الكشف الكمي عن الروابط المتقاطعة بين الحمض النووي والبروتين وتعديلاتها اللاحقة للترجمة
Summary
يسلط هذا البروتوكول الضوء على طريقة معدلة للكشف عن الوصلات المتقاطعة لبروتين الحمض النووي (DPCs) وقياسها كميا وتعديلاتها اللاحقة للترجمة (PTMs) ، بما في ذلك الوجود في كل مكان ، و SUMOylation ، و ADP-ribosylation التي تسببها مثبطات توبويزوميراز والفورمالديهايد ، مما يسمح بدراسة تكوين وإصلاح DPCs و PTMs الخاصة بها.
Abstract
الروابط المتقاطعة لبروتين الحمض النووي (DPCs) هي آفات الحمض النووي المتكررة والمنتشرة في كل مكان والضارة ، والتي تنشأ من تلف الحمض النووي الداخلي ، أو خلل في الإنزيم (topoisomerases ، methyltransferases ، إلخ) ، أو العوامل الخارجية مثل العلاج الكيميائي وعوامل التشابك. بمجرد تحفيز DPCs ، يتم على الفور اقتران عدة أنواع من التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) بها كآليات استجابة مبكرة. لقد ثبت أنه يمكن تعديل DPCs بواسطة ubiquitin ، ومعدل صغير يشبه ubiquitin (SUMO) ، و poly-ADP-ribose ، والتي تهيئ الركائز للإشارة إلى إنزيمات الإصلاح المخصصة لها ، وفي بعض الحالات ، تنسيق الإصلاح بطرق متسلسلة. نظرا لأن PTMs تظهر بسرعة ويمكن عكسها بشكل كبير ، فقد كان من الصعب عزل واكتشاف DPCs المترافقة PTM التي تظل عادة عند مستويات منخفضة. يظهر هنا مقايسة مناعية لتنقية واكتشاف DPCs في كل مكان و SUMOylated و ADP ريبوزيلات (توبويزوميراز DPCs التي يسببها الدواء و DPCs غير المحددة التي يسببها الألدهيد) في الجسم الحي. هذا الفحص مشتق من اختبار RADAR (النهج السريع لاستعادة تقريب الحمض النووي) الذي يستخدم لعزل الحمض النووي الجينومي الذي يحتوي على DPCs عن طريق ترسيب الإيثانول. بعد التطبيع وهضم النيوكلياز ، يتم الكشف عن PTMs من DPCs ، بما في ذلك الوجود في كل مكان ، SUMOylation ، و ADP-ribosylation ، عن طريق النشاف المناعي باستخدام الأجسام المضادة المقابلة لها. يمكن استخدام هذا الفحص القوي لتحديد وتوصيف الآليات الجزيئية الجديدة التي تعمل على إصلاح DPCs الأنزيمية وغير الأنزيمية ولديها القدرة على اكتشاف مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تستهدف عوامل محددة تنظم PTMs لإصلاح DPCs.
Introduction
يحدث تلف الحمض النووي الجينومي بسبب الاضمحلال التلقائي والتلف الداخلي والعوامل البيئية1. تشمل آفات الحمض النووي الناتجة القواعد التالفة ، وعدم التطابق ، وفواصل الشريط الفردي والمزدوج ، والوصلات المتقاطعة بين الخيوط وداخلها ، والارتباطات المتقاطعة لبروتين الحمض النووي (DPCs). يتكون DPC عندما يتم احتجاز بروتين مرتبط بالكروماتين على الحمض النووي من خلال الارتباط التساهمي. يتم تحفيز DPCs بواسطة آفات الحمض النووي الداخلية والمستقلبات التفاعلية ، وكذلك العوامل الخارجية مثل العلاج الكيميائي وعوامل التشابك ثنائية الوظيفة. في ظل ظروف معينة ، يمكن أن يؤدي ضعف الإنزيم أيضا إلى تكوين DPCs2. يؤدي الاختلاف الشاسع في محفزات DPC إلى اختلاف في هوية البروتين المرتبط تساهميا ، ومنطقة الكروموسوم حيث يتم تشكيل DPC ، ونوع بنية الحمض النووي المتشابك مع البروتين ، والخاصية الكيميائية للارتباط التساهمي بين البروتين والحمض النووي2،3،4.
