Headspace Gaz Kromatografisi-Tandem Dört Kutuplu Kütle Spektrometrisi ile Hayvan Kaynaklı Tıpta Trimetilamin Tayini için Geliştirilmiş Bir Teknik
Summary
Burada, hayvansal kaynaklı ilaçlarda trimetilamin (TMA) tayini için uygun bir headspace gaz kromatografisi-tandem dört kutuplu kütle spektrometrisi (HS-GC-MS/MS) yöntemi açıklanmaktadır. Protokol, numune ön işlemini, üst boşluk tedavisini, analiz koşullarını, metodolojik doğrulamayı ve hayvansal kaynaklı ilaçlarda TMA’nın belirlenmesini içerir.
Abstract
Hayvansal kaynaklı ilaçların ayırt edici özellikleri ve önemli iyileştirici etkileri vardır, ancak çoğunun belirgin bir balık kokusu vardır ve bu da klinik hastaların zayıf uyumuna neden olur. Trimetilamin (TMA), hayvansal kaynaklı tıptaki en önemli balık kokusu bileşenlerinden biridir. Kostik ilavesinden sonra hızlı asit-baz reaksiyonunun neden olduğu üst boşluk şişesindeki artan basınç nedeniyle mevcut tespit yöntemini kullanarak TMA’yı doğru bir şekilde tanımlamak zordur, bu da TMA’nın üst boşluk şişesinden kaçmasına neden olur ve hayvansal kaynaklı ilaçların balık kokusunun araştırma ilerlemesini durdurur. Bu çalışmada, asit ve kostik arasında bir izolasyon tabakası olarak bir parafin tabakası ekleyen kontrollü bir tespit yöntemi önerdik. TMA üretim hızı, parafin tabakasının termostatik fırın ısıtması yoluyla yavaşça sıvılaştırılmasıyla etkin bir şekilde kontrol edilebilir. Bu yöntem, iyi tekrarlanabilirlik ve yüksek hassasiyet ile tatmin edici doğrusallık, hassas deneyler ve geri kazanımlar gösterdi. Hayvansal kaynaklı ilaçların koku giderme konusunda teknik destek sağladı.
Introduction
Hayvan parçalarından ve/veya bunların yan ürünlerinden (burada hayvansal kaynaklı ilaçlar olarak anılacaktır) elde edilen ürünleri kullanarak insan hastalıklarının tedavisi giderek daha fazla ilgi görmektedir. Kanser, kardiyovasküler hastalık, karaciğer sirozu, mastitis ve diğer hastalıkların tedavisinde güçlü bir etki, küçük dozaj ve önemli ve spesifik klinik etkinlik avantajları ile önemli bir rol oynarlar. Bununla birlikte, hayvansal kaynaklı ilaçlar genellikle belirgin bir balık kokusuna sahiptir, bu da hastaların uyumunu büyük ölçüde etkiler ve özellikle çocuklar için elverişsizdir 1,2. Balık kokusu esas olarak, yağ asidi oksidasyonu, amino asit bozunması ve balık kokusu 2,3,4 ile çeşitli maddeler üretmenin diğer yolları yoluyla ayrışan ilaçta bulunan proteinlerden, amino asitlerden, yağlardan ve diğer maddelerden gelir. Bunlar arasında trimetilamin (TMA), çürüyen veya çürümüş hayvansal kaynaklı gıdalarda yaygın olarak bulunan balık kokusuna sahip uçucu bir gazdır5.
Şimdiye kadar, gaz kromatografisi (GC), sıvı kromatografisi (LC), iyon kromatografisi, spektrofotometri, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC-MS) ve sensör yöntemleri, ortamda, yiyeceklerde ve idrarda TMA’yı tespit etmek için yaygın olarak kullanılmıştır 6,7,8,9. GC kolonu ve enjeksiyon sisteminin düşük kontaminasyonunun yanı sıra yüksek hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve düşük tespit limiti (0.1-1 mg/kg) göz önüne alındığında, gıda ve biyolojik analizler için tepe boşluğu gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (HS-GC-MS) yöntemi tercih edilmiştir8. Şu anda, yalnızca Çin gıdada TMA için ulusal bir standart oluşturmuştur ve HS-GC-MS, GB5009.179-2016 standardı10’daki ilk yöntemdir. Bu nedenle, hayvansal kaynaklı tıpta TMA’yı tespit etmek için yukarıdaki HS-GC-MS yöntemi seçilmiştir. Erken aşamada, araştırma grubumuz, gıdalardaki TMA için HS-GC-MS tespit standardının çeşitli hayvan kaynaklı ilaçlardaki balık kokusunu tespit edebildiğini buldu. Çalışmaların sonuçları11,12 ile birleştiğinde, TMA’nın hayvansal kaynaklı ilaçlarda balık kokusunun ortak anahtar maddesi olduğu kanıtlanabilir. Bununla birlikte, deneysel sonuçların tekrarlanabilirliğinin zayıf olduğu ve metodoloji ile doğrulanamayan TMA kaçışı ve zayıf stabilite gibi problemlerin olduğu bulunmuştur. Bunun nedeni, kostiğin üst boşluk şişesine enjekte edilmesi ve hızlı asit-baz reaksiyonunun şişede artan basınca yol açması olabilir, böylece TMA enjeksiyon gözeneğinden kaçarak TMA’nın kararlı ve doğru bir şekilde tespit edilmesini engelleyebilir. Bu nedenle, bu çalışma, bu sorunları ele almak için geliştirilmiş bir üst boşluk gaz kromatografisi-tandem dört kutuplu kütle spektrometrisi (HS-GC-MS/MS) algılama yöntemi önermiştir.
