טכניקה משופרת לזיהוי טרימתילאמין ברפואה מן החי על ידי Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry
Summary
כאן מתוארת שיטת ספקטרומטריית מסה מרובעת של גז ראש (HS-GC-MS/MS) המתאימה לקביעת טרימתילאמין (TMA) בתרופות שמקורן מן החי. הפרוטוקול כולל טיפול מקדים לדגימה, טיפול במרחב הראש, תנאי ניתוח, תיקוף מתודולוגי וקביעת TMA בתרופות שמקורן בבעלי חיים.
Abstract
לתרופות מן החי יש מאפיינים ייחודיים והשפעות מרפא משמעותיות, אך לרובן יש ריח דגים ברור, וכתוצאה מכך היענות לקויה של חולים קליניים. טרימתילאמין (TMA) הוא אחד ממרכיבי ריח הדג העיקריים ברפואה מן החי. קשה לזהות TMA במדויק באמצעות שיטת הזיהוי הקיימת בשל הלחץ המוגבר בבקבוקון הראש הנגרם על ידי התגובה החומצית-בסיסית המהירה לאחר הוספת lye, הגורמת ל-TMA לברוח מבקבוקון headspace, מה שמעכב את התקדמות המחקר של ריח הדג של תרופות שמקורן בבעלי חיים. במחקר זה הצענו שיטת זיהוי מבוקרת שהציגה שכבת פרפין כשכבת בידוד בין חומצה לליי. קצב ייצור TMA יכול להיות נשלט ביעילות על ידי הנזלה איטית של שכבת הפרפין באמצעות חימום תנור תרמוסטטי. שיטה זו הראתה ליניאריות משביעת רצון, ניסויים מדויקים והתאוששויות עם יכולת שחזור טובה ורגישות גבוהה. היא סיפקה תמיכה טכנית לנטרול ריחות של תרופות שמקורן בבעלי חיים.
Introduction
טיפול במחלות אנושיות על ידי שימוש במוצרים שמקורם בחלקי בעלי חיים ו / או תוצרי הלוואי שלהם (המכונים כאן תרופות מן החי) זוכה לתשומת לב מוגברת. הם ממלאים תפקיד חשוב בטיפול בסרטן, מחלות לב וכלי דם, שחמת הכבד, דלקת השדים ומחלות אחרות, עם יתרונות של השפעה חזקה, מינון קטן, ויעילות קלינית משמעותית וספציפית. עם זאת, תרופות שמקורן מן החי בדרך כלל יש ריח דגים בולט, אשר משפיע מאוד על ההיענות של החולים, והם שליליים במיוחד עבור ילדים 1,2. ריח הדג מגיע בעיקר מהחלבונים, חומצות האמינו, השומנים וחומרים אחרים הכלולים בתרופה, אשר מפורקים באמצעות חמצון חומצות שומן, פירוק חומצות אמינו ודרכים אחרות לייצר מגוון חומרים בעלי ריח דגים 2,3,4. ביניהם, trimethylamine (TMA) הוא גז נדיף עם ריח דגים כי קיים נרחב מזונות נרקבים או רקובים מן החי5.
עד כה, כרומטוגרפיית גז (GC), כרומטוגרפיה נוזלית (LC), כרומטוגרפיית יונים, ספקטרופוטומטריה, ספקטרומטריית כרומטוגרפיה נוזלית-מסה (LC-MS), ושיטות חיישנים שימשו בדרך כלל לגילוי TMA בסביבה, מזון ושתן 6,7,8,9. לאור הזיהום הנמוך של עמוד ה-GC ומערכת ההזרקה, כמו גם הרגישות הגבוהה, יכולת השחזור ומגבלת הגילוי הנמוכה (0.1-1 מ”ג/ק”ג), שיטת ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה של גז Headspace (HS-GC-MS) הועדפה לניתוח מזון וביולוגי8. נכון לעכשיו, רק סין קבעה תקן לאומי עבור TMA במזון, ו- HS-GC-MS היא השיטה הראשונה בתקן GB5009.179-201610. לכן, שיטת HS-GC-MS הנ”ל נבחרה כדי לזהות TMA ברפואה שמקורה בבעלי חיים. בשלב המוקדם, קבוצת המחקר שלנו מצאה כי תקן זיהוי HS-GC-MS עבור TMA במזון יכול לזהות את ריח הדג במספר תרופות שמקורן בבעלי חיים. בשילוב עם תוצאות המחקרים11,12, ניתן להוכיח כי TMA הוא חומר המפתח הנפוץ של ריח דגים בתרופות מן החי. עם זאת, נמצא כי יכולת השחזור של תוצאות הניסוי הייתה ירודה, והיו בעיות כגון בריחת TMA ויציבות ירודה, שלא ניתן היה לאמת על ידי המתודולוגיה. זה יכול להיות בגלל העובדה שהליי הוזרק לתוך בקבוקון הראש והתגובה החומצית-בסיסית המהירה הובילה ללחץ מוגבר בבקבוקון, וכך TMA ברח מנקבובית ההזרקה, ומנע זיהוי יציב ומדויק של TMA. לכן, מחקר זה הציע שיטה משופרת לזיהוי ספקטרומטריית מסה מרובעת של גז ראש (HS-GC-MS/MS) כדי לטפל בבעיות אלה.