بناء على طبيعتها الكيميائية ، يتم تصنيف DPCs بشكل عام إلى مجموعتين: DPCs الأنزيمية و DPCs غير الأنزيمية. تعمل بعض الإنزيمات مثل topoisomerases و glycosylases و methyl / acyltransferases عن طريق تكوين وسطاء تساهميين عكسيين للإنزيم والحمض النووي أثناء تفاعلاتهم التحفيزية العادية. هذه هي وسيطة إنزيم الحمض النووي قصيرة العمر ويمكن تحويلها إلى DPCs إنزيمية طويلة العمر عند محاصرتها بواسطة عوامل داخلية أو خارجية ، ولا سيما عن طريق العلاج الكيميائي3. تعد توبويزوميراز DPCs من بين DPCs الأنزيمية الأكثر شيوعا في الخلايا حقيقية النواة ، والتي يمكن توليدها بواسطة مثبطات توبويزوميراز المفيدة سريريا (توبوتيكان وإرينوتيكان لتوبويزوميراز I [TOP1] وإيتوبوسيد ودوكسوروبيسين لتوبويزوميراز II [TOP2]) وهي الآليات العلاجية الأساسية لهذه المثبطات 5,6. ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي (DNMT) 1 و 3A و 3B هي هدف 5-aza-2′-deoxycytidine (المعروف أيضا باسم decitabine) وتشكل DPCs عند التعرض للدواء7. تحفز العوامل التفاعلية ، وكذلك الأشعة فوق البنفسجية والإشعاعات المؤينة ، DPCs غير الأنزيمية عن طريق ربط البروتينات المتشابكة بشكل غير محدد بالحمض النووي. غالبا ما يتم إنشاء الألدهيدات التفاعلية مثل الأسيتالديهيد والفورمالديهايد (FA) كمنتجات ثانوية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، ومن بينها FA يتم إنتاجه بتركيزات ميكرومولار أثناء استقلاب الميثانول ، وبيروكسيد الدهون ، وإزالة ميثيل الهستون. أيضا ، FA هي مادة كيميائية ذات حجم كبير يتم تصنيعها في جميع أنحاء العالم ، والتي يتعرض لها الكثير من الناس بيئيا ومهنيا 8,9.
تعتبر كل من DPCs الأنزيمية وغير الأنزيمية شديدة السمية للخلايا حيث أن مكوناتها البروتينية الضخمة تعيق بكفاءة جميع العمليات القائمة على الكروماتين تقريبا ، بما في ذلك النسخ المتماثل والنسخ ، مما يؤدي إلى توقف دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج إذا تركت دون إصلاح. على مدى العقدين الماضيين ، تمت دراسة إصلاح DPCs بقوة ، وتم تحديد العديد من البروتينات / المسارات كعوامل رئيسية إما إصلاح DPCs مباشرة أو تعديل عمليات الإصلاح الخاصة بها. على سبيل المثال ، لقد ثبت جيدا أن التحلل البروتيني للجزء الأكبر من البروتين في DPC هو خطوة محورية لإصلاح DPC ، وأن التحلل البروتيني يمكن تحفيزه بواسطة البروتياز SPRTN 10،11،12،13،14 ، FAM111A15 ، GCNA 16،17 ، أو مجمع البروتيازوم26S 18،19،20،21،22,23,24,25,26,27 بطريقة تعتمد على نوع الخلية أو السياق الخلوي. اعتمد تحديد وتوصيف هذه البروتياز إلى حد كبير على المركب في الجسم الحي لمقايسة الإنزيم (ICE)28,29 والنهج السريع لمقايسة استعادة تقريب الحمض النووي (RADAR)30,31 ، وكلاهما يعزل جزيئات الحمض النووي وبروتيناتها المرتبطة تساهميا من البروتينات الخلوية الحرة للسماح بالكشف عن DPCs عن طريق لطخة الفتحة باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات المتشابكة. أيضا ، تم استخدام مقايسة التلوين المناعي للحمض النووي للأغاروز المحاصر (TARDIS) كوسيلة للكشف عن DPCs وقياسها على مستوى الخليةالواحدة 32. حاليا ، يختار الباحثون مقايسة الرادار على مقايسة ICE لقياس DPCs ، حيث يعتمد اختبار ICE على تنقية الأحماض النووية باستخدام الطرد المركزي الفائق لتدرج كلوريد السيزيوم ، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا للغاية ، في حين أن فحص الرادار يترسب الأحماض النووية باستخدام الإيثانول في غضون فترة أقصر بكثير.
