DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

ゲノムDNAの損傷は、自然崩壊、内部損傷、および環境要因によって発生します¹。結果として生じるDNA病変は、損傷した塩基、ミスマッチ、一本鎖および二本鎖の切断、鎖間および鎖内架橋、およびDNA-タンパク質架橋(DPC)で構成されます。DPCは、クロマチン結合タンパク質が共有結合によってDNA上にトラップされると形成されます。DPCは、内因性DNA病変および反応性代謝物、ならびに化学療法薬および二官能性架橋剤などの外因性薬剤によって誘導される。特定の状況下では、酵素機能障害もDPCの形成^{につながる可能性があります2。}DPC誘導物質の大きな違いは、共有結合タンパク質の同一性、DPCが形成される染色体領域、タンパク質に架橋されたDNAの構造タイプ、およびタンパク質とDNA間の共有結合の化学的性質に違いをもたらします^2,3,4。

DPCは、その化学的性質に基づいて、一般に酵素DPCと非酵素DPCの2つのグループに分類されます。 トポイソメラーゼ、グリコシラーゼ、メチル/アシルトランスフェラーゼなどの特定の酵素は、通常の触媒反応中に可逆的な酵素-DNA共有結合中間体を形成することによって作用します。これらは短寿命の酵素-DNA中間体であり、内因性または外因性の薬剤、特に化学療法薬によってトラップされると、長寿命の酵素DPCに変換^{できます3。}トポイソメラーゼDPCは、真核細胞において最も頻繁に使用される酵素DPCの一つであり、臨床的に有用なトポイソメラーゼ阻害剤(トポイソメラーゼI [TOP1]の場合はトポテカンおよびイリノテカン、トポイソメラーゼII [TOP2]の場合はエトポシドおよびドキソルビシン)によって生成することができ、これらの阻害剤の主要な治療メカニズムです^5,6.DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)1、3A、および3Bは、5-アザ-2′-デオキシシチジン(デシタビンとしても知られている)の標的であり、薬物⁷への曝露時にDPCを形成します。反応性薬剤は、紫外線および電離放射線と同様に、タンパク質をDNAに非特異的に架橋することによって非酵素的DPCを誘導する。アセトアルデヒドやホルムアルデヒド(FA)などの反応性アルデヒドは、細胞代謝の副産物として生成されることが多く、その中でFAはメタノール代謝、脂質過酸化、ヒストン脱メチル化の際にマイクロモル濃度で生成されます。また、FAは世界中で製造されている大量生産の化学物質であり、多くの人々が環境的および職業的にさらされています^8,9。

酵素的および非酵素的DPCはどちらも、そのかさばるタンパク質成分が複製および転写を含むほぼすべてのクロマチンベースのプロセスを効率的に妨げ、修復せずに放置すると細胞周期の停止およびアポトーシスを引き起こすため、細胞に対して非常に毒性があります。過去20年間、DPCの修復は精力的に研究されており、DPCを直接修復するか、修復プロセスを調節する重要な要因として、いくつかのタンパク質/経路が特定されています。例えば、DPCのタンパク質バルクのタンパク質分解がDPC修復の重要なステップであり、タンパク質分解がプロテアーゼSPRTN 10、11^、12、13、14、FAM111A¹⁵、GCNA^16、17、または26Sプロテアソーム複合体¹⁸、¹⁹、^20、21、22によって触媒され得ることは十分に確立されている,23,24,25,26,27は、細胞型または細胞状況依存的に。これらのプロテアーゼの同定および特性評価は、酵素(ICE)アッセイ^28,29およびDNA付加体回収への迅速なアプローチ(RADAR)アッセイ^30,31のin vivo複合体に大きく依存しており、どちらも遊離細胞タンパク質からDNA分子およびその共有結合タンパク質を単離し、架橋タンパク質を標的とする抗体を用いたスロットブロットによるDPCの検出を可能にする。また、トラップインアガロースDNA免疫染色(TARDIS)アッセイは、単一細胞レベルでDPCを検出および定量する手段として使用されました³²。現在、ICEアッセイは非常に時間がかかる塩化セシウム勾配超遠心分離を使用した核酸の精製に依存しているのに対し、レーダーアッセイはエタノールを使用して核酸をはるかに短い期間で沈殿させるため、研究者はICEアッセイよりもレーダーアッセイを選択してDPCを測定しています。

