Un flusso di lavoro integrato per studiare l'architettura del genoma spazio-temporale centrata sul promotore in popolazioni cellulari scarse

L’espressione genica temporale guida la differenziazione cellulare e, in definitiva, lo sviluppo dell’organismo, e la sua alterazione è strettamente correlata a un’ampia pletora di malattie 1,2,3,4,5. La trascrizione genica è finemente regolata dall’azione di elementi regolatori, che possono essere classificati come prossimali (cioè promotori genici) e distali (ad esempio, potenziatori o silenziatori), questi ultimi sono frequentemente situati lontano dai loro geni bersaglio e interagiscono fisicamente con loro attraverso il looping della cromatina per modulare l’espressione genica ^6,7,8.

L’identificazione delle regioni regolatorie distali nel genoma è una questione ampiamente condivisa, poiché queste regioni ospitano specifiche modificazioni degli istoni 9,10,11 e contengono specifici motivi di riconoscimento dei fattori di trascrizione, fungendo da piattaforme di reclutamento per loro^12,13,14. Inoltre, nel caso di enhancer e super-enhancers 15,16, hanno anche una bassa occupazione nucleosomica 17,18 e sono trascritti in eRNA non codificanti ^19,20.

Tuttavia, i geni bersaglio di ciascun elemento regolatore distale sono più difficili da prevedere. Il più delle volte, le interazioni tra gli elementi regolatori distali e i loro bersagli sono specifiche del tipo cellulare e dello stimolo 21,22, si estendono su centinaia di kilobasi, collegando altri geni in qualsiasi direzione 23,24,25 e possono anche essere localizzate all’interno di regioni introniche del loro gene bersaglio o di altri geni non intervenienti ^26,27. Inoltre, gli elementi regolatori distali possono anche controllare più di un gene allo stesso tempo, e viceversa^28,29. Questa complessità posizionale ostacola l’individuazione delle associazioni regolatorie tra loro e, pertanto, la maggior parte degli obiettivi di ciascun elemento regolatore in ogni tipo di cellula rimane sconosciuta.

Negli ultimi anni, c’è stato un boom significativo nello sviluppo di tecniche di cattura della conformazione cromosomica (3C) per lo studio delle interazioni della cromatina. Il più utilizzato di essi, Hi-C, permette di generare una mappa di tutte le interazioni tra ogni frammento del genoma di una cellula³⁰. Tuttavia, per rilevare interazioni significative a livello di frammento di restrizione, Hi-C si basa sul sequenziamento ultra-profondo, vietandone l’uso per studiare regolarmente il panorama regolatorio dei singoli geni. Per superare questa limitazione economica, sono emerse diverse tecniche 3C basate sull’arricchimento, come ChIA-PET³¹, HiChIP 32 e la sua controparte a basso input HiCuT³³. Queste tecniche dipendono dall’uso di anticorpi per arricchire le interazioni genome-wide mediate da una proteina specifica. Tuttavia, la caratteristica unica di queste tecniche 3C è anche la rovina della loro applicazione; Gli utenti contano sulla disponibilità di anticorpi di alta qualità per la proteina di interesse e non possono confrontare le condizioni in cui il legame della proteina è dinamico.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) è un’altra tecnica 3C basata sull’arricchimento che aggira queste limitazioni^34,35. Utilizzando un sistema di arricchimento della sonda di RNA biotinilato, PCHi-C è in grado di generare librerie ad alta risoluzione a livello di genoma di regioni genomiche che interagiscono con 28.650 promotori genici umani o 27.595 annotati nel topo, noti anche come interattoma del promotore. Questo approccio consente di rilevare interazioni significative a lungo raggio alla risoluzione a livello di frammento di restrizione di entrambi i promotori attivi e inattivi e di confrontare in modo robusto gli interattomi del promotore tra qualsiasi condizione indipendentemente dalla dinamica delle modificazioni istoniche o del legame proteico. PCHi-C è stato ampiamente utilizzato negli ultimi anni per identificare le riorganizzazioni dell’interattoma del promotore durante il differenziamento cellulare 36,37, identificare il meccanismo d’azione dei fattori di trascrizione^38,39 e scoprire nuovi potenziali geni e vie deregolate nella malattia da varianti non codificanti 40,41,42,43,44,45^,46,47,48, accanto alle mutazioni non codificanti del nuovo driver^49,50. Inoltre, semplicemente modificando il sistema di cattura, questa tecnica può essere personalizzata in base alla domanda biologica per interrogare qualsiasi interattoma (ad esempio, l’interattoma enhancer 51 o l’interattoma di una raccolta di alterazioni non codificanti^41,52).

Tuttavia, PCHi-C si basa su un minimo di 20 milioni di cellule per eseguire la tecnica, che impedisce lo studio di popolazioni cellulari scarse come quelle spesso utilizzate nella biologia dello sviluppo e nelle applicazioni cliniche. Per questo motivo, abbiamo sviluppato Capture Hi-C (liCHi-C) a basso input, un nuovo metodo economico e personalizzabile basato sul framework sperimentale di PCHi-C per generare interattomi promotori ad alta risoluzione con input a bassa cella. Eseguendo l’esperimento con minime modifiche del tubo, scambiando o eliminando passaggi dal protocollo PCHi-C originale, riducendo drasticamente i volumi di reazione e modificando le concentrazioni di reagenti, la complessità della libreria è massimizzata ed è possibile generare librerie di alta qualità con un minimo di 50.000 celle⁵³.

Low input Capture Hi-C (liCHi-C) è stato confrontato con PCHi-C e utilizzato per chiarire il ricablaggio dell’interattoma del promotore durante la differenziazione delle cellule ematopoietiche umane, scoprire potenziali nuovi geni e percorsi associati alla malattia deregolati da alterazioni non codificanti e rilevare anomalie cromosomiche⁵³. Il protocollo passo-passo e i diversi controlli di qualità attraverso la tecnica sono dettagliati qui fino alla generazione finale delle librerie e alla loro analisi computazionale.