JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/65315
1Developmental Therapeutics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute,National Institutes of Health

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש שיטה שונה לזיהוי וכימות של קישורי DNA-חלבון (DPC) והשינויים שלאחר התרגום שלהם (PTM), כולל יוביקוויטילציה, SUMOylation ו-ADP-ריבוסילציה המושרה על ידי מעכבי טופואיזומראז ועל ידי פורמלדהיד, ובכך מאפשר לחקור היווצרות ותיקון של DPCs וה-PTM שלהם.

Abstract

קשרי DNA-חלבון (DPC) הם נגעי DNA תכופים, נפוצים ומזיקים, הנובעים מנזק לדנ”א אנדוגני, אנזים (טופואיזומראזות, מתילטרנספראזות וכו ‘) שאינם מתפקדים, או סוכנים אקסוגניים כגון כימותרפיות וחומרים צולבים. ברגע ש-DPC מושרה, מספר סוגים של שינויים פוסט-תרגומיים (PTM) מצומדים אליהם מיד כמנגנוני תגובה מוקדמים. הוכח כי DPCs יכולים להשתנות על ידי יוביקוויטין, משנה קטנה דמוית יוביקוויטין (SUMO), ופולי-ADP-ריבוז, אשר מכוונים את הסובסטרטים לאותת על אנזימי התיקון הייעודיים שלהם, ובמקרים מסוימים, לתאם את התיקון באופנים עוקבים. מכיוון ש-PTM מתרחשים במהירות והם הפיכים מאוד, היה מאתגר לבודד ולזהות DPCs מצומדים של PTM שבדרך כלל נשארים ברמות נמוכות. מוצג כאן מבחן חיסוני לטיהור וזיהוי כמותי של DPCs יוביקוויטילציה, SUMOylated ו- ADP-ribosylated (DPCs טופואיזומראז המושרה על ידי תרופות ו- DPC לא ספציפי המושרה על ידי אלדהיד) in vivo. בדיקה זו נגזרת מבדיקת המכ”ם (גישה מהירה לשחזור DNA adduct) המשמשת לבידוד DNA גנומי המכיל DPC על ידי משקעי אתנול. לאחר נורמליזציה ועיכול נוקלאז, PTMs של DPCs, כולל ubiquitylation, SUMOylation, ו- ADP-ribosylation, מזוהים על ידי immunoblotting באמצעות נוגדנים המתאימים שלהם. ניתן להשתמש בבדיקה חזקה זו כדי לזהות ולאפיין מנגנונים מולקולריים חדשים המתקנים DPC אנזימטיים ולא אנזימטיים, ויש לה פוטנציאל לגלות מעכבי מולקולות קטנות המכוונים לגורמים ספציפיים המווסתים PTM לתיקון DPC.

Introduction

נזק גנומי לדנ”א מתרחש עקב ריקבון ספונטני, נזק פנימי וגורמים סביבתיים1. נגעי הדנ”א המתקבלים כוללים בסיסים פגומים, אי-התאמות, שברים חד-גדיליים וכפולים, קישורים בין-גדיליים ותוך-גדיליים וקישורים צולבים של DNA-חלבון (DPC). DPC נוצר כאשר חלבון הקשור לכרומטין, נלכד בדנ”א באמצעות קישור קוולנטי. DPCs נגרמים על ידי נגעי DNA אנדוגניים ומטבוליטים תגובתיים, כמו גם סוכנים אקסוגניים כגון כימותרפיות וחומרים צולבים דו-תפקודיים. בנסיבות מסוימות, תפקוד לקוי של אנזימים יכול גם להוביל להיווצרות DPCs2. ההבדל העצום בהשראות DPC גורם להבדל בזהות החלבון הקשור לקוולנטיות, באזור הכרומוזומים שבו נוצר ה-DPC, בסוג המבנה של הדנ”א המוצלב עם החלבון, ובתכונה הכימית של הקישור הקוולנטי בין החלבון לדנ”א 2,3,4.

בהתבסס על טבעם הכימי, DPCs מסווגים בדרך כלל לשתי קבוצות: DPCs אנזימטיים ו- DPC שאינם אנזימטיים. אנזימים מסוימים כגון topoisomerases, glycosylases, ו methyl/acyltransferases לפעול על ידי יצירת ביניים קוולנטיים אנזים-DNA הפיך במהלך התגובות הקטליטיות. אלה הם מתווכי אנזים-דנ”א קצרי חיים וניתן להמיר אותם ל-DPCs אנזימטיים ארוכי חיים עם לכידתם על ידי חומרים אנדוגניים או אקסוגניים, במיוחד על ידי כימותרפיה3. Topoisomerase DPCs הם בין DPCs האנזימטיים השכיחים ביותר בתאים אאוקריוטים, אשר יכולים להיווצר על ידי מעכבי topoisomerase שימושיים קלינית (topotecan ו irinotecan עבור topoisomerase I [TOP1] ו etoposide ו doxorubicin עבור topoisomerase II [TOP2]) והם המנגנונים הטיפוליים העיקריים של מעכבים אלה 5,6. DNA methyltransferases (DNMT) 1, 3A ו- 3B הם המטרה של 5-aza-2′-deoxycytidine (הידוע גם בשם decitabine) ויוצרים DPC עם חשיפה לתרופה7. חומרים תגובתיים, כמו גם אור אולטרה סגול וקרינה מייננת, גורמים ל- DPC לא אנזימטי על ידי הצלבה לא ספציפית של חלבונים ל- DNA. אלדהידים תגובתיים כגון אצטאלדהיד ופורמלדהיד (FA) נוצרים לעתים קרובות כתוצרי לוואי של מטבוליזם תאי, ביניהם FA מיוצר בריכוזים מיקרומולאריים במהלך מטבוליזם מתנול, חמצון שומנים ודה-מתילציה של היסטון. כמו כן, FA הוא כימיקל ייצור בנפח גבוה המיוצר ברחבי העולם, אליו אנשים רבים נחשפים הן מבחינה סביבתית והן מבחינה תעסוקתית 8,9.

