Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

Die zeitliche Genexpression treibt die Zelldifferenzierung und letztendlich die Entwicklung von Organismen voran, und ihre Veränderung steht in engem Zusammenhang mit einer Vielzahl von Krankheiten 1,2,3,4,5. Die Gentranskription wird durch die Wirkung von regulatorischen Elementen fein reguliert, die als proximal (d. h. Genpromotoren) und distale (z. B. Enhancer oder Silencer) klassifiziert werden können, von denen letztere häufig weit von ihren Zielgenen entfernt sind und physisch mit ihnen durch Chromatinschleifen interagieren, um die Genexpression zu modulieren ^6,7,8.

Die Identifizierung distaler regulatorischer Regionen im Genom ist eine Angelegenheit, über die man sich weitgehend einig ist, da diese Regionen spezifische Histonmodifikationen^aufweisen 9,10,11 und spezifische Transkriptionsfaktor-Erkennungsmotive enthalten, die als Rekrutierungsplattformen für sie fungieren^12,13,14. Außerdem haben sie im Fall von Enhancern und Super-Enhancern 15,16 auch eine geringe Nukleosomenbelegung 17,18 und werden in nicht-kodierende eRNAs transkribiert ^19,20.

Nichtsdestotrotz sind die Zielgene der einzelnen distalen regulatorischen Elemente schwieriger vorherzusagen. In den meisten Fällen sind Interaktionen zwischen distalen regulatorischen Elementen und ihren Zielen zelltyp- und stimulusspezifisch 21,22, erstrecken sich über Hunderte von Kilobasen, überbrücken andere Gene in jede Richtung 23,24,25 und können sogar innerhalb von intronischen Regionen ihres Zielgens oder anderer nicht dazwischenliegender Gene lokalisiert werden ^26,27. Darüber hinaus können distale regulatorische Elemente auch mehr als ein Gen gleichzeitig steuern und umgekehrt^28,29. Diese Positionskomplexität erschwert es, regulatorische Zusammenhänge zwischen ihnen zu lokalisieren, und daher bleiben die meisten Ziele der einzelnen regulatorischen Elemente in jedem Zelltyp unbekannt.

In den letzten Jahren gab es einen bedeutenden Boom bei der Entwicklung von Techniken zur Erfassung der Chromosomenkonformation (3C) zur Untersuchung von Chromatin-Interaktionen. Die am weitesten verbreitete von ihnen, Hi-C, ermöglicht es, eine Karte aller Interaktionen zwischen jedem Fragment des Genoms einer Zelle zu erstellen³⁰. Um jedoch signifikante Wechselwirkungen auf der Ebene der Restriktionsfragmente zu erkennen, verlässt sich Hi-C auf eine ultratiefe Sequenzierung, die seine Verwendung zur routinemäßigen Untersuchung der regulatorischen Landschaft einzelner Gene verbietet. Um diese wirtschaftlichen Einschränkungen zu überwinden, haben sich mehrere anreicherungsbasierte 3C-Techniken herausgebildet, wie z. B. ChIA-PET³¹, HiChIP 32 und sein Gegenstück HiCuT³³ mit geringem Input. Diese Techniken beruhen auf der Verwendung von Antikörpern zur Anreicherung für genomweite Interaktionen, die durch ein bestimmtes Protein vermittelt werden. Nichtsdestotrotz ist das Alleinstellungsmerkmal dieser 3C-Techniken auch der Fluch ihrer Anwendung; Anwender verlassen sich auf die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Antikörpern für das interessierende Protein und können Bedingungen nicht vergleichen, unter denen die Bindung des Proteins dynamisch ist.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) ist eine weitere anreicherungsbasierte 3C-Technik, die diese Einschränkungen umgeht^34,35. Durch den Einsatz eines biotinylierten RNA-Sondenanreicherungssystems ist PCHi-C in der Lage, genomweite hochauflösende Bibliotheken von Genomregionen zu erstellen, die mit 28.650 humanen oder 27.595 mausannotierten Genpromotoren interagieren, die auch als Promotor-Interaktom bekannt sind. Dieser Ansatz ermöglicht es, signifikante langreichweitige Wechselwirkungen bei der Auflösung von Restriktionsfragmenten sowohl von aktiven als auch von inaktiven Promotoren zu detektieren und Promotor-Interaktome zwischen allen Bedingungen unabhängig von der Dynamik von Histonmodifikationen oder Proteinbindungen robust zu vergleichen. PCHi-C wurde in den letzten Jahren häufig eingesetzt, um Promotor-Interaktom-Reorganisationen während der Zelldifferenzierung zu identifizieren 36,37, den Wirkmechanismus von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren^38,39 und neue potenzielle Gene und Signalwege zu entdecken, die bei Krankheiten durch nicht-kodierende Varianten dereguliert werden 40,41,42,43,44,45^,46,47,48, daneben neue nicht-kodierende Treibermutationen^49,50. Außerdem kann diese Technik durch einfaches Modifizieren des Erfassungssystems entsprechend der biologischen Fragestellung angepasst werden, um jedes Interaktom (z. B. das Enhancer-Interaktom 51 oder das Interaktom einer Sammlung von nicht-kodierenden Veränderungen^{41, 52}) abzufragen.

PCHi-C ist jedoch auf mindestens 20 Millionen Zellen angewiesen, um die Technik durchzuführen, was die Untersuchung knapper Zellpopulationen, wie sie häufig in der Entwicklungsbiologie und in klinischen Anwendungen verwendet werden, verhindert. Aus diesem Grund haben wir Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) entwickelt, eine neue kostengünstige und anpassbare Methode, die auf dem experimentellen Rahmen von PCHi-C basiert, um hochauflösende Promotor-Interaktome mit geringem Zellinput zu erzeugen. Durch die Durchführung des Experiments mit minimalen Röhrchenänderungen, dem Austausch oder der Eliminierung von Schritten aus dem ursprünglichen PCHi-C-Protokoll, der drastischen Reduzierung des Reaktionsvolumens und der Änderung der Reagenzienkonzentrationen wird die Komplexität der Bibliothek maximiert und es ist möglich, qualitativ hochwertige Bibliotheken mit nur 50.000 Zellen zu generieren⁵³.

Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) wurde mit PCHi-C verglichen und verwendet, um die Neuverdrahtung des Promotor-Interaktoms während der Differenzierung menschlicher hämatopoetischer Zellen aufzuklären, potenzielle neue krankheitsassoziierte Gene und Signalwege zu entdecken, die durch nicht-kodierende Veränderungen dereguliert werden, und Chromosomenanomalien zu erkennen⁵³. Das Schritt-für-Schritt-Protokoll und die verschiedenen Qualitätskontrollen durch die Technik werden hier bis zur endgültigen Generierung der Bibliotheken und ihrer rechnerischen Analyse detailliert beschrieben.