في السنوات الأخيرة ، ظهرت أدلة متزايدة على أن العديد من التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) تشارك في الإشارة وتوظيف البروتيازالمستهدف DPC 3،33،34،35. على سبيل المثال ، تم العثور على كل من TOP1- و TOP2-DPCs مترافقة بواسطة معدل صغير يشبه يوبيكويتين (SUMO) -2/3 ثم SUMO-1 بواسطة SUMO E3 ligase PIAS4 ، بشكل مستقل عن تكرار الحمض النووي والنسخ. يبدو أن تعديلات SUMO المتسلسلة هي هدف لليوبيكويتين ، الذي يتم ترسبه في SUMOylated TOP-DPCs ويشكل سلاسل بوليمرية من خلال بقايا اللايسين 48 بواسطة يوبيكويتين ليجاز مستهدف من سومو يسمى RNF4. بعد ذلك ، يثير بوليمر ubiquitin إشارة إلى وتجنيد البروتيازوم 26S إلى TOP-DPCs23,36. تم مؤخرا عرض نفس مسار SUMO-ubiquitin للعمل على DNMT1-DPCs بالإضافة إلى مجمعات PARP-DNA لإصلاحها37,38. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن وجود في كل مكان مستقل عن SUMO بواسطة ubiquitin E3 ligase TRAIP إلى DPCs الأولية لتدهور البروتيازوم بطريقة مقترنة بالتكرار39. على غرار التدهور البروتيني ل TOP-DPCs ، يتطلب التحلل البروتيني ل DPCs الأنزيمية وغير الأنزيمية بواسطة الميتالوبروتياز SPRTN المقترن بالنسخ المتماثل أيضا وجود ركائز DPC في كل مكان كآلية لإشراك SPRTN40,41. يتطلب تحديد دور SUMOylation و ubiquitylation الكشف عن DPCs التي تم تمييزها بهذه PTMs. نظرا لأن مقايسة ICE الأصلية ومقايسة الرادار تعتمد على جهاز اللطخة / البقعة النقطية لقياس عينات الحمض النووي غير المهضومة ، فإن أيا من هذين الاختبارين غير قادر على حل وتصور أنواع DPC المترافقة PTM بأوزان جزيئية مختلفة. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بهضم عينات الحمض النووي بعد تنقيتها عن طريق ترسيب الإيثانول وتطبيع العينة باستخدام نوكلياز المكورات الدقيقة ، وهو DNA و RNA endo-exonuclease لإطلاق البروتينات المتشابكة ، مما مكننا من حل البروتينات وكذلك PTMs التساهمية مع دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE). سمح لنا الرحلان الكهربائي باكتشاف وقياس DPCs المترافقة PTM باستخدام أجسام مضادة محددة تستهدف PTMs. أطلقنا في البداية على هذه الطريقة المحسنة اسم اختبار DUST ، لتسليط الضوء على قوتها في الكشف عن TOP-DPCs في كل مكان و SUMOylated23. في وقت لاحق ، قمنا بتوسيع استخدام الفحص لتقييم ADP-ribosylation كميا ل TOP1-DPCs في الجسم الحي ، باستخدام الأجسام المضادة ضد بوليمرات poly-ADP-ribose20.
