponibilidad de millones de células, lo que prohíbe el estudio de poblaciones de células raras, como las que se obtienen comúnmente de los tejidos primarios. Para superar esta limitación, se ha desarrollado Low input Capture Hi-C (liCHi-C), un método rentable y personalizable para identificar el repertorio de elementos reguladores distales que controlan cada gen del genoma. liCHi-C se basa en un marco experimental y computacional similar al PCHi-C, pero al emplear cambios mínimos en los tubos, modificar la concentración y los volúmenes del reactivo e intercambiar o eliminar pasos, representa una pérdida mínima de material durante la construcción de la biblioteca. En conjunto, liCHi-C permite el estudio de la regulación génica y la organización del genoma espaciotemporal en el contexto de la biología del desarrollo y la función celular.

Introduction

La expresión génica temporal impulsa la diferenciación celular y, en última instancia, el desarrollo del organismo, y su alteración está estrechamente relacionada con una amplia plétora de enfermedades 1,2,3,4,5. La transcripción génica está finamente regulada por la acción de elementos reguladores, que pueden clasificarse como proximales (es decir, promotores génicos) y distales (por ejemplo, potenciadores o silenciadores), estos últimos frecuentemente ubicados lejos de sus genes diana e interactúan físicamente con ellos a través del bucle de cromatina para modular la expresión génica 6,7,8.

La identificación de regiones reguladoras distales en el genoma es un asunto ampliamente consensuado, ya que estas regiones albergan modificaciones específicas de histonas 9,10,11 y contienen motivos específicos de reconocimiento de factores de transcripción, actuando como plataformas de reclutamiento para ellos12,13,14. Además, en el caso de los potenciadores y superpotenciadores 15,16, también tienen baja ocupación nucleosómica 17,18 y se transcriben en eRNAs no codificantes 19,20.

No obstante, los genes diana de cada elemento regulador distal son más difíciles de predecir. La mayoría de las veces, las interacciones entre los elementos reguladores distales y sus objetivos son de tipo celular y específicas del estímulo 21,22, abarcan cientos de kilobases, puenteando sobre otros genes en cualquier dirección 23,24,25, e incluso pueden ubicarse dentro de regiones intrónicas de su gen objetivo u otros genes no intervinientes 26,27. Además, los elementos reguladores distales también pueden controlar más de un gen al mismo tiempo, y viceversa28,29. Esta complejidad posicional dificulta la identificación de asociaciones regulatorias entre ellos y, por lo tanto, la mayoría de los objetivos de cada elemento regulador en cada tipo de célula siguen siendo desconocidos.

Durante los últimos años, ha habido un auge significativo en el desarrollo de técnicas de captura de conformación cromosómica (3C) para estudiar las interacciones de la cromatina. El más utilizado de ellos, Hi-C, permite generar un mapa de todas las interacciones entre cada fragmento del genoma de una célula30. Sin embargo, para detectar interacciones significativas a nivel de fragmento de restricción, Hi-C se basa en la secuenciación ultraprofunda, lo que prohíbe su uso para estudiar rutinariamente el panorama regulatorio de genes individuales. Para superar esta limitación económica, han surgido varias técnicas 3C basadas en el enriquecimiento, como ChIA-PET31, HiChIP 32 y su contraparte HiCuT33 de baja entrada. Estas técnicas dependen del uso de anticuerpos para enriquecer las interacciones de todo el genoma mediadas por una proteína específica. No obstante, la característica única de estas técnicas 3C es también la pesadilla de su aplicación; Los usuarios cuentan con la disponibilidad de anticuerpos de alta calidad para la proteína de interés y no pueden comparar condiciones en las que la unión de la proteína es dinámica.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) es otra técnica 3C basada en el enriquecimiento que elude estas limitaciones34,35. Mediante el empleo de un sistema de enriquecimiento de sonda de ARN biotinilado, PCHi-C es capaz de generar bibliotecas de alta resolución de todo el genoma de regiones genómicas que interactúan con 28.650 promotores de genes anotados en humanos o 27.595 en ratones, también conocidos como interactoma promotor. Este enfoque permite detectar interacciones significativas de largo alcance a nivel de resolución de fragmentos de restricción de promotores activos e inactivos, y comparar robustamente los interactomas promotores entre cualquier condición independientemente de la dinámica de las modificaciones de histonas o la unión a proteínas. El PCHi-C ha sido ampliamente utilizado en los últimos años para identificar reorganizaciones del interactoma promotor durante la diferenciación celular 36,37, identificar el mecanismo de acción de los factores de transcripción38,39 y descubrir nuevos genes potenciales y vías desreguladas en la enfermedad por variantes no codificantes 40,41,42,43,44,45,46,47,48, junto con nuevas mutaciones no codificantes49,50. Además, con solo modificar el sistema de captura, esta técnica puede personalizarse de acuerdo con la pregunta biológica para interrogar cualquier interactoma (por ejemplo, el interactoma potenciador 51 o el interactoma de una colección de alteraciones no codificantes41,52).

Sin embargo, PCHi-C se basa en un mínimo de 20 millones de células para realizar la técnica, lo que impide el estudio de poblaciones celulares escasas como las que se utilizan a menudo en biología del desarrollo y aplicaciones clínicas. Por esta razón, hemos desarrollado Low input Capture Hi-C (liCHi-C), un nuevo método rentable y personalizable basado en el marco experimental de PCHi-C para generar interactomas promotores de alta resolución con entrada de baja celda. Al realizar el experimento con cambios mínimos de tubo, intercambiar o eliminar pasos del protocolo PCHi-C original, reducir drásticamente los volúmenes de reacción y modificar las concentraciones de reactivos, se maximiza la complejidad de la biblioteca y es posible generar bibliotecas de alta calidad con tan solo 50,000 celdas53.