Protokol, iyi bir katı-sıvı faz değişim malzemesi olan katı parafin yardımıyla ön işlemdeki asit-baz reaktanları ayırarak numune ön işlemini iyileştirir. Parafin, termostatik fırının sıcaklık artışıyla yavaşça sıvılaştırıldıkça, şiddetli ve hızlı asit-baz reaksiyonunun neden olduğu basınç artışını önleyerek ve kararlı ve doğru TMA tespiti sağlayarak, kapalı üst boşluk şişesinde TMA da yavaşça salındı. Ayrıca, GC-MS/MS’de çoklu reaksiyon izleme (MRM) modlarıyla birleştirilmiş üst boşluk enjeksiyonu, matris kimyasal girişimini etkili bir şekilde bastırdı ve sonuçların güvenilirliğini sağladı. Metodolojik doğrulamanın sonuçları, geliştirilmiş algılama yönteminin doğrusallığının, hassasiyet testinin ve geri kazanım hızının, iyi tekrarlanabilirlik ve yüksek hassasiyetle gereksinimleri karşılayabileceğini kanıtladı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hayvansal kaynaklı ilaçlar tüm vücuttan, organ veya dokulardan, fizyolojik veya patolojik ürünlerden, dışkılardan veya salgılardan ve hayvanların işlenmiş ürünlerinden gelir. TMA, hayvansal kaynaklı ilaçlarda önemli bir balık kokusu kaynağıdır; çok düşük koku alma eşiği (0.000032 × 10-6 V/V) ve güçlü balık kokusu13 olan tipik bir kötü kokulu maddedir. Şu anda, yaygın olarak kullanılan HS-GC-MS yöntemi, hayvansal kaynaklı ilaçlarda TMA’yı stabil …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82173991) ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (2022YFS0442) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| Centrifuge | Beckman Coulter Trading (China) Co. | SSC-2-0213 | |
| Chinese herbal medicine grinder | Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory | HX-200K | |
| Convection oven | Sanyo Electric Co., Ltd | MOV-112F | |
| Decapper for 20 mm Aluminum caps | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | V1750004 | |
| Electronic balance | Shimadzu Corporation Japan | AUW220D | |
| Gas chromatography mass spectrometry | Shimadzu Corporation Japan | TQ-8050 NX | |
| Headspace Vial | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | 25760200 | |
| Homogenizer | Shanghai biaomo Factory | FJ200-SH | |
| Preassembled Cap | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | L4150050 | |
| Sample sieve | Zhenxing Sieve Factory | / | |
| SH-Volatile Amine | Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd | 227-3626-01 | |
| Sodium hydroxide | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022101401 | |
| Solid paraffin wax | Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory | 20221112 | |
| Trichloroacetic acid | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022102001 | |
| Trimethylamine hydrochloride | Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd | AF22022108 | |
| Ultra-pure water system | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd | UPR-11-5T |
References
- Fan, H., et al. Material basis of stench of animal medicine: a review. China Journal of Chinese Materia Medica. 47 (20), 5452-5459 (2022).
- Deng, Y. J., et al. Progress on formation and taste-masking technology of stench of animal medicines. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (10), 2353-2359 (2020).
- Casaburi, A., Piombino, P., Nychas, G. J., Villani, F., Ercolini, D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiology. 45 (Pt A), 83-102 (2015).
- Rouger, A., Tresse, O., Zagorec, M. Bacterial contaminants of poultry meat: sources, species, and dynamics. Microorganisms. 5 (3), 50 (2017).
- Baliño-Zuazo, L., Barranco, A. A novel liquid chromatography-mass spectrometric method for the simultaneous determination of trimethylamine, dimethylamine and methylamine in fishery products. Food Chemistry. 196, 1207-1214 (2016).
- Zhao, C., et al. Ultra-efficient trimethylamine gas sensor based on Au nanoparticles sensitized WO3 nanosheets for rapid assessment of seafood freshness. Food Chemistry. 392, 133318 (2022).
- Bota, G. M., Harrington, P. B. Direct detection of trimethylamine in meat food products using ion mobility spectrometry. Talanta. 68 (3), 629-635 (2006).
- Neyer, P., Bernasconi, L., Fuchs, J. A., Allenspach, M. D., Steuer, C. Derivatization-free determination of short-chain volatile amines in human plasma and urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (2), e23062 (2020).
- Mitsubayashi, K., et al. Trimethylamine biosensor with flavin-containing monooxygenase type 3 (FMO3) for fish-freshness analysis. Sensors & Actuators B: Chemical. 103 (1-2), 463-467 (2004).
- National Health and Family Planning Commission of the People’s Republic of China. . GB 5009. 179-2016. , 12 (2016).
- Liu, X. M., et al. Study on material basis and processing principle of fishy smell of Pheretima aspergillum by electronic nose and HS-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 26 (12), 154-161 (2020).
- Zheng, X., Sun, F., Du, L., Huang, Y., Zhang, Z. Comparison on changes of volatile components in Gecko before and after processing by HS-SPME-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 28 (15), 145-152 (2022).
- Yoshiharu, I. . Odor olfactory measurement. , (2004).
- Jia, Z. W., Mao, B. P., Miao, S., Mao, X. H., Ji, S. Determination of sulfur dioxide residues in sulfur fumigated Chinese herbs with headspace gas chromatography. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (2), 277-281 (2014).