הן DPC אנזימטי והן לא אנזימטי רעילים מאוד לתאים מכיוון שמרכיבי החלבון המגושמים שלהם מעכבים ביעילות כמעט את כל התהליכים מבוססי הכרומטין, כולל שכפול ושעתוק, מה שמוביל למעצר מחזור התא ולאפופטוזיס אם אינם מתוקנים. במהלך שני העשורים האחרונים, התיקון של DPCs נחקר במרץ, וכמה חלבונים/מסלולים זוהו כגורמי מפתח שמתקנים ישירות DPCs או מווסתים את תהליכי התיקון שלהם. לדוגמה, הוכח היטב כי פרוטאוליזה של חלבון בתפזורת של DPC היא שלב מכריע של תיקון DPC, וכי פרוטאוליזה יכולה להיות מזורזת על ידי פרוטאזות SPRTN 10,11,12,13,14, FAM111A15, GCNA 16,17, או קומפלקס פרוטאזום26S 18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27 באופן תלוי סוג תא או הקשר סלולרי. זיהוי ואפיון של פרוטאזות אלה הסתמכו במידה רבה על קומפלקס in vivo של בדיקת האנזים (ICE)28,29 ועל הגישה המהירה לבדיקת DNA adduct recovery (מכ”ם)30,31, שתיהן מבודדות מולקולות DNA ואת החלבונים הקוולנטיים שלהן מחלבונים תאיים חופשיים כדי לאפשר זיהוי של DPC על ידי חריץ באמצעות נוגדנים המכוונים לחלבונים הצולבים. כמו כן, בדיקת TARDIS (ראשי תיבות של Agarose DNA immunostaining) שימשה כאמצעי לאיתור וכימות DPC ברמת התא הבודד32. כיום, החוקרים בוחרים בבדיקת המכ”ם על פני בדיקת ICE למדידת DPC, שכן בדיקת ICE מסתמכת על טיהור חומצות גרעין באמצעות צזיום כלוריד הדרגתי אולטרה-צנטריפוגה, דבר הגוזל זמן רב, בעוד שבדיקת המכ”ם מזרזת חומצות גרעין המשתמשות באתנול תוך פרק זמן קצר בהרבה.

בשנים האחרונות התגלו ראיות מצטברות לכך ששינויים רבים לאחר התרגום (PTM) מעורבים באיתות ובגיוס של פרוטאזות ממוקדות DPC 3,33,34,35. לדוגמה, הן TOP1- והן TOP2-DPCs נמצאו מצומדים על ידי משנה קטנה דמוית יוביקוויטין (SUMO)-2/3 ולאחר מכן SUMO-1 על ידי SUMO E3 ligase PIAS4, ללא תלות בשכפול ושעתוק DNA. השינויים הסדרתיים ב-SUMO נראים כמטרה של יוביקוויטין, אשר מופקד ב-SUMOylated TOP-DPCs ויוצר שרשראות פולימריות דרך שאריות הליזין 48 שלו על ידי ליגאז יוביקוויטין ממוקד SUMO המכונה RNF4. לאחר מכן, פולימר היוביקוויטין מעורר אות ומגייס את פרוטאזום 26S ל-TOP-DPCs23,36. אותו מסלול SUMO-ubiquitin הוכח לאחרונה לפעול על DNMT1-DPCs, כמו גם קומפלקסים PARP-DNA עבור תיקון שלהם37,38. בנוסף, יוביקוויטילציה בלתי תלויה ב-SUMO על ידי יוביקוויטין E3 ליגאז TRAIP דווחה ל-DPCs ראשוניים עבור פירוק פרוטאזומלי באופן מצומד שכפול39. בדומה לפירוק פרוטאזומלי של TOP-DPCs, פרוטאוליזה של DPCs אנזימטיים ולא אנזימטיים על ידי Metalloprotease SPRTN מצומדת לשכפול דורשת גם יוביקוויטילציה של מצעי DPC כמנגנון להפעלת SPRTN40,41. תיחום התפקיד של SUMOylation ו ubiquitylation דורש זיהוי של DPCs המסומנים עם PTM אלה. מכיוון שבדיקת ICE המקורית ובדיקת המכ”ם מסתמכות על מנגנון חריץ / כתם נקודה כדי למדוד דגימות DNA לא מעוכלות, אף אחת משתי הבדיקות הללו אינה מסוגלת לפתור ולדמיין מיני DPC מצומדים של PTM עם משקלים מולקולריים שונים. כדי להתגבר על בעיה זו, עיכלנו את דגימות הדנ”א לאחר טיהורן על ידי משקעי אתנול ונורמליזציה של הדגימות עם נוקלאז מיקרוקוקלי, דנ”א ורנ”א אנדו-אקסונוקלאז כדי לשחרר את החלבונים הצולבים, מה שאפשר לנו לפתור את החלבונים כמו גם את ה-PTM הקוולנטי שלהם עם אלקטרופורזה של ג’ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל-סולפט (SDS-PAGE). האלקטרופורזה אפשרה לנו לזהות ולכמת DPCs מצומדים ל-PTM באמצעות נוגדנים ספציפיים המכוונים ל-PTM. בתחילה קראנו לשיטה משופרת זו DUST assay, כדי להדגיש את החוסן שלה בזיהוי של ubiquitylated ו- SUMOylated TOP-DPCs23. מאוחר יותר, הרחבנו את השימוש בבדיקה כדי להעריך כמותית ADP-ריבוסילציה של TOP1-DPCs in vivo, באמצעות נוגדנים נגד פולימרים poly-ADP-ריבוז20.

