Viabilitätstest von Trichoderma stromaticum-Konidien in mononuklear gewonnenen Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes
Summary
Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Der Zweck dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Bewertung der Phagozytose- und Clearance-Fähigkeiten von mononuklearen Makrophagen aus humanem peripherem Blut vorzustellen, die mit Trichoderma stromaticum conidia stimuliert wurden.
Abstract
Makrophagen stellen eine entscheidende Verteidigungslinie dar und sind dafür verantwortlich, das Wachstum und die Besiedlung von Krankheitserregern in verschiedenen Geweben zu verhindern. Die konidiale Phagozytose ist ein Schlüsselprozess, der die Untersuchung der zytoplasmatischen und molekularen Ereignisse ermöglicht, die an Makrophagen-Pathogen-Interaktionen beteiligt sind, sowie die Bestimmung des Todeszeitpunkts von internalisierten Konidien. Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Die Evasion der Phagozytose und die Flucht der Phagosomen sind Mechanismen der Pilzvirulenz. Hier berichten wir über die Methoden, die für die Analyse der Phagozytose, der Clearance und der Lebensfähigkeit von T. stromaticum conidia verwendet werden können, einem Pilz, der als biologisches Schädlingsbekämpfungs- und Biodüngemittel verwendet wird und in der Lage ist, menschliche Infektionen zu induzieren. Das Protokoll besteht aus 1) Trichoderma-Kultur, 2) Waschen zur Gewinnung von Konidien, 3) der Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung der Polysaccharose-Lösungsmethode und der Differenzierung der PBMCs in Makrophagen, 4) einer In-vitro-Phagozytose-Methode unter Verwendung runder Glasdeckgläser und Färbung und 5) einem Clearance-Assay zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Konidien nach Konidienphagozytose. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Techniken verwendet werden können, um die Effizienz der Pilzbeseitigung von Makrophagen zu messen.
Introduction
Die Gattung Trichoderma (Ordnung: Hypocreales, Familie: Hypocreaceae) besteht aus ubiquitären, saprophytischen Pilzen, die Parasiten anderer Pilzarten sind und in der Lage sind, eine Reihe kommerziell nützlicher Enzyme zu produzieren1. Diese Pilzarten werden für die Herstellung von heterologen Proteinen2, die Herstellung von Zellulose3, Ethanol, Bier, Wein und Papier4, in der Textilindustrie5, der Lebensmittelindustrie6 und in der Landwirtschaft als biologische Schädlingsbekämpfungsmittel 7,8 verwendet. Neben dem industriellen Interesse an diesen Pilzarten hat die steigende Zahl von Infektionen beim Menschen einigen Trichoderma-Arten den Status opportunistischer Krankheitserreger verliehen9.
Trichoderma spp. wächst schnell in der Kultur, mit anfänglich weißen und watteartigen Kolonien, die sich grünlich-gelb bis dunkelgrün verfärben10. Sie sind an ein breites Spektrum von pH- und Temperaturbedingungen angepasst, und die opportunistischen Arten sind in der Lage, bei physiologischem pH-Wert und Temperaturen zu überleben und so verschiedene menschliche Gewebe zu besiedeln 11,12,13. Wichtig ist, dass der Anstieg der Infektionsrate von Trichoderma spp. mit Virulenzfaktoren in Verbindung gebracht werden kann, und diese sind nicht gut untersucht. Darüber hinaus sind Studien, die sich auf das Verständnis der Immunantwort gegen opportunistische Trichoderma-Arten konzentrieren, noch selten.
Während einer Infektion stellen Makrophagen zusammen mit Neutrophilen die Verteidigungslinie dar, die für die Phagozytose verantwortlich ist, und verhindern so das Wachstum und die Besiedlung von Krankheitserregern in verschiedenen Geweben. Mit Hilfe von Mustererkennungsrezeptoren, wie z. B. Toll-like-Rezeptoren und C-Typ-Lektinrezeptoren, phagozytieren Makrophagen Pilze und verarbeiten sie zu Phagolysosomen, wodurch ein Atemausbruch, die Freisetzung entzündungsfördernder Zytokine und die Zerstörung der phagozytozytierten Mikroorganismen gefördert werden14. Der Mechanismus der Phagozytose kann jedoch durch verschiedene mikrobielle Strategien, wie z. B. die Größe und Form der Pilzzellen, beeinflusst und umgangen werden. das Vorhandensein von Kapseln, die die Phagozytose behindern; Verringerung der Anzahl der Phagozytose-induzierenden Rezeptoren; der Umbau der Struktur der Aktinfasern im Zytoplasma; Behinderung der Bildung von Pseudopodien; und Phagosom oder Phagolysosom entweichen nach dem Phagozytoseprozess14.
Viele Krankheitserreger, darunter Cryptococcus neoformans, nutzen Makrophagen als Nische, um im Wirt zu überleben, sich zu verbreiten und Infektionen zu induzieren15. Der Phagozytose- und Clearance-Assay wird verwendet, um die Immunantwort gegen Krankheitserreger zu bewerten und die mikrobiellen Strategien zu identifizieren, die eingesetzt werden, um das angeborene Immunsystem zu umgehen 15,16,17. Diese Art von Technik kann auch verwendet werden, um die differentielle Kinetik von Phagozytose, verzögerter Phagosomenversauerung und oxidativem Ausbruch zu untersuchen, die zu einer reduzierten Pilzabtötung führen18.