近年、DPC標的プロテアーゼのシグナル伝達と動員に複数の翻訳後修飾(PTM)が関与しているという証拠が増えています3,33,34,35。例えば、TOP1-DPCとTOP2-DPCの両方が、DNA複製と転写とは無関係に、低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)-2/3によって結合し、次にSUMO-1によってSUMO-3リガーゼPIAS4によって結合することがわかりました。逐次SUMO修飾はユビキチンの標的であると考えられ、ユビキチンはSUMO化TOP-DPCに沈着し、RNF4と呼ばれるSUMO標的ユビキチンリガーゼによってリジン48残基を介してポリマー鎖を形成します。続いて、ユビキチンポリマーは、26Sプロテアソームへのシグナルを惹起し、^{TOP-DPCs23,36}に動員する。同じSUMOユビキチン経路が最近、DNMT1-DPCおよびPARP-DNA複合体に作用して修復することが示されました^37,38。さらに、ユビキチンE3リガーゼTRAIPによるSUMO非依存性ユビキチン化は、複製共役様式でプロテアソーム分解のためにDPCをプライムすることが報告されています³⁹。TOP-DPCのプロテアソーム分解と同様に、複製共役メタロプロテアーゼSPRTNによる酵素的および非酵素的DPCのタンパク質分解も、SPRTN^40,41を係合させるメカニズムとしてDPC基質のユビキチン化を必要とします。SUMO化とユビキチン化の役割を説明するには、これらのPTMでマークされたDPCを検出する必要があります。オリジナルのICEアッセイとRADARアッセイは、未消化のDNAサンプルを測定するためにスロットブロット/ドットブロット装置に依存しているため、これら2つのアッセイはどちらも、分子量の異なるPTM結合DPC種を分解して視覚化することはできません。この問題を克服するために、エタノール沈殿による精製とミクロコッカスヌクレアーゼ、DNAおよびRNAエンドエキソヌクレアーゼによるサンプル正規化によってDNAサンプルを消化し、架橋タンパク質を遊離させ、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)でタンパク質とその共有結合性PTMを分離することができました。電気泳動により、PTMを標的とする特異的抗体を用いてPTM結合DPCを検出および定量することができました。当初、この改良されたメソッドをDUSTアッセイと名付け、ユビキチル化およびSUMO化TOP-DPCの検出における堅牢性を強調しました²³。その後、ポリADP-リボース^{ポリマー20}に対する抗体を用いて、インビボでTOP1-DPCのADPリボシル化を定量的に評価するためにアッセイの使用を拡大しました。

ここでは、ユビキチル化、SUMO化、およびADPリボシル化DPCを検出および測定するアッセイの詳細なプロトコルを示し、阻害剤によって誘導される修飾TOP-DPCおよびFAによって誘導される非特異的/非酵素的DPC用に最適化されています。このアッセイでは、カオトロピック剤で細胞を溶解し、エタノールでDNAを沈殿させ、架橋タンパク質とその修飾因子をミクロコッカスヌクレアーゼで放出することにより、PTM結合DPCを単離します。それ以外のDNA結合タンパク質とそのPTMは、特異的抗体を用いたイムノブロッティングによって定量されます。このアッセイは、細胞が酵素的および非酵素的DPCの両方を修復する分子メカニズムを解明するための新しい道を開きます。 具体的には、TOP-DPCの分解と修復の制御に重要なPTMの誘導と動態の詳細な研究を可能にし、PTMを決定するE3リガーゼなどの新規因子の発見を可能にします。 これらの因子を標的とする阻害剤と同様に。TOP-DPC修復に関与するPTMの一部は、プラチナベースの薬物などの他の化学療法薬によって誘導されるDPCの修復に関与している可能性が高いため²²、このアッセイは、新薬の発見への応用や、治療計画を導くために患者細胞内のトポイソメラーゼ阻害剤またはプラチナベースの抗腫瘍薬との併用療法の合理的な最適化にも応用できる可能性があります。