מוצג כאן פרוטוקול מפורט לבדיקה המזהה ומודד DPCs ubiquitylated, SUMOylated ו- ADP-ribosylated, אשר הותאם עבור TOP-DPCs שעברו שינוי המושרים על ידי המעכבים שלהם ו- DPCs לא ספציפיים/לא אנזימטיים המושרים על ידי FA. בדיקה זו מבודדת DPC מצומד PTM על ידי שכיבת תאים עם סוכן כאוטי, זירוז DNA עם אתנול, ושחרור חלבונים מוצלבים אחרת ומשנים שלהם עם נוקלאז מיקרוקוקלי. החלבונים הקשורים לדנ”א וה-PTM שלהם מכומתים על ידי אימונובלוטציה באמצעות נוגדנים ספציפיים. בדיקה זו סוללת דרך חדשה להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם התא מתקן DPC אנזימטי ולא אנזימטי. באופן ספציפי, הוא מאפשר מחקרים מפורטים של אינדוקציה וקינטיקה של PTMs החשובים לוויסות פירוק ותיקון TOP-DPC, ובכך מאפשר גילוי של גורמים חדשים כגון ליגאזות E3 המכתיבות את ה- PTM, כמו גם מעכבים המכוונים לגורמים אלה. מכיוון שחלק מה- PTMs האחראים לתיקון TOP-DPC מעורבים ככל הנראה בתיקון DPC המושרה על ידי כימותרפיות אחרות, כגון תרופות מבוססות פלטינה22, לבדיקה זו יש גם פוטנציאל ליישום לגילוי תרופות חדשות ואופטימיזציה רציונלית של טיפולים קומבינטוריים עם מעכבי טופואיזומראז או אנטינאופלסטיק מבוסס פלטינה בתאי המטופל כדי להנחות משטרי טיפול.