يظهر هنا بروتوكول مفصل للفحص الذي يكتشف ويقيس DPCs في كل مكان ، SUMOylated ، و ADP-ribosylated ، والذي تم تحسينه ل TOP-DPCs المعدلة التي تسببها مثبطاتها و DPCs غير المحددة / غير الأنزيمية التي يسببها FA. يعزل هذا الفحص DPCs المترافقة PTM عن طريق تحلل الخلايا بعامل شاوتروبيك ، وترسيب الحمض النووي بالإيثانول ، وإطلاق البروتينات المتشابكة ومعدلاتها مع نوكلياز المكورات الدقيقة. يتم قياس البروتينات المرتبطة بالحمض النووي و PTMs الخاصة بها عن طريق النشاف المناعي باستخدام أجسام مضادة محددة. يمهد هذا الفحص طريقا جديدا لتوضيح الآليات الجزيئية التي تقوم الخلية من خلالها بإصلاح كل من DPCs الأنزيمية وغير الأنزيمية. على وجه التحديد ، فإنه يتيح إجراء دراسات مفصلة عن تحريض وحركية PTMs المهمة لتنظيم تدهور وإصلاح TOP-DPC ، وبالتالي يسمح باكتشاف عوامل جديدة مثل أربطة E3 التي تملي PTMs ، وكذلك مثبطات تستهدف هذه العوامل. نظرا لأن بعض PTMs المسؤولة عن إصلاح TOP-DPC من المحتمل أن تشارك في إصلاح DPCs التي تسببها العلاجات الكيميائية الأخرى ، مثل الأدوية القائمة على البلاتين22 ، فإن هذا الاختبار لديه أيضا إمكانية التطبيق لاكتشاف أدوية جديدة والتحسين العقلاني للعلاجات التوافقية مع مثبطات توبويزوميراز أو مضادات الأورام القائمة على البلاتين في خلايا المريض لتوجيه أنظمة العلاج.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسمح الطريقة الموصوفة بقياس الروابط المتقاطعة لبروتين الحمض النووي الأنزيمي وغير الأنزيمي في خلايا الثدييات وهي الطريقة المناسبة الوحيدة لدراسة انتشارها في كل مكان ، و SUMOylation ، و ADP-ribosylation. يسمح النشاف بالفتحات بعد فحص ICE أو RADAR بالكشف السريع عن DPCs الأنزيمية المحددة مثل TOP-DPCs باستخدام أجسامها المضادة. ومع ذلك ، فإن التحذير من هذه الطريقة هو عدم قدرتها على فصل البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة ، مما يجعل من المستحيل تحديد أحجام DPCs المترافقة PTM. تحل الطريقة الموصوفة المشكلة عن طريق إطلاق بروتينات متشابكة مع نوكلياز المكورات الدقيقة ، والتي تحلل الحمض النووي إلى قليل النوكليوتيدات مع الفوسفات الطرفي 3’، مما يسمح بالفصل الكامل للبروتينات (المترافقة مع قليل النيوكليوتيدات) بواسطة SDS-PAGE. وبالتالي ، يمكن تصور DPCs المعدلة باستخدام مونومرات ubiquitin أو SUMO أو ADP-ribose والبوليمرات ذات الأحجام المختلفة وقياسها من خلال الأجسام المضادة التي تستهدف هذه PTMs ، مما يتيح إجراء فحص مفصل لتكوينها وحركيتها. لضمان التكاثر وحساب الأهمية الإحصائية ، يلزم وجود نسخ بيولوجية مكررة للتجارب.