La captura Hi-C de baja entrada (liCHi-C) ha sido comparada con PCHi-C y utilizada para dilucidar el recableado del interactoma promotor durante la diferenciación de células hematopoyéticas humanas, descubrir nuevos genes y vías potenciales asociadas a enfermedades desreguladas por alteraciones no codificantes y detectar anomalías cromosómicas53. El protocolo paso a paso y los diferentes controles de calidad a través de la técnica se detallan aquí hasta la generación final de las librerías y su análisis computacional.

Protocol

Para garantizar una pérdida mínima de material, (1) trabaje con tubos y puntas de ADN de baja unión (consulte la Tabla de materiales), (2) coloque reactivos en la pared del tubo en lugar de introducir la punta dentro de la muestra y, (3) si es posible, mezcle la muestra por inversión en lugar de pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo, y gire hacia abajo después para recuperar la muestra. 1. Fijación celular Células que crecen en suspen…

Representative Results

liCHi-C ofrece la posibilidad de generar bibliotecas de interactoma promotor de todo el genoma de alta calidad y resolución con tan solo 50.000 células53. Esto se logra – además de la reducción drástica de los volúmenes de reacción y el uso de artículos de plástico de baja unión de ADN en todo el protocolo – eliminando pasos innecesarios del protocolo original, en los que se producen pérdidas significativas de material. Estos incluyen la purificación de fenol después de la desinte…

Discussion

liCHi-C ofrece la capacidad de generar bibliotecas de interactoma promotor de alta resolución utilizando un marco experimental similar al de PCHi-C, pero con un número de células muy reducido. Esto se logra en gran medida mediante la eliminación de pasos innecesarios, como la purificación de fenol y la eliminación de biotina. En el protocolo clásico Hi-C de ligadura en núcleo57 y su posterior técnica derivada PCHi-C, la biotina se elimina de fragmentos de restricción no ligados para evit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al resto de miembros del laboratorio Javierre sus comentarios sobre el manuscrito. Agradecemos al Programa CERCA, a la Generalitat de Catalunya y a la Fundación Josep Carreras por el apoyo institucional. Este trabajo ha sido financiado por FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación (RTI2018-094788-A-I00), la Asociación Europea de Hematología (4823998) y la Asociación Española contra el Cáncer (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ está financiado por el proyecto Junior Leader de la Fundación Bancaria La Caixa (LCF/BQ/PI19/11690001), LR está financiado por una beca AGAUR FI (2019FI-B00017) y LT-D está financiado por una beca FPI (PRE2019-088005). Agradecemos el apoyo del programa de doctorado en bioquímica y biología molecular de la Universitat Autònoma de Barcelona. Ninguno de los financiadores participó en ningún momento en el diseño experimental o la redacción del manuscrito.

Materials

0.4 mM Biotin-14-dATP Invitrogen 19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9260G
1 M Tris pH 8.0 Invitrogen AM9855G
10x NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS Fisher Scientific BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England Biolabs B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free Thermo Scientific 28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9000S
5 M NaCl Invitrogen AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes Qiuantabio 2302820 For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification Integrated DNA Technologies – Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers Nunc 179693 Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) Any brand
CHiCAGO R package 1.14.0
CleanNGS beads CleanNA CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U120A, U121A, U122A, U123A Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DNA LoBind tube, 2 mL Eppendorf 30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL New England Biolabs M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65002 For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads Invitrogen 65602 For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2 Invitrogen 12321D Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute VWR 20821.321
FBS, qualified Gibco 10270-106 Or any other brand
Glycine Fisher BioReagents BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant Invitrogen AM9515 Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP 0.8.2
HindIII, 100 U/µL New England Biolabs R0104T
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL New England Biolabs M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) ZeroTip PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials Covaris 520045 For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL New England Biolabs R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water Sigma-Aldrich W4502
PCR primers for quality controls Integrated DNA Technologies –
PCR strips and caps Agilent Technologies 410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA Sigma-Aldrich P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531L For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Roche 11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche 3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit Invitrogen Q33230 For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
rCutsmart buffer New England Biolabs B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX Gibco 61870-010 Or any other brand
SDS – Solution 10% for molecular biology PanReac AppliChem A0676
Sodium acetate pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library Agilent Technologies 5190-4831 Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent Technologies 5190-8645 Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter Agilent Technologies 931107 Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 15224025 For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL New England Biolabs M0202T For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL New England Biolabs M0203L
T4 PNK 10000 units/mL New England Biolabs M0201L
Tapestation 4200 instrument Agilent Technologies For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents Agilent Technologies 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology PanReac AppliChem A4975
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
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LiCHi-CChromatin InteractionsGenome OrganizationGene RegulationRegulatory ElementsPromoter-centricSpatiotemporalRare Cell PopulationsLow InputCapture Hi-C

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Rovirosa, L., Tomás-Daza, L., Urmeneta, B., Valencia, A., Javierre, B. M. An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations. J. Vis. Exp. (194), e65316, doi:10.3791/65316 (2023).
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