Protocol

1. תרבית תאים וטיפול תרופתי בכליה העוברית האנושית 293 (HEK293) קו תאים הכינו מדיום תרבית, מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM), בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, 1% 2 מילימטר L-גלוטמין, ו-100 יחידות/מ”ל פניצילין-סטרפטומיצין. זרע 1 x 10 6 תאים בצלחת 60 מ”מ או צלחת6 בארות לכל תנאי טיפול בתוספת בקרה. למחרת, טפל בתאים עם השראות DPC לפי בחירה.כדי לגרום ל-TOP1-DPCs וליוביקוויטילציה ול-SUMOylation שלהם, הוסף את המעכב TOP1 camptothecin ב-20 מיקרומטר לתאים ואסוף את התאים ב-20, 60 ו-180 דקות. כדי לגרום ל- TOP2α ו- β-DPCs והיוביקוויטילציה וה- SUMOylation שלהם, חשוף את התאים להוסיף את מעכב TOP2 אטופוסיד ב -200 מיקרומטר לתאים ולאסוף את התאים ב -20, 60 ו -180 דקות. כדי לגרום ל-DPCs לא-אנזימטיים וליוביקוויטילציה ול-SUMOylation שלהם, יש להוסיף FA ב-1 מילימטר ולאסוף את התאים שעתיים לאחר החשיפה. כדי לגרום ל-PARylation של TOP1-DPCs, יש לטפל מראש בתאים למשך שעה אחת כדי לחסום דה-פרילציה עם מעכב פולי(ADP-ריבוז) גליקוהידרולאז (PARG) PDD00017273 ב-10 מיקרומטר, ולאחר מכן טיפול משותף עם קמפטוטצין של 20 מיקרומטר למשך 20, 60 ו-180 דקות. 2. בידוד ונורמליזציה של DNA המכיל חלבונים צולבים יש לשאוף במהירות את המדיה עם פיפטת יניקה לאחר הטיפול ולשטוף את התאים במי מלח חוצצים 1x פוספט קר כקרח (PBS). מיד lyse את התאים 600 μL של מגיב DNAzol המכיל 1x מעכב קוקטייל פרוטאז, 1 mM dithiothreitol (DTT), ו 20 mM N-ethylmaleimide (מעכב של deSUMOylating ו deubiquitylating אנזימים). לאט לאט להסעיר את הצלחת על פלטפורמה רוטטת במשך 10 דקות ב 4 ° C. הוסף 1/2 נפח של אתנול קר 100% (0.3 מ”ל) ישירות לצלחת וחזור על שלב 2.2 עד שמצטבר חומצת גרעין אטום הופך גלוי. העבר את הליזט של התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל וחשף את הצינור לצנטריפוגה במהירות מרבית (20,000 x גרם) למשך 15 דקות ב -4 ° C כדי לזרז את חומצת הגרעין ואת החלבונים הצולבים שלה. שאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה יניקה ושטפו את גלולת חומצת הגרעין ב 1 מ”ל של 75% אתנול ואחריו 2 דקות של 20,000 x גרם צנטריפוגה ב 4 ° C. שאפו את הסופר-נטנט, סובבו מטה באותה מהירות, והוציאו את שאריות הנוזל באמצעות פיפטה P20. יבשו את הגלולה באוויר למשך 5 דקות. ממיסים במהירות את גלולת חומצת הגרעין ב 0.1 מ”ל של ddH2O. להשהות את הגלולה על ידי פיפטינג חוזר ואז לדגור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד שהגלולה מתנפחת לפחות פי שלושה (כ -30 דקות). סוניק את הדגימות עם בדיקה מעבד קולי ב 30% משרעת עבור 10 שניות כדי להמיס את הגלולה במלואה. שלב אופציונלי: יש לטפל בדגימות עם תערובת RNase A/T1 (10 מיקרוגרם של RNase A ו-25 U של RNase T1) ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות. הוסף 1/10 נפח של 3 M נתרן אצטט ושני נפחים של 100% אתנול קר כקרח לצינור, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך 10 דקות כדי לאחזר את ה- DNA. הסר את supernatant ולהמיס את ה- DNA המואץ ב 0.1 מ”ל של ddH2O. שלב אופציונלי: צנטריפוגו את הדגימה למשך 5 דקות במהירות של 20,000 x גרם והעבירו את הסופרנאטנט לצינור חדש. כמת את ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרומטר אולטרה סגול נראה (UV-Vis). תפוקת הדנ”א הטיפוסית היא בסביבות 600-800 ננוגרם/מיקרוליטר. יש להפחית את יחס A260/A280 מ-2.0-2.1 ל-1.8-1.9 לאחר הסרת RNA. התאם את ריכוז הדנ”א ל-400-500 ננוגרם/מיקרוליטר ב-0.12 מ”ל של ddH 2 O. העבר 20 מיקרו-ליטר מהדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש כבקרת טעינת DNA לא מעוכל (עיין בשלב2.4). כדי לעכל את הדנ”א המומס ב-100 μL הנותרים של ddH2 O, יש להוסיף 2,000 יחידות ג’ל של נוקלאז מיקרוקוקלי יחד עם נפח של 1/10 (~11 μL) של חיץ תגובת סידן מיקרוקוקלי פי 10 לדגימה. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. 3. כתם מערבי של דגימות דנ”א מעוכלות הוסף מאגר דגימה 4x Laemmli, ולאחר מכן להרתיח את הדגימה במשך 5 דקות. טען 5-6 מיקרוגרם של דגימה מעוכלת (~ 15 μL) על ג’ל פוליאקרילאמיד 4%-20%, ולאחר מכן SDS-PAGE42 כדי לפתור DPC מצומד ללא שינוי ו- PTM. כדי לזהות מיני DPC לא אנזימטיים הנגרמים על ידי FA, דגרו על הג’ל עם כתם כחול קומאסי למשך הלילה בטמפרטורת החדר. לשטוף את הג’ל עם ddH 2 O במשך2שעות ולרכוש תמונה באמצעות מערכת הדמיה. מעבירים את הג’ל ודגרים על הקרומים למשך הלילה ב-4°C עם דילול מתאים של נוגדן ראשוני בחיץ חוסם.כדי לזהות יוביקוויטילציה, בצע דילול של 1:100 של נוגדן אנטי-יוביקוויטין. כדי לזהות שינוי SUMO-1 או SUMO-2/3, בצע דילול של 1:250 של נוגדן anti-SUMO-1 או נוגדן anti-SUMO-2/3. כדי לזהות ADP-ריבוסילציה, לבצע דילול 1:500 של נוגדן anti-PAR. כדי לזהות סך הכל TOP1-, TOP2α-, או TOP2β-DPCs, בצע דילול של 1:500 של נוגדן anti-TOP1, anti-TOP2α או anti-TOP2β.הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על דילול נוגדנים. יש לדגור על ממברנה שטופה 1x PBS-T (0.1% tween 20) עם נוגדן משני מדולל פי 5,000 בחיץ חוסם למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לפתח את הממברנה עם מגיב chemiluminescence משופר (ECL) ולרכוש תמונה באמצעות מערכת ההדמיה. 4. חריץ של דגימות DNA לא מעוכלות לדלל את דגימת ה- DNA הלא מעוכל של 20 μL ב- 180 μL של מאגר נתרן פוספט (25 mM, pH 6.6). חותכים את קרום הניטרוצלולוז (0.45 מיקרומטר) ומאזנים למשך 5 דקות במאגר נתרן פוספט. להרכיב את מנגנון חריץ חריץ על פי הוראות היצרן ולחבר אותו למערכת ואקום. לשטוף את הבארות עם חיץ פוספט נתרן על ידי החלת ואקום. יש לוודא שאין דליפה של הבארות. עצור את הוואקום וטען 200 μL של DNA לכל דגימה (1 מיקרוגרם). מלא את הבארות הריקות עם 200 μL של חיץ פוספט נתרן. יש למרוח את הוואקום. כאשר כל הבארות ריקות לחלוטין, עצרו את הוואקום, טענו 200 מיקרוליטר של חיץ נתרן פוספט בכל באר, וחזרו על שלב 4.6. אחזר את הממברנה וחסום עם מאגר חוסם 5% למשך 0.5 שעות בטמפרטורת החדר. בדיקה עם נוגדן DNA נגד גדיל כפול (dsDNA) בדילול 1:5,000 לילה ב 4 ° C. יש לשטוף 3x עם 1x PBS-T ולדגור עם 1:5,000 נוגדן משני נגד עכבר הקשור לפרוקסידז חזרת מדולל (HRP). לפתח את הממברנה עם מגיב chemiluminescence משופר (ECL) ולרכוש תמונה באמצעות מערכת ההדמיה. 5. ניתוח דנסיטומטרי באמצעות ImageJ, חשב את היחס בין עוצמת כל רצועה/כתם ביחס לעוצמת חריץ הדנ”א הלא מעוכל ונרמל את היחס לזה של תאים ללא/לפני טיפול תרופתי.