واحدة من أكثر المشاكل شيوعا في هذا الفحص هي انخفاض إنتاج الحمض النووي بعد ترسيب الإيثانول. من ناحية ، يمكن زيادة إنتاج الحمض النووي مع المزيد من المواد الأولية (الخلايا). من ناحية أخرى ، يمكن أن يؤدي احتضان الخلية إلى تحلل الإيثانول في صفيحة مسطحة بدلا من أنبوب إيبندورف إلى تحسين تجميع جزيئات الحمض النووي بشكل ملحوظ وبالتالي تسهيل ترسيبها. قد تشير الإشارات غير المحددة التي لوحظت في العينات بدون علاجات دوائية إلى تلوث البروتين غير التساهمي. إذا كانت هذه هي الحالة, يمكن للمرء أن ينظر في غسل الكريات الحمض النووي مع عازلة عالية الملح لإزالة الملوثات قبل صوتنة. يوصى أيضا بتدوير عينات الحمض النووي بعد صوتنة وهضم نوكلياز المكورات الدقيقة والتخلص من أي غير قابل للذوبان. في حالة ضعف الإشارة أو عدم وجود إشارة ، يمكن محاولة العديد من الحلول المحتملة. أولا ، يمكن للمرء زيادة كمية تحميل الحمض النووي ل SDS-PAGE و immunoblotting. لجعل أنواع DPC SUMOylated و dubiquitylated قابلة للكشف ، يوصى بتحميل ما لا يقل عن 4 ميكروغرام من الحمض النووي على الجل. ثانيا ، يمكن للمرء زيادة تركيزات الدواء للحث على مستويات أعلى من DPCs و PTMs المرتبطة بها. ثالثا ، يقترح احتضان البقع بالأجسام المضادة الأولية ليوم آخر إذا بدت العصابات / اللطاخات ضعيفة. يمكن للحضانة لمدة يومين أن تحفز الإشارة بشكل كبير وبالتالي تقلل من التباين البيولوجي من التجارب المستقلة23. يؤدي تجريد الغشاء لإعادة التلوين حتما إلى فقدان كمية معينة من أنواع DPC المترافقة PTM الموجودة بالفعل بوفرة منخفضة. لذلك ، يوصى بشدة بتشغيل مواد هلامية منفصلة للكشف عن يوبيكويتين وسومو بدلا من إعادة فحص لطخة واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب غسل كريات الحمض النووي بنسبة 75٪ من الإيثانول لإزالة الحمض النووي المتبقي المحتوي على ملح الجوانيدين قبل الذوبان في H2O أو أي مذيبات أخرى ، مما يؤدي إلى تبلور العينة بعد إضافة مخزن تحميل Laemmli.
يعد سير عمل الطريقة الموصوفة أكثر كفاءة من حيث الوقت مقارنة بمقايسة ICE المرهقة ، حيث تعتمد على ترسيب الإيثانول السريع بدلا من الطرد المركزي الفائق لكلوريد السيزيوم الذي يستغرق وقتا طويلا لعزل الحمض النووي الجينومي. بسعر ، تجلب التنقية القائمة على الإيثانول كمية منخفضة من ملوثات البروتين التي عادة ما تكون ضئيلة للكشف المناعي. ومع ذلك ، عندما يتعلق الأمر بالدراسات التحليلية ، مثل التحليل البروتيني القائم على قياس الطيف الكتلي أو تسلسل الجيل التالي الذي يتطلب الدقة والدقة ، لا يزال الطرد المركزي المتدرج لكثافة كلوريد السيزيوم نهجا أكثر موثوقية لعزل الحمض النووي النقي عالي الوفرة. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تنميط مواقع التعديل على البروتينات المتشابكة وتحديد أنواع الارتباط من poly-ubiquitylation و poly-SUMOylation باستخدام الطرق المناسبة القائمة على قياس الطيف الكتلي.
وتجدر الإشارة إلى أن هذا الفحص يسمح بتحديد وتوصيف العوامل التي تنظم PTMs لإصلاح DPCs. على سبيل المثال ، تعد طرق الفحص عالية الإنتاجية غير المتحيزة (تداخل الحمض النووي الريبي وكريسبر) أدوات قوية لاكتشاف أربطة يوبيكويتين E3 ، وأربطة SUMO E3 ، والعوامل المساعدة المرتبطة بها التي تخفف من السمية الخلوية لمحفزات DPC. تتيح الطريقة الموصوفة التحقق الجزيئي من صحة هذه البروتينات من خلال تحديد ما إذا كانت تساعد الخلايا على البقاء على قيد الحياة من محفزات DPC عن طريق إصلاح DPCs. يمكن أيضا التحقق من صحة مثبطات الجزيئات الصغيرة الجديدة التي تستهدف هذه البروتينات التي تم تحديدها ، على سبيل المثال ، عن طريق الفحص الافتراضي ، باستخدام هذا البروتوكول. بالنظر إلى أن مثبطات توبويزوميراز هي من بين أكثر العلاجات الكيميائية الموصوفة ، يمكن تطوير هذا الفحص القوي كأداة لتطوير الأدوية التي تتآزر مع مثبطات توبويزوميراز السريرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مركز المعهد الوطني للسرطان لأبحاث السرطان جائزة التميز في انتقال أبحاث ما بعد الدكتوراه.
