ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内の トリコデルマ・ストロマティカム 分生子の生存率アッセイ

トリコデルマ属(目:Hypocreales、科:Hypocreaceae)は、他の真菌種の寄生虫であり、商業的に有用な酵素の範囲を生産することができる遍在する腐生菌で構成されています¹。これらの真菌種は、異種タンパク質の生産^2、セルロース³、エタノール、ビール、ワイン、紙の生産⁴、繊維産業⁵、食品産業⁶、農業の生物的防除剤^7,8として使用されています。これらの真菌種に対する産業上の関心に加えて、ヒトにおける感染数の増加により、一部のトリコデルマ種は日和見病原体の地位を得ています⁹。

Trichoderma spp.は培養で急速に成長し、最初は白と綿のコロニーが緑がかった黄色から濃い緑色に変わります¹⁰。それらは広範囲のpHおよび温度条件で生息するように適応しており、日和見種は生理学的pHおよび温度で生き残ることができるため、さまざまなヒト組織にコロニーを形成します11,12,13。重要なことは、トリコデルマ属菌の感染率の上昇は病原性因子と関連している可能性があり、これらは十分に研究されていないことです。さらに、日和見トリコデルマ種に対する免疫応答の理解に焦点を当てた研究はまだまれです。

感染中、好中球とともに、マクロファージは食作用の原因となる防御線を表し、したがって、異なる組織における病原体の増殖およびコロニー形成を防止する。Toll様受容体やC型レクチン受容体などのパターン認識受容体を用いて、マクロファージは貪食菌をファゴリソソームに加工し、呼吸バースト、炎症誘発性サイトカインの放出、および食作用微生物の破壊を促進する¹⁴。しかし、食作用のメカニズムは、真菌細胞のサイズや形状など、さまざまな微生物戦略の影響を受け、回避される可能性があります。食作用を妨げるカプセルの存在。食作用誘導受容体の数を減少させる。細胞質におけるアクチン線維の構造のリモデリング。仮足の形成を妨げる。ファゴソームまたはファゴリソソームは、食作用プロセス後に脱出する¹⁴。

クリプトコッカス・ネオフォルマンスを含む多くの病原体は、マクロファージをニッチとして利用し、宿主内で生存し、播種し、感染を誘発する¹⁵。食作用およびクリアランスアッセイは、病原体に対する免疫応答を評価し、自然免疫系を回避するために採用された微生物戦略を特定するために使用されます15,16,17。この種の手法は、真菌の殺傷を減少させる食作用、ファゴソームの酸性化の遅延、および酸化的バーストの動態の違いを調べるためにも使用できます¹⁸。

貪食、真菌の生存、およびファゴソーム成熟過程の回避を評価するために、さまざまな方法を使用することができる。これらには、貪食、細胞位置、および食作用中に生成される分子を観察するために使用される蛍光顕微鏡法が含まれます¹⁹。フローサイトメトリーは、食作用に関する定量的データを提供し、プロセスに関与するさまざまなマーカーを評価するために使用されます^20,21。生体内顕微鏡検査は、微生物の捕捉とファゴソームの成熟を評価するために使用されます²²。病原体の食作用過程の特異性を評価するために使用される抗体媒介性食作用²³;その他24,25,26,27。

ここに示されるプロトコルは真菌の分生子の食作用そして殺害を評価するのに光学顕微鏡および版の成長の試金を使用して共通の、安価、および直接方法を採用する。このプロトコルは、T. stromaticumに曝露されたヒト末梢血単核由来マクロファージを使用して食作用およびクリアランスアッセイを行うためのステップバイステップの指示を読者に提供します。PBMCが使用されたのは、トリコデルマ分生子が植物病原体に対する生物防除および植物作物のバイオ肥料として世界中で適用されており、トリコデルモ症と呼ばれるいくつかのヒト感染症を引き起こしているためです。それ以外に、トリコデルマ分生子とヒトの免疫系との相互作用に焦点を当てた先行研究は2つしかなく、マクロファージの好中球²⁸とオートファジー29を調べました。本稿では、まずPBMC由来のマクロファージによるT. stromaticumの分生子の貪食を研究し、次に、巻き込まれた分生子の生存率を簡単な顕微鏡ベースの技術を用いて評価する方法を示します。このプロトコルは、マクロファージ関連の免疫応答または免疫系の調節関連メカニズムの研究をさらに促進する可能性があります。