Representative Results

התוצאות המייצגות המוצגות באיור 1 מראות את ההיווצרות והקינטיקה של TOP1-DPCs הנגרמים על ידי תרופות ואת ה-SUMOylation והיוביקוויטילציה שלהם. TOP1 חתך גדיל אחד של דופלקס הדנ”א ויצר מתווך קוולנטי אנזים-דנ”א, המכונה קומפלקס מחשוף TOP1 (TOP1cc). הטיפול בקמפטותצין (CPT), מעכב TOP1, נקשר וייצב את TOP1cc, מה שהוביל להיווצרות TOP1-DPC בעלי תוחלת חיים ארוכה. TOP1-DPCs נצפו מושרים ומגיעים לשיא של 20 דקות לאחר חשיפה ל-CPT. במקביל, TOP1-DPCs שונו על ידי SUMO-2/3, שגם הגיע לשיא 20 דקות לאחר טיפול CPT. מכיוון ש-SUMO-2 ו-SUMO-3 חולקים 95% זהות רצף, הנוגדן אינו מבדיל בין אחד לשני. לאחר 60 דקות, TOP1-DPCs ושינוי SUMO-2/3 שלהם פחתו, מלווה בשיאו של שינוי SUMO-1 שלהם ubiquitylation. לאחר טיפול תרופתי של 60 דקות, רמות השינוי TOP1-DPC SUMO-1 והיוביקוויטילציה החלו לרדת. ביונקים, איזואנזימים TOP2 α ופועלים β על ידי החדרת שבר דו-גדילי DNA, כמו גם על ידי היווצרות קומפלקס קוולנטי אנזים-DNA חולף והפיך (TOP2cc). מעכבי TOP2, כגון etoposide (ETOP), ממירים TOP2cc ל- TOP2-DPCs וגורמים ל- SUMOylation ו- Ubiquitylation שלהם. בדומה לקינטיקה של TOP1-DPCs וה-PTM שלהם, TOP2α ו-β-DPCs ושינוי SUMO-2/3 שלהם הגיעו לשיא תוך 20 דקות, ואז החלו לרדת; בינתיים, השינויים שלהם ב-SUMO-1 וביוביקוויטין הגיעו לשיא של 60 דקות (איור 2). הפינוי של TOP-DPCs הוכח כתוצאה מפירוק פרוטאזומלי, והפינוי של TOP-DPC SUMOylation ו- ubiquitylation נובע ככל הנראה ממחזור על ידי deSUMOylation ו- deubiquitylation, בהתאמה, על ידי האנזימים המתהפכים שלהם. הניסויים באיור 3 בחנו DPCs לא-אנזימטיים הנגרמים על-ידי FA ואת ה-PTM שלהם. נצפה כי ה-DPCs וה-SUMO-2/3, SUMO-1 והיוביקוויטילציה שלהם נוצרו והצטברו באופן תלוי מינון FA. לבסוף, ה-PARylation של TOP1-DPCs זוהה כמותית עם נוגדן anti-PAR באותה שיטה (איור 4). TOP1-DPC PARylation לא היה ניתן לגילוי אלא אם כן נוסף מעכב PARG לתא, דבר המצביע על כך ש- PARylation מתרחש במהירות והוא דינמי מאוד. בהתאם לממצא הקודם, נראה כי עיכוב dePARylation על ידי PARGi צובר TOP1-DPCs, ככל הנראה על ידי חסימת פירוק פרוטאוליטי. איור 1: ניתוחים כמותיים של היווצרות וקינטיקה של TOP1-DPCs וה-SUMOylation וה-ubiquitylation שלהם לאחר טיפול CPT בתאי HEK293. (A) תאי HEK293 טופלו ב-20 מיקרומטר CPT לפרקי זמן שצוינו. ליזטים של תאים נקצרו ועברו בדיקת מכ”ם שונה וכתמים מערביים עם נוגדנים מסומנים. דגימות DNA לא מעוכלות היו חשופות לבדיקת חריצים תוך שימוש בנוגדנים נגד dsDNA כבקרת העמסה. (B) עוצמות הפס כומתו באמצעות תוכנת ImageJ ותוכננו באמצעות תוכנת פריזמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: ניתוחים כמותיים של היווצרות וקינטיקה של TOP2-DPCs וה-SUMOylation וה-ubiquitylation שלהם לאחר טיפול ETOP בתאי HEK293. (A) תאי HEK293 טופלו ב-200 מיקרומטר ETOP לפרקי זמן שצוינו. ליזטים של תאים נקצרו ועברו בדיקת מכ”ם שונה וכתמים מערביים עם נוגדנים מסומנים. דגימות DNA לא מעוכלות היו חשופות לבדיקת חריצים תוך שימוש בנוגדנים נגד dsDNA כבקרת העמסה. (B) עוצמות הפס כומתו באמצעות תוכנת ImageJ ותוכננו באמצעות תוכנת פריזמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: ניתוחים כמותיים של DPCs לא אנזימטיים ושל SUMOylation ו-ubiquitylation שלהם לאחר טיפול FA בתאי HEK293. (A) תאי HEK293 טופלו ב-FA של ריכוזים מצוינים במשך שעתיים. ליזטים של תאים נקצרו ועברו בדיקת מכ”ם שונה וכתמים מערביים עם נוגדנים מסומנים. דגימות DNA לא מעוכלות היו חשופות לבדיקת חריצים תוך שימוש בנוגדנים נגד dsDNA כבקרת העמסה. (B) עוצמות הפס כומתו באמצעות תוכנת ImageJ ותוכננו באמצעות תוכנת פריזמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: ניתוחים כמותיים של TOP1-DPCs וה-PARylation שלהם לאחר טיפול CPT בתאי HEK293. (A) תאי HEK293 טופלו מראש ב-10 מיקרומטר PARGi במשך שעה אחת ולאחר מכן טופלו במשותף עם CPT לפרקי זמן שצוינו. ליזטים של תאים נקצרו ועברו בדיקת מכ”ם שונה וכתמים מערביים עם נוגדנים מסומנים. דגימות DNA לא מעוכלות היו חשופות לבדיקת חריצים תוך שימוש בנוגדנים נגד dsDNA כבקרת העמסה. (B) עוצמות הפס כומתו באמצעות תוכנת ImageJ ותוכננו באמצעות תוכנת פריזמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