Materials
| 10x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 70011069 | |
| 4–20% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561096 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| AcquaStain (coomassie blue) | Bulldog Bio | AS001000 | |
| anti-dsDNA (mouse monoclonal) | Abcam | 27156 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| anti-PAR (mouse monoclonal) | R&D systems | 4335-MC-100 | 1: 500 dilution is recommended |
| anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4940 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 4971 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-TOP1 (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 556597 | 1: 500 dilution is recommended |
| anti-TOP2α (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-365799 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-TOP2β (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-25330 | 1: 250 dilution is recommended |
| anti-ubiquitin (mouse monoclonal) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8017 | 1: 100 dilution is recommended |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | Used for micrococcal nuclease digestion |
| Camptothecin | Sigma-Aldrich | PHL89593 | |
| ChemiDo MP imaging system | Bio-Rad | 12003154 | |
| Disodium phosphate | Sigma-Aldrich | 5438380100 | Used to make sodium phosphate buffer |
| DNAzol | Thermo Fisher | 10503027 | |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher | R0861 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium | Sigma-Aldrich | 11965084 | |
| Ethyl alcohol, 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Etoposide | Sigma-Aldrich | 1268808 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 47608 | |
| Graphpad Prism Software | GraphStats | Prism 9.0.0 | |
| HRP-linked Mouse IgG | Cytiva | NA931 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| HRP-linked Rabbit IgG | Cytiva | NA934 | 1: 5,000 dilution is recommended |
| ImageJ Software | NIH, USA | ImageJ 1.53e | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
| Maximum sensitivity ECL substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| Micrococcal nuclease | New England BioLabs | M0247S | |
| Monosodium phosphate | Sigma-Aldrich | S3139 | Used to make sodium phosphate buffer |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher | 23030 | DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor |
| Nitrocellulose membrane, 0.45 µm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Non-fat dry milk | Bio-Rad | 1706404XTU | |
| PDD00017273 | Selleckchem | S8862 | Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher | 78430 | |
| Q700 sonicator | Qsonica | Q700-110 | |
| Ready-to-assemble PVDF transfer kit | Bio-Rad | 1704274 | |
| Slot-blot apparatus | Bio-Rad | 1706542 | |
| Slot-blot filter paper | Bio-Rad | 1620161 | |
| Trans-Blot turbo transfer system | Bio-Rad | 1704150 | |
| Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer | Bio-Rad | 1610732 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | |
| Vertical electrophoresis cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Klages-Mundt, N. L., Li, L. Formation and repair of DNA-protein crosslink damage. Science China. Life Sciences. 60 (10), 1065-1076 (2017).
- Weickert, P., Stingele, J. DNA-protein crosslinks and their resolution. Annual Review of Biochemistry. 91, 157-181 (2022).
- Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein cross-links: formation, structural identities, and biological outcomes. Accounts of Chemical Research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
- Pommier, Y., Nussenzweig, A., Takeda, S., Austin, C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (6), 407-427 (2022).
- Pommier, Y., Sun, Y., Huang, S. N., Nitiss, J. L. Roles of eukaryotic topoisomerases in transcription, replication and genomic stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 703-721 (2016).
- Ruggiano, A., Ramadan, K. DNA-protein crosslink proteases in genome stability. Communications Biology. 4 (1), 11 (2021).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Moretton, A., Loizou, J. I. Interplay between cellular metabolism and the DNA damage response in cancer. Cancers. 12 (8), 2051 (2020).
- Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
- Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4564-4576 (2017).
- Stingele, J., et al. Mechanism and regulation of DNA-protein crosslink repair by the DNA-dependent metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
- Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 orchestrates replication-coupled DNA-protein crosslink repair. Molecular Cell. 64 (4), 704-719 (2016).
- Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
- Kojima, Y., et al. FAM111A protects replication forks from protein obstacles via its trypsin-like domain. Nature Communications. 11 (1), 1318 (2020).
- Dokshin, G. A., et al. GCNA interacts with spartan and topoisomerase II to regulate genome stability. Developmental Cell. 52 (1), 53-68 (2020).
- Borgermann, N., et al. SUMOylation promotes protective responses to DNA-protein crosslinks. The EMBO Journal. 38 (8), e101496 (2019).