הפרוטוקול משפר את הטיפול המקדים לדגימה על ידי הפרדת מגיבי בסיס חומצה בטיפול המקדים בעזרת פרפין מוצק, חומר טוב לשינוי פאזה מוצק-נוזלי. כאשר הפרפין נוזל באיטיות עם עליית הטמפרטורה של הכבשן התרמוסטטי, TMA שוחרר באיטיות גם בבקבוקון הראש האטום, ובכך נמנע מעליית הלחץ הנגרמת על ידי תגובת בסיס חומצה אלימה ומהירה והבטיח זיהוי TMA יציב ומדויק. יתר על כן, הזרקת headspace בשילוב עם מצבי ניטור תגובה מרובים (MRM) ב- GC-MS/MS דיכאו ביעילות הפרעות כימיות של מטריצה והבטיחו את אמינות התוצאות. תוצאות התיקוף המתודולוגי הוכיחו כי הלינאריות, בדיקת הדיוק וקצב ההתאוששות של שיטת הזיהוי המשופרת יכולים לעמוד בדרישות, עם יכולת שחזור טובה ורגישות גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרופות מן החי מגיעות מכל הגוף, איברים או רקמות, מוצרים פיזיולוגיים או פתולוגיים, הפרשות או הפרשות, ומוצרים מעובדים של בעלי חיים. TMA הוא מקור חשוב לריח דגים בתרופות מן החי; זהו חומר בעל ריח רע טיפוסי עם סף ריח נמוך מאוד (0.000032 × 10-6 V/V) וריח דגים חזק13. כיום, שיטת HS-GC-MS הנפוצה אינה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82173991), ותוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ’ואן (2022YFS0442).
Materials
| Centrifuge | Beckman Coulter Trading (China) Co. | SSC-2-0213 | |
| Chinese herbal medicine grinder | Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory | HX-200K | |
| Convection oven | Sanyo Electric Co., Ltd | MOV-112F | |
| Decapper for 20 mm Aluminum caps | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | V1750004 | |
| Electronic balance | Shimadzu Corporation Japan | AUW220D | |
| Gas chromatography mass spectrometry | Shimadzu Corporation Japan | TQ-8050 NX | |
| Headspace Vial | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | 25760200 | |
| Homogenizer | Shanghai biaomo Factory | FJ200-SH | |
| Preassembled Cap | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | L4150050 | |
| Sample sieve | Zhenxing Sieve Factory | / | |
| SH-Volatile Amine | Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd | 227-3626-01 | |
| Sodium hydroxide | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022101401 | |
| Solid paraffin wax | Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory | 20221112 | |
| Trichloroacetic acid | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022102001 | |
| Trimethylamine hydrochloride | Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd | AF22022108 | |
| Ultra-pure water system | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd | UPR-11-5T |
References
- Fan, H., et al. Material basis of stench of animal medicine: a review. China Journal of Chinese Materia Medica. 47 (20), 5452-5459 (2022).
- Deng, Y. J., et al. Progress on formation and taste-masking technology of stench of animal medicines. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (10), 2353-2359 (2020).
- Casaburi, A., Piombino, P., Nychas, G. J., Villani, F., Ercolini, D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiology. 45 (Pt A), 83-102 (2015).
- Rouger, A., Tresse, O., Zagorec, M. Bacterial contaminants of poultry meat: sources, species, and dynamics. Microorganisms. 5 (3), 50 (2017).
- Baliño-Zuazo, L., Barranco, A. A novel liquid chromatography-mass spectrometric method for the simultaneous determination of trimethylamine, dimethylamine and methylamine in fishery products. Food Chemistry. 196, 1207-1214 (2016).
- Zhao, C., et al. Ultra-efficient trimethylamine gas sensor based on Au nanoparticles sensitized WO3 nanosheets for rapid assessment of seafood freshness. Food Chemistry. 392, 133318 (2022).
- Bota, G. M., Harrington, P. B. Direct detection of trimethylamine in meat food products using ion mobility spectrometry. Talanta. 68 (3), 629-635 (2006).
- Neyer, P., Bernasconi, L., Fuchs, J. A., Allenspach, M. D., Steuer, C. Derivatization-free determination of short-chain volatile amines in human plasma and urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (2), e23062 (2020).
- Mitsubayashi, K., et al. Trimethylamine biosensor with flavin-containing monooxygenase type 3 (FMO3) for fish-freshness analysis. Sensors & Actuators B: Chemical. 103 (1-2), 463-467 (2004).
- National Health and Family Planning Commission of the People’s Republic of China. . GB 5009. 179-2016. , 12 (2016).
- Liu, X. M., et al. Study on material basis and processing principle of fishy smell of Pheretima aspergillum by electronic nose and HS-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 26 (12), 154-161 (2020).
- Zheng, X., Sun, F., Du, L., Huang, Y., Zhang, Z. Comparison on changes of volatile components in Gecko before and after processing by HS-SPME-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 28 (15), 145-152 (2022).
- Yoshiharu, I. . Odor olfactory measurement. , (2004).
- Jia, Z. W., Mao, B. P., Miao, S., Mao, X. H., Ji, S. Determination of sulfur dioxide residues in sulfur fumigated Chinese herbs with headspace gas chromatography. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (2), 277-281 (2014).