השיטה המתוארת מאפשרת מדידה של קישורים אנזימטיים ולא אנזימטיים של DNA-חלבון בתאי יונקים והיא הגישה המתאימה היחידה לחקר היוביקוויטילציה שלהם, SUMOylation ו-ADP-ribosylation. חריץ לאחר בדיקת ICE או מכ”ם מאפשר זיהוי מהיר של DPCs אנזימטיים ספציפיים כגון TOP-DPCs באמצעות הנוגדנים שלהם. עם זאת, אזהרה לשיטה זו היא חוסר יכולתה להפריד חלבונים בעלי משקלים מולקולריים שונים, מה שהופך את זה לבלתי אפשרי לקבוע את הגדלים של DPC מצומד PTM. השיטה המתוארת פותרת את הבעיה על ידי שחרור חלבונים מוצלבים עם נוקלאז מיקרוקוקלי, אשר מפרק את הדנ”א לאוליגונוקלאוטידים עם פוספטים טרמינליים 3′, ובכך מאפשר הפרדה מלאה של החלבונים (מצומדים עם אוליגונוקלאוטידים) על ידי SDS-PAGE. לפיכך, ניתן לדמיין ולכמת מונומרים ופולימרים מסוג DPC ששונו עם יוביקוויטין, SUMO או ADP-ריבוז בגדלים שונים על ידי נוגדנים המכוונים ל-PTM אלה, מה שמאפשר חקירה מפורטת של היווצרותם והקינטיקה שלהם. כדי להבטיח יכולת שחזור ולחשב מובהקות סטטיסטית, נדרשים שכפולים ביולוגיים של הניסויים.

אחת הבעיות הנפוצות ביותר של בדיקה זו היא תפוקת DNA נמוכה לאחר משקעים אתנול. מצד אחד, ניתן להגדיל את תפוקת הדנ”א עם יותר חומר מוצא (תאים). מצד שני, דגירה של תאים עם אתנול בצלחת שטוחה ולא בצינור אפנדורף יכולה לשפר באופן ניכר את הצבירה של מולקולות DNA ובכך להקל על המשקעים שלהם. אותות לא ספציפיים שנצפו בדגימות ללא טיפולים תרופתיים עשויים להצביע על זיהום חלבון לא קוולנטי. אם זה המקרה, ניתן לשקול שטיפת כדורי DNA עם חיץ מלח גבוה כדי להסיר את המזהמים לפני סוניקציה. מומלץ גם לסובב דגימות DNA לאחר סוניקציה ועיכול נוקלאז מיקרוקוקלי ולהשליך כל בלתי מסיס. במקרה של אות גרוע או ללא אות, ניתן לנסות מספר פתרונות אפשריים. ראשית, ניתן להגדיל את כמות ההעמסה של DNA עבור SDS-PAGE ו immunoblotting. כדי להפוך מיני DPC SUMOylated ו ubiquitylated לזיהוי, מומלץ לטעון לפחות 4 מיקרוגרם של DNA על הג’ל. שנית, ניתן להגדיל את ריכוזי התרופות כדי לגרום לרמות גבוהות יותר של DPC וה-PTM הקשורים אליהם. שלישית, מומלץ לדגור על כתמים עם נוגדנים ראשוניים ליום נוסף אם נראה שהלהקות/מריחות חלשות. דגירה של יומיים יכולה להגביר משמעותית את האות ובכך להפחית את השונות הביולוגית מניסויים עצמאיים23. הפשטת קרום לצורך צביעה מחדש גורמת באופן בלתי נמנע לאובדן כמות מסוימת של מיני DPC מצומדים ל-PTM שכבר נמצאים בשפע נמוך. לכן, מומלץ מאוד להפעיל ג’לים נפרדים לזיהוי יוביקוויטין ו-SUMO ולא לבצע בדיקה חוזרת של כתם אחד. בנוסף, יש לשטוף כדורי DNA עם אתנול 75% כדי להסיר את שארית ה- DNAzol המכיל מלח גואנידין לפני המסתו ב- H2O או בכל ממס אחר, אשר גורם אחרת להתגבשות הדגימה לאחר הוספת מאגר העמסה Laemmli.

זרימת העבודה של השיטה המתוארת היא הרבה יותר יעילה בזמן בהשוואה לבדיקת ICE המסורבלת, מכיוון שהיא מסתמכת על משקעי אתנול מהירים במקום על צזיום כלוריד אולטרה-צנטריפוגה הגוזלת זמן רב כדי לבודד DNA גנומי. במחיר, טיהור מבוסס אתנול מביא לכמות נמוכה של מזהמים חלבוניים שהם בדרך כלל זניחים לזיהוי חיסוני. עם זאת, כשמדובר במחקרים אנליטיים, כגון אנליזה פרוטאומית מבוססת ספקטרומטריית מסות או ריצוף הדור הבא הדורשים דיוק ודיוק, צנטריפוגת צפיפות צזיום-כלוריד היא עדיין גישה אמינה יותר לבידוד DNA טהור בשפע רב. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על פרופיל של אתרי שינוי על חלבונים מוצלבים וקביעת סוגי קישור של poly-ubiquitylation ו poly-SUMOylation באמצעות שיטות מבוססות ספקטרומטריית מסה נכונה.