- Sun, Y., Zhang, Y., Schultz, C. W., Pommier, Y., Thomas, A. CDK7 inhibition synergizes with topoisomerase I inhibition in small cell lung cancer cells by inducing ubiquitin-mediated proteolysis of RNA polymerase II. Molecular Cancer Therapeutics. 21 (9), 1430-1438 (2022).
- Sun, Y., et al. Requirements for MRN endonuclease processing of topoisomerase II-mediated DNA damage in mammalian cells. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1007064 (2022).
- Sun, Y., et al. PARylation prevents the proteasomal degradation of topoisomerase I DNA-protein crosslinks and induces their deubiquitylation. Nature Communications. 12 (1), 5010 (2021).
- Sun, Y., et al. Excision repair of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC). DNA Repair. 89, 102837 (2020).
- Sun, Y., Saha, L. K., Saha, S., Jo, U., Pommier, Y. Debulking of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC) by the proteasome, non-proteasomal and non-proteolytic pathways. DNA Repair. 94, 102926 (2020).
- Sun, Y., et al. A conserved SUMO pathway repairs topoisomerase DNA-protein cross-links by engaging ubiquitin-mediated proteasomal degradation. Science Advances. 6 (46), (2020).
- Saha, S., et al. DNA and RNA cleavage complexes and repair pathway for TOP3B RNA- and DNA-protein crosslinks. Cell Reports. 33 (13), 108569 (2020).
- Swan, R. L., Cowell, I. G., Austin, C. A. Mechanisms to repair stalled topoisomerase II-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 101 (1), 24-32 (2022).
- Swan, R. L., Poh, L. L. K., Cowell, I. G., Austin, C. A. Small molecule inhibitors confirm ubiquitin-dependent removal of TOP2-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 98 (3), 222-233 (2020).
- Sciascia, N., et al. Suppressing proteasome mediated processing of topoisomerase II DNA-protein complexes preserves genome integrity. eLife. 9, e53447 (2020).
- Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 1703, 283-299 (2018).
- Subramanian, D., Furbee, C. S., Muller, M. T. ICE bioassay. Isolating in vivo complexes of enzyme to DNA. Methods in Molecular Biology. 95, 137-147 (2001).
- Nitiss, J. L., Kiianitsa, K., Sun, Y., Nitiss, K. C., Maizels, N. Topoisomerase assays. Current Protocols. 1 (10), e250 (2021).
- Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
- Cowell, I. G., Tilby, M. J., Austin, C. A. An overview of the visualisation and quantitation of low and high MW DNA adducts using the trapped in agarose DNA immunostaining (TARDIS) assay. Mutagenesis. 26 (2), 253-260 (2011).
- Leng, X., Duxin, J. P. Targeting DNA-protein crosslinks via post-translational modifications. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 944775 (2022).
- Kuhbacher, U., Duxin, J. P. How to fix DNA-protein crosslinks. DNA Repair. 94, 102924 (2020).
- Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. Mechanisms of DNA-protein crosslink repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 563-573 (2017).
- Sun, Y., Nitiss, J. L., Pommier, Y. SUMO: A Swiss army knife for eukaryotic topoisomerases. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 871161 (2022).
- Krastev, D. B., et al. The ubiquitin-dependent ATPase p97 removes cytotoxic trapped PARP1 from chromatin. Nature Cell Biology. 24 (1), 62-73 (2022).
- Liu, J. C. Y., et al. Mechanism and function of DNA replication-independent DNA-protein crosslink repair via the SUMO-RNF4 pathway. The EMBO Journal. 40 (18), e107413 (2021).
- Larsen, N. B., et al. Replication-coupled DNA-protein crosslink repair by SPRTN and the proteasome in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 73 (3), 574-588 (2019).
- Zhao, S., et al. A ubiquitin switch controls autocatalytic inactivation of the DNA-protein crosslink repair protease SPRTN. Nucleic Acids Research. 49 (2), 902-915 (2021).
- Ruggiano, A., et al. The protease SPRTN and SUMOylation coordinate DNA-protein crosslink repair to prevent genome instability. Cell Reports. 37 (10), 110080 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