Verschiedene Methoden können verwendet werden, um die Phagozytose, das Überleben der Pilze und die Umgehung des Phagosomenreifungsprozesses zu bewerten. Dazu gehören die Fluoreszenzmikroskopie, mit der die Phagozytose, die zelluläre Lage und die während der Phagozytose produzierten Moleküle beobachtetwerden 19; Durchflusszytometrie, die quantitative Daten zur Phagozytose liefert und zur Bewertung der verschiedenen am Prozess beteiligten Marker verwendet wird20,21; intravitale Mikroskopie, die zur Beurteilung des mikrobiellen Einfangs und der Phagosomenreifung verwendet wird22; Antikörper-vermittelte Phagozytose, die verwendet wird, um die Spezifität des Phagozytoseprozesses für einen Krankheitserreger zu beurteilen23; und andere 24,25,26,27.
Das hier vorgestellte Protokoll verwendet eine gängige, kostengünstige und direkte Methode, bei der ein optisches Mikroskop und ein Plattenwachstumsassay verwendet werden, um die Phagozytose und Abtötung von Pilzkonidien zu beurteilen. Dieses Protokoll bietet den Lesern Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung des Phagozytose- und Clearance-Assays mit mononuklearen Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut, die T. stromaticum ausgesetzt sind. PBMCs wurden verwendet, weil Trichoderma-Konidien als biologischer Schädlingsbekämpfungsmittel gegen Phytopathogene und als Biodünger für Pflanzenkulturen weltweit eingesetzt werden und mehrere Infektionen beim Menschen verursacht haben, die als Trichodermose bezeichnet werden. Darüber hinaus gibt es bisher nur zwei Arbeiten, die sich mit der Interaktion zwischen Trichoderma conidia und dem menschlichen Immunsystem befassen, in denen wir Neutrophile28 und Autophagie in Makrophagen29 untersucht haben. Dieser Artikel zeigt zunächst, wie die Phagozytose der Konidien von T. stromaticum durch PBMC-abgeleitete Makrophagen untersucht werden kann, und dann, wie die Lebensfähigkeit der verschlungenen Konidien mit einfachen mikroskopiebasierten Techniken beurteilt werden kann. Dieses Protokoll kann Untersuchungen zur Makrophagen-assoziierten Immunantwort oder zu Mechanismen im Zusammenhang mit der Modulation des Immunsystems weiter erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für verschiedene pilzliche Krankheitserreger, darunter Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans und andere, ist die Konidial- oder Hefephagozytose ein Schlüsselprozess, der die Untersuchung der zytoplasmatischen und molekularen Ereignisse in Makrophagen-Erreger-Interaktionen sowie die Bestimmung des Todeszeitpunkts der internalisierten Konidien ermöglicht 14,39,40. Die Phagozytose ist d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von folgenden brasilianischen Finanzierungsinstitutionen unterstützt: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) mit Zuschüssen RED0011/2012 und RED008/2014. U.R.S., J.O.C. und M.E.S.M. erkennen das Stipendium der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) bzw. der FAPESB an.
Materials
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | CLS431470 | 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile |
| 24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate | Kasvi | K12-024 | Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation; |
| Cell culture CO2 incubator | Sanyo | 303082 | A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types. |
| Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL | Capp | 5101500 | Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens |
| Circular coverslip 15 mm | Olen | K5-0015 | Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm |
| Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets | Esco Lifesciences group | 2010274 | Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface. |
| Dextrose Potato Agar medium | Merck | 145 | Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi |
| EDTA vacuum blood collection tube | FirstLab | FL5-1109L | EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology. |
| Entellan | Merck | 1.07961 | Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A2720801 | Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells. |
| Flaticon | database of images | ||
| Glycerol | Merck | 24900988 | The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores |
| Histopaque-1077 | polysucrose solution | ||
| Image J | Image analysis software | ||
| Microscopy slides | Precision | 7105 | Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections |
| Mini centrifuge | Prism | C1801 | The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time. |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0011 | The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles. |
| Panoptic fast | Laborclin | 620529 | Laborclin's panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology |
| Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U | LGC- Biotechnology | BR3011001 | antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow. |
| Petri dish 90 x 15 mm Smooth | Cralplast | 18248 | Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | thermo fisher Scientific | 10010001 | PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells. |
| Pipette Pasteur 3 mL Sterile | Accumax | AP-3-B-S | STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile |
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | TS-HM16R | The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g. |
| RPMI-1640 Medium | Merck | MFCD00217820 | HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| The single channel micropipettes | Eppendorf | Z683809 | Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids. |
| Tip for Micropipettor | Corning | 4894 | Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable |
| Triocular inverted microscope | LABOMED | VU-7125500 | It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems. |
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