יש לציין כי בדיקה זו מאפשרת זיהוי ואפיון של גורמים המווסתים PTM לתיקון DPC. לדוגמה, שיטות סינון בלתי משוחדות בעלות תפוקה גבוהה (RNA interference ו-CRISPR) הן כלים רבי עוצמה לגילוי ליגאזות יוביקוויטין E3, ליגאזות SUMO E3 וקו-פקטורים הקשורים אליהן המפחיתים ציטוטוקסיות של גורמי DPC. השיטה המתוארת מאפשרת אימות מולקולרי של חלבונים אלה על ידי קביעה אם הם מסייעים לתאים לשרוד השראות DPC על ידי תיקון DPC. מעכבי מולקולות קטנות חדשות המכוונות לחלבונים אלה שזוהו, למשל, על ידי סינון וירטואלי, יכולים גם להיות מאומתים באמצעות פרוטוקול זה. בהתחשב בכך מעכבי topoisomerase הם בין כימותרפיה prescribed ביותר, בדיקה חזקה זו יכולה להיות מפותחת ככלי לפיתוח תרופות סינרגיה עם מעכבי topoisomerase קליני.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המרכז לחקר הסרטן של המכון הלאומי לחקר הסרטןמצוינות במחקר פוסט-דוקטורט.

Materials

10x Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher 70011069
4–20% precast polyacrylamide gel Bio-Rad 4561096
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
AcquaStain (coomassie blue) Bulldog Bio AS001000
anti-dsDNA (mouse monoclonal) Abcam 27156 1: 5,000 dilution is recommended
anti-PAR (mouse monoclonal) R&D systems 4335-MC-100 1: 500 dilution is recommended
anti-SUMO-1(rabbit monoclonal) Cell Signaling Technology 4940 1: 250 dilution is recommended
anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal) Cell Signaling Technology 4971 1: 250 dilution is recommended
anti-TOP1 (mouse monoclonal) BD Biosciences 556597 1: 500 dilution is recommended
anti-TOP2α (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-365799 1: 250 dilution is recommended
anti-TOP2β (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-25330 1: 250 dilution is recommended
anti-ubiquitin (mouse monoclonal) Santa Cruz Biotechnology SC-8017 1: 100 dilution is recommended
Calcium chloride Sigma-Aldrich 499609 Used for micrococcal nuclease digestion
Camptothecin Sigma-Aldrich PHL89593
ChemiDo MP imaging system Bio-Rad 12003154
Disodium phosphate Sigma-Aldrich 5438380100 Used to make sodium phosphate buffer
DNAzol Thermo Fisher 10503027
DTT (dithiothreitol) Thermo Fisher R0861
Dulbecco's modified eagle's medium Sigma-Aldrich 11965084
Ethyl alcohol, 200 proof Sigma-Aldrich E7023
Etoposide Sigma-Aldrich 1268808
Formaldehyde Sigma-Aldrich 47608
Graphpad Prism Software GraphStats Prism 9.0.0
HRP-linked Mouse IgG Cytiva NA931 1: 5,000 dilution is recommended
HRP-linked Rabbit IgG Cytiva NA934 1: 5,000 dilution is recommended
ImageJ Software NIH, USA ImageJ 1.53e
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
Maximum sensitivity ECL substrate Thermo Fisher 34095
Micrococcal nuclease New England BioLabs M0247S
Monosodium phosphate Sigma-Aldrich S3139 Used to make sodium phosphate buffer
NanoDrop 2000 spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000
N-ethylmaleimide Thermo Fisher 23030 DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor
Nitrocellulose membrane, 0.45 µm Bio-Rad 1620115
Non-fat dry milk Bio-Rad 1706404XTU
PDD00017273 Selleckchem S8862 Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
Protease inhibitor cocktail Thermo Fisher 78430
Q700 sonicator Qsonica Q700-110
Ready-to-assemble PVDF transfer kit Bio-Rad 1704274
Slot-blot apparatus Bio-Rad 1706542
Slot-blot filter paper Bio-Rad 1620161
Trans-Blot turbo transfer system Bio-Rad 1704150
Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer Bio-Rad 1610732
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179
Vertical electrophoresis cell Bio-Rad 1658004
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  2. Klages-Mundt, N. L., Li, L. Formation and repair of DNA-protein crosslink damage. Science China. Life Sciences. 60 (10), 1065-1076 (2017).
  3. Weickert, P., Stingele, J. DNA-protein crosslinks and their resolution. Annual Review of Biochemistry. 91, 157-181 (2022).
  4. Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein cross-links: formation, structural identities, and biological outcomes. Accounts of Chemical Research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
  5. Pommier, Y., Nussenzweig, A., Takeda, S., Austin, C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (6), 407-427 (2022).
  6. Pommier, Y., Sun, Y., Huang, S. N., Nitiss, J. L. Roles of eukaryotic topoisomerases in transcription, replication and genomic stability. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 703-721 (2016).
  7. Ruggiano, A., Ramadan, K. DNA-protein crosslink proteases in genome stability. Communications Biology. 4 (1), 11 (2021).
  8. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  9. Moretton, A., Loizou, J. I. Interplay between cellular metabolism and the DNA damage response in cancer. Cancers. 12 (8), 2051 (2020).
  10. Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
  11. Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4564-4576 (2017).
  12. Stingele, J., et al. Mechanism and regulation of DNA-protein crosslink repair by the DNA-dependent metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
  13. Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 orchestrates replication-coupled DNA-protein crosslink repair. Molecular Cell. 64 (4), 704-719 (2016).
  14. Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
  15. Kojima, Y., et al. FAM111A protects replication forks from protein obstacles via its trypsin-like domain. Nature Communications. 11 (1), 1318 (2020).
  16. Dokshin, G. A., et al. GCNA interacts with spartan and topoisomerase II to regulate genome stability. Developmental Cell. 52 (1), 53-68 (2020).
  17. Borgermann, N., et al. SUMOylation promotes protective responses to DNA-protein crosslinks. The EMBO Journal. 38 (8), e101496 (2019).
  18. Sun, Y., Zhang, Y., Schultz, C. W., Pommier, Y., Thomas, A. CDK7 inhibition synergizes with topoisomerase I inhibition in small cell lung cancer cells by inducing ubiquitin-mediated proteolysis of RNA polymerase II. Molecular Cancer Therapeutics. 21 (9), 1430-1438 (2022).
  19. Sun, Y., et al. Requirements for MRN endonuclease processing of topoisomerase II-mediated DNA damage in mammalian cells. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1007064 (2022).
  20. Sun, Y., et al. PARylation prevents the proteasomal degradation of topoisomerase I DNA-protein crosslinks and induces their deubiquitylation. Nature Communications. 12 (1), 5010 (2021).
  21. Sun, Y., et al. Excision repair of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC). DNA Repair. 89, 102837 (2020).
  22. Sun, Y., Saha, L. K., Saha, S., Jo, U., Pommier, Y. Debulking of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC) by the proteasome, non-proteasomal and non-proteolytic pathways. DNA Repair. 94, 102926 (2020).
  23. Sun, Y., et al. A conserved SUMO pathway repairs topoisomerase DNA-protein cross-links by engaging ubiquitin-mediated proteasomal degradation. Science Advances. 6 (46), (2020).
  24. Saha, S., et al. DNA and RNA cleavage complexes and repair pathway for TOP3B RNA- and DNA-protein crosslinks. Cell Reports. 33 (13), 108569 (2020).
  25. Swan, R. L., Cowell, I. G., Austin, C. A. Mechanisms to repair stalled topoisomerase II-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 101 (1), 24-32 (2022).
  26. Swan, R. L., Poh, L. L. K., Cowell, I. G., Austin, C. A. Small molecule inhibitors confirm ubiquitin-dependent removal of TOP2-DNA covalent complexes. Molecular Pharmacology. 98 (3), 222-233 (2020).
  27. Sciascia, N., et al. Suppressing proteasome mediated processing of topoisomerase II DNA-protein complexes preserves genome integrity. eLife. 9, e53447 (2020).
  28. Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 1703, 283-299 (2018).
  29. Subramanian, D., Furbee, C. S., Muller, M. T. ICE bioassay. Isolating in vivo complexes of enzyme to DNA. Methods in Molecular Biology. 95, 137-147 (2001).
  30. Nitiss, J. L., Kiianitsa, K., Sun, Y., Nitiss, K. C., Maizels, N. Topoisomerase assays. Current Protocols. 1 (10), e250 (2021).
  31. Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
  32. Cowell, I. G., Tilby, M. J., Austin, C. A. An overview of the visualisation and quantitation of low and high MW DNA adducts using the trapped in agarose DNA immunostaining (TARDIS) assay. Mutagenesis. 26 (2), 253-260 (2011).
  33. Leng, X., Duxin, J. P. Targeting DNA-protein crosslinks via post-translational modifications. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 944775 (2022).
  34. Kuhbacher, U., Duxin, J. P. How to fix DNA-protein crosslinks. DNA Repair. 94, 102924 (2020).
  35. Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. Mechanisms of DNA-protein crosslink repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 563-573 (2017).
  36. Sun, Y., Nitiss, J. L., Pommier, Y. SUMO: A Swiss army knife for eukaryotic topoisomerases. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 871161 (2022).
  37. Krastev, D. B., et al. The ubiquitin-dependent ATPase p97 removes cytotoxic trapped PARP1 from chromatin. Nature Cell Biology. 24 (1), 62-73 (2022).
  38. Liu, J. C. Y., et al. Mechanism and function of DNA replication-independent DNA-protein crosslink repair via the SUMO-RNF4 pathway. The EMBO Journal. 40 (18), e107413 (2021).
  39. Larsen, N. B., et al. Replication-coupled DNA-protein crosslink repair by SPRTN and the proteasome in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 73 (3), 574-588 (2019).
  40. Zhao, S., et al. A ubiquitin switch controls autocatalytic inactivation of the DNA-protein crosslink repair protease SPRTN. Nucleic Acids Research. 49 (2), 902-915 (2021).
  41. Ruggiano, A., et al. The protease SPRTN and SUMOylation coordinate DNA-protein crosslink repair to prevent genome instability. Cell Reports. 37 (10), 110080 (2021).
  42. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).

Tags

DNA-protein CrosslinksDNA Damage RepairTopoisomerase InhibitorsPARP InhibitorsAldehydesPost-translational ModificationsDeubiquitylationSUMOylationADP-ribosylationIn Vivo Complex Of Enzyme AssayRapid Approach To DNA Adduct Recovery AssayImmunofluorescenceQuantitationKineticsFormation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sun, Y. Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications. J. Vis. Exp. (194), e65315, doi:10.3791/